金黄色葡萄球菌基因组DNA提取方法的比较研究Word格式文档下载.docx

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取300斗l菌悬液,离心,沉淀加入含10%蔗糖的TE缓冲液400一,然后加20mg/ml的溶菌酶20一,37。

C,作用45min,再加入30txl,10%SDS和3山,10mg/ml蛋白酶K,55。

C水浴1h;

加入0.1倍体积的3moVLNaAc和2倍体积的冰的无水乙醇混匀,一20℃静置30min,离心去上清,沉淀用75%的乙醇洗涤,干燥,沉淀溶于50止双蒸水中,于一20℃保存。

方法3¨

“:

取300¨

1菌悬液,离心,沉淀加500Ixl丙酮,混匀,冰浴5min,离心,弃上清,沉淀加入TE缓冲液210出,20m#ml溶菌酶40斗l,37℃作用2h,再加入10%SDS20山,放置5min,煮沸5min,再加入TE150山、饱和酚200一、氯仿:

异戊醇（24:

1200“l,充分振荡混匀,离心,吸取上清,加人等体积的氯仿/异戊醇（24:

加入0.1倍体积3moL/LNaAc和2倍体积的冰无水乙醇,置一20。

C,30min,离心去上清,沉淀用75%的乙醇洗涤,干燥,沉淀溶于50m双蒸水中,于一20℃保存。

方法4¨

5’“o（改进:

取300斗l菌悬液,离心,沉淀加入1止70%乙醇混匀后,0。

C,静置20min处理后,离心,收集菌体,加入TE缓冲液共467山,20mg/ml溶菌酶12“l和1一RNase（1mg/m1,0。

C1h,并间隔摇晃几次,取出放置一20℃,20min,立即放入68℃水浴10min,加入10%SDS53山,680C水浴15min,取出加入5m0L/LNaCl87斗l,CTAB/NaCl（1%CTAB,0.73moL/LNaCl69以68℃水浴15rain,一20℃置30min,取出加入等体积的氯仿/异戊醇（24:

重复上述步骤一次,加入等体积的氯仿/异戊醇（24:

最后用2倍体积的冰的无水乙醇混匀,一20℃静置30min,离心去上清,沉淀用70%的乙醇洗涤,干燥,沉淀溶于50山双蒸水中,于一20℃保存。

1.5金黄色葡萄球菌分离菌株、李斯特氏杆菌DNA提取

采用上述4种方法进行,各种不同方法所用菌量相同,并进行3次以上平行提取。

1.6DNA得率和质量检测

DNA定量:

通过紫外260nm处吸光值计算,各方法提取DNA按1:

100稀释,测260nm和280nm吸光值,DNA质量检测通过凝胶电泳、EB染色后紫外检测比较¨

1。

1.7PCR驴增

应用金黄色葡萄球菌16SrRNA的保守序列设计一对引物（理论扩增长度565bp来评价所提取的DNA,引物序列:

上游引物一5’一GTGCACATCTrGACGGTACC一3’,下游引物一5’一CGAAGGGGAAGGCTCTATC一37。

PCR扩增条件:

95℃,5min,95。

C30S,44℃30S,72。

C30S,35个循环,72。

C,延伸8min。

扩增产物4¨

l进行电脉,EB染色,紫外观察,比较电泳图象。

2结果

2.14种不同方法提取的DNA结果与分析

通过多次平行实验表明方法1、2和4提取纯度较高,A260/280的值在1.8—2.1之间,方法3和4提取得率较高,但方法3纯度偏低,从图l可以看出,方法3DNA降解较多,其余3种方法DNA几乎没有降解,纯度较高。

综合考虑纯度和得率,选择方法4为最佳提取方法（见表l和图1。

表14种不同方法提取DNA得率的比较

图14种不同方法提取DNA凝胶电泳图

泳道M为DNAMarker,1、2、3为方法2提取,4、5、

6为方法4提取,7、8、9为方法3提取,10、11、

12为方法1提取,分别按菌株s6、S2和26111顺序上样

2.2应用方法4分别提取三株金黄色葡萄球茵分离菌株、单

核细胞增生李斯特菌DNA

结果见图2。

图2应用方法4提取三株金黄色葡萄球菌分离菌株、

单核细胞增生李斯特菌DNA凝胶电泳图

A:

三株金黄色葡萄球菌分离菌株的DNA;

B:

单核细胞增生李斯特菌的DNA

中国卫生检验杂志2008年8月第18卷第8期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,Aug2008;

2.3PCR扩增结果

应用设计的16SrRNA引物对方法4提取的6株不同金黄

色葡萄球菌进行PCR扩增,每种菌株都出现了很亮的条带（见

图3,表明方法4提取的DNA可以用于分子生物学方面研

究。

图3方法4提取六株不同金黄色葡萄球菌PCR扩增结果

3讨论

（1对病原微生物来说,为了提取相对完整和纯的基因组

DNA,首先要理解病原细菌的分子特征、生理学和流行病学等

特点。

金黄色葡萄球菌为革兰阳性细菌,细胞壁较厚,葡萄球

菌蛋白A是它细胞壁最主要的一种蛋白质,90%以上金黄色

葡萄球菌都含有此蛋白,与细胞壁中的肽聚糖以共价交联形

式形成致密结构,不同菌株之间含量有明显的差别,所以不同

菌株的破壁难易程度也不一样。

（2细菌DNA的提取通常采用化学方法,提取DNA时主

要依赖溶菌酶并结合其它裂解脂类和蛋白质的酶,但是,金黄色

葡萄球菌对溶菌酶具有抗性m1,与分枝结核杆菌和化脓性链球

菌一样对溶菌酶不敏感,因为它们都具有复杂的细胞壁。

方法

4在DNA提取之前应用了70%乙醇处理细菌细胞¨

5’”J,70%乙

醇处理另一个作用是增加后来细胞对裂解液的敏感性,经过乙

醇处理后的细胞,再用溶菌酶处理可被很好地消化。

实验表明,

经70%乙醇处理后提取的DNA质量更高、更好。

（3本研究参考不同文献报道方法对金黄色葡萄球菌

DNA提取得率和质量进行比较,并对方法4进行了部分改

进¨

“,使得提取的程序更为简洁,方便,方法3虽然提取得率

最高,但DNA降解较多,降解的主要原因是1000C进行5min

煮沸。

方法4是一个适合较宽范围的病原细菌基因组DNA提

取方法,采用16SrRNA的通用引物对所提取的DNA进行PCR

扩增验证,证实了方法4提取的DNA对PCR扩增无任何抑制

作用,适用于其它分子生物学基本操作,方法4同样也适用于

单增李斯特氏杆菌DNA的提取。

综上所述,本研究为金黄色葡萄球菌高纯度DNA的提取

找出了一种最好的方法,从而为金黄色葡萄球菌和其它病原

菌基因操作和快速检测技术打下基础,有利于实验室快速分

子诊断和流行病学的调查研究。

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（收稿日期:

2008—03—31