怀化医专《微生物学检验》教案编号.docx
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怀化医专《微生物学检验》教案编号
怀化医专《微生物学检验》教案编号：
2010年上学期
授课教师
桂芳
教研室主任审核签名
李争鸣
教学课题
厌氧性细菌及检验
课时
授课时间
月日
月日
月日
月日
月日
月日
2
星期
星期
星期
星期
星期
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授课对象
检验专业
班级
目的要求
【掌握】厌氧菌的种类，常见有芽胞和无芽胞厌氧细菌的生物学特性和微生物学检查法。
【熟悉】厌氧菌在正常人体的分布和感染情况，厌氧菌感染的临床及细菌学指针。
教学重点及难点
重点：
1、厌氧菌的特点及分类
2、厌氧性细菌的微生物学检验
3、主要厌氧芽胞羧菌的生物学特性及微生物学检验
4、各种无芽胞厌氧菌的鉴别
难点：
厌氧菌的微生物学检验法。
教法与
学法
讲授法、比较、归纳
课型
理论课
教学手段
多媒体
教学
内容
与
时间
分配
1、概述（5min）
2、厌氧性细菌的微生物学检验（25min）
3、厌氧芽胞梭菌：
破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌。
（40min）
4、革兰阴性无芽胞厌氧杆菌（10min）
5、革兰阳性无芽胞厌氧杆菌（10min）
6、厌氧性球菌（10min）
复习
思考题
厌氧性细菌检验的标本采集应注意哪些问题？
参考资料
1、张卓然主编《临床微生物学与微生物检验》人卫出版社第3版2006.11
2、倪语星主编《临床微生物学与检验》人卫生出版社第4版，2007年
3、李凡主编《医学微生物学》人卫出版社第7版2008.1
自评
本次课讲解条理清楚，重点突出，难点分析透彻，多媒体课件使用效果较好。
厌氧性细菌及检验
（anaerobicbacteria）
第一节概述
厌氧性细菌指一群必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。
一、厌氧菌的分类
分为两类：
（P285表）
一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属，即梭菌属，共有130个种。
以芽胞形式存于体外。
另一类为无芽胞厌氧菌，包括40多个属，300多个菌种和亚种；多为体内正常菌群，存在于皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和泌尿生殖道。
易引起这些部位的内源性感染，而不易诊断。
二、厌氧菌感染（占临床感染的60%）
（一）厌氧菌在正常人体的分布
厌氧菌与需氧菌一起组成了人体的正常菌群。
人体许多部位厌氧菌在种类和数量上远多于需氧菌，如在结肠中99%的细菌都是厌氧菌。
临床厌氧菌感染中，由正常菌群的无芽胞厌氧菌的感染最为多见。
（二）厌氧菌感染的原因
1.局部组织的氧化还原电势降低如血管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧，使Eｈ降低；此外，大面积外伤伴有需氧菌感染消耗了氧，为厌氧菌感染提供了条件。
2.机体免疫功能下降 如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病病人及老人、婴幼儿、早产儿等，因免疫力下降易併发厌氧菌感染。
3.机体局部屏障破坏，使厌氧菌进入周围组织和血液引起感染。
（三）厌氧菌感染的临床及细菌学指征
1.局部有气体产生为重要指征之一
2.发生在粘膜附近的感染
3.深部外伤
4.有特殊的分泌物如有恶臭，暗红血色或在紫外光下发出红色荧光。
如分泌物或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染。
5.某些抗生素治疗无效的感染。
6.细菌形态培养有特征性变化如革兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形性；或镜检查见细菌而