pET载体.docx

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pET载体

pET载体

pET载体，原核表达金标准

　　对于全世界许多研究者，Novagen的pET系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首选。

该系统成功的一个主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7启动子之下，因此在加入T7RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。

克隆到pET载体的基因实际上是被关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。

重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表达宿主中，并通过加入IPTG诱导表达；也可通过lCE6感染原始克隆宿主菌来提供T7RNA聚合酶。

使用大肠杆菌启动子系统（如tac、lac、trc、pL）有困难的许多基因已经在pET系统中稳定克隆和表达。

T7RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。

诱导后几小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50%。

新开发的T7驱动表达技术以pETBlueTM系统为代表。

pETBlue载体包括了pET用于表达的优点，在目标基因克隆和质粒DNA操作的方面更为方便。

pETBlueTM系统：

新一代T7表达载体

pETBlue载体代表了新型表达载体，它具备所有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7驱动蛋白表达的完全功能。

目标基因以相对于修饰的大肠杆菌tet启动子的反义方向插到lacZa-肽编码区，因此可进行蓝/白斑筛选。

正确定位于目标基因正义方向上游的T7转录和翻译信号使表达成为可能。

与标准pET载体一样，通过转化λDE3溶原菌并用IPTG诱导或通过lCE6感染原始宿主菌生产目标蛋白。

优点

·蓝/白斑筛选，便于克隆

·高拷贝数，质粒DNA高产

·以AccepTorTM载体或perfectlyBlunta载体形式提供，便于快速PCR克隆

·目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性

·表达水平与经典pET载体相同

上高拷贝PUC复制起点增加了质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。

　　如果插入序列相对于T7lac启动子为正义方向且符合每个载体的翻译要求，pETBlue载体中目标基因可以高水平表达。

用两种方法进行蛋白表达：

用lCE6（lpL启动子控制T7RNA聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组pETBlue质粒到宿主菌TunerTM（DE3）pLacI或OrigamiTM（DE3）pLacI中并用IPTG诱导。

这些宿主菌染色体上带有一拷贝lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因，并通过相容的pLacI质粒提供足够lac阻遏蛋白，以确保低水平的未诱导表达。

Tuner菌株的lacY状态使整个培养细胞被均一的诱导，并随IPTG剂量诱导有不同的蛋白表达水平。

Origami菌株能够增强胞质中二硫键形成。

pETBlue-1

pETBlue-1便于从5'端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。

该载体EcoRV（GATATC）克隆位点位于强T7基因10核糖体结合位点（RBS）附近。

含有ATG起始密码子或5'端具有一个位置合适的G核苷酸插入片段成为一个合适的大肠杆菌翻译起始位点。

pETBlue-2

pETBlue-2提供了载体编码的ATG起始密码子和多种下游克隆位点。

MCS5'和3'端两套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。

在载体确定的读码框中，这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。

因此只要插入方向正确，任何插入片段可克隆到经过合适平末端酶切割的载体的读码框中。

而且，任何不含内部终止密码子的插入片段都可与C-末端HSV.Taga表位和His.Taga序列克隆到同一读码框中。

pETBlueTMPCR克隆试剂盒

方便地将PCR扩增DNA直接克隆到pETBlue载体中

除了含有未切割质粒的pETBlueTM系统，Novagen还提供可立即插入PCR产物的pETBlue载体。

已有两种试剂盒：

AccepTorTM载体试剂盒能够插入带单个3'-dA突出的DNA，如非校对DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的扩增产物；而perfectlyBlunta克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。

在pETBlue-1AccepTor载体中表达插入基因的引物设计：

pETBlue-1：

用5'端ATG开始的正义引物进行扩增，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋白的RBS和翻译起始位点之间的最适距离。

目标序列羧基端引物设计没有限制。

Met---

正义引物5'-ATGXXX---

反义引物无限制

pET系统概述

pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。

根据最初由Studier等开发的T7启动子驱动系统，Novagen的pET系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平

pET系统提供6种载体-宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。

没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7RNA聚合酶基因的宿主菌（λDE3溶原菌）中表达目标蛋白。

在λDE3溶原菌中，T7RNA聚合酶基因由lacUV5启动子控制。

未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。

而宿主菌带有pLysS和pLyE时调控会更严紧。

pLys质粒编码T7溶菌酶，它是T7RNA聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。

pLysS宿主菌产生低量T7溶菌酶，而pLysE宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3溶原菌。

有11种不同DE3溶原化宿主菌。

使用最广泛的为BL21及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon和ompT蛋白酶。

B834菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。

BLR为recA-衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。

两个硫氧还蛋白还原酶（trxB）突变菌株（AD494,BL21trxB），有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。

OrigamiTM和OrigamiB菌株为trxB/gor双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。

Origami和OrigamiB宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。

新的RosettaTM菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。

其它菌株背景包括K-12菌株HMS174和NovaBlue，象BLR一样为recA-。

这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3噬菌体丢失的某些目标基因。

由于存在F附加体编码的高亲和力lacIq阻遏蛋白，NovaBlue为一个有用的严紧型宿主菌。

此外，Novagen提供了λDE3溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

表达高毒性基因或制备新的λDE3溶原菌的另一替代方法是通过lCE6感染提供T7RNA聚合酶。

虽然不如用IPTG诱导λDE3溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性T7lac启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，pET系统中T7启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：

普通T7启动子和T7lac启动子。

T7lac启动子在启动子区下游17bp处含有一个25bp的lac操纵序列。

该位点结合lac阻遏蛋白能够有效降低T7RNA聚合酶的转录，这样提供了在λDE3溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI的机制（除了抑制lacUV5）。

含T7lac启动子的pET质粒还具有它们自己的lacI，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体/宿主菌组合。

控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。

通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。

除了根据载体/宿主菌组合控制T7RNA聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET系统还根据诱导物（IPTG）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。

Tuner和OrigamiB宿主菌的lacY突变使这种控制成为可能。

选择pET载体

所有的pET载体均来自pBR322，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。

有两大类pET质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体（包括pET-21、pET-23和pET-24）表达目标RNA，但不提供翻译信号。

它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。

（注意：

转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。

许多载体在读码框a、b和c中带有克隆位点，分别对应于BamHI位点的GGA、GAT和ATC三联体。

选择要点

选择用于表达的pET载体通常涉及多种因素。

考虑以下三个主要因素：

·所表达蛋白的用途

·所表达蛋白的已知信息

·克隆策略

pET载体表达的蛋白用途各种各样。

例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。

大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。

许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。

如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。

例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。

许多pET载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。

在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。

LIC（连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子Xa能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。

由于许多pET载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。

采PCR克隆策略时则有不同的考虑。

LIC载体试剂盒推荐用于此目的，可通过PCR制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。

在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。

在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。

PET-32载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白（Trx.Tag）融合。

新推出的pET-43.1系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白--Nus.Tag融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。

此外，trxB突变株AD494和BL21trxB，或trxB/gorOrigamiTM和OrigamiB菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。

低温诱导（15-25°C）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。

为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。

抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭（如使用Novagen的蛋白折迭试剂盒）。

该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。

然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。

pET-31b（+）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有S.Tag、T7.Taga、His.Taga和HSV.Taga的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。

这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。

通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒，GST.Tag、S.Tag和T7.Tag序列可用于亲和纯化。

使用S.Tag和GST.Tag分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。

采用一种新颖底物的FRETWorksS.Tag分析试剂盒可通过荧光检测到少于1fmol的融合蛋白。

His.Taga序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Taga在低费用亲和纯化中非常有用。

它们也特别适用于重新折迭（特别是带有CBDclos.Taga序列的pET-34b（+）和35b（+））。

因为只有正确重新折迭的CBDs结合到纤维素基质上，CBIND亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。

任何标签可用于固定目标蛋白，但由于CBD.Tag序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag、Trx.Tag和GST.Tag序列用来增加其融合伴侣的溶解性。

Nus.Tag和Trx.Tag载体与利于在胞浆中形成二硫键的Origami宿主菌相容。

各种融合标签和相应pET载体见列表。

一些pET载体带有数个串联的融合标签，作为5'融合伴侣。

此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。

使用在5'标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子Xa和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。

pET-30Ek/LIC、pET-32Ek/LIC、pET-34Ek/LIC和pET-36Ek/LIC是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。

pETEk/LIC载体Combo试剂盒包括所有4种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。

pETNusA融合系统43.1

在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白

新推出的pETNusA融合系统设计用于克隆和高水平表达与495aaNusA（Nus.Tag）蛋白融合的多肽序列。

对数据库中4000个以上蛋白进行可溶性建模，NusA蛋白被确认为具有最高的可溶性。

在用四种不同NusA融合蛋白进行的试验中，大于85%的表达蛋白都是可溶的。

pET-43.1载体含有Nus.Tag融合伴侣并与trx/gor突变体Origami和OrigamiB菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。

使用pET-43.1载体和这些trx/gor宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。

优点

·高可溶性的N-末端Nus.Tag融合伴侣

·上游His.Taga、S.Tag和可选择的C-末端HSV.Taga、His.Tag融合标签

·凝血酶和肠激酶切割位点

·多克隆位点位于所有读码框中

·与AD494和Origami宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭

pET宿主菌株感受态细胞

所有pET系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

　　（DE3）指宿主为λDE3溶原菌，其染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因。

这类菌株适用于从克隆到pET载体的目标基因生产蛋白。

命名为pLysS和pLysE的宿主菌带有编码T7溶菌酶（为T7RNA聚合酶的天然抑制物）的pET相容性质粒。

带有pLysS的细胞产生少量溶菌酶，而pLysE宿主菌产生更大量酶。

这些菌株用于在诱导前抑制T7RNA聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的pET重组体。

带有pLacI的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx载体基础表达的lac阻遏蛋白。

λDE3溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

AD494菌株为硫氧还蛋白还原酶（trxB）突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。

TrxB突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。

B834为BL21的亲本菌株。

这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21应用最广的宿主菌来源，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点。

BL21TrxB菌株在蛋白酶缺陷BL21背景上具有与AD494菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变（trxB）。

由于trxB宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。

TrxB突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的质粒。

BLR为BL21的recA-衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起DE3噬菌体丢失的目标质粒。

HMS174菌株在K-12背景上提供了recA突变。

与BLR一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起DE3噬菌体丢失的某些目标基因。

NovaBlue适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株，具有高转化效率、蓝/白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒DNA高产的recAendA突变。

由于存在F附加体编码的lacIq阻遏蛋白，NovaBlue的DE3溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。

Origami为K-12衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变（trxB）和谷胱甘肽还原酶（gor）基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。

研究表明即使总体表达水平相似，Origami（DE3）表达的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。

Origami宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于pET-32载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。

TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的pET质粒。

OrigamiB宿主菌来源于BL21lacZY突变株，还带有与原始Origami菌株相同的TrxB/gor突变。

OrigamiB菌株集BL21、Tuner和Origami宿主菌的优点于一体。

TrxB和gor突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记bla的pET质粒。

Rosetta宿主菌从BL21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。

该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。

这样Rosetta菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。

tRNA基因由它们的天然启动子驱动。

在Rosetta（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）pLacI中，稀有tRNA基因存在于分别带有T7溶菌酶和lac阻遏基因的同一质粒上。

Tuner菌株为BL21的lacZY缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。

lac通透酶（lacY）突变使得IPTG均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。

通过调整IPTG浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与pET载体相关）。

低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。

Tuner（DE3）pLacI菌株与pETBlue和pTriEx载体的表达相容。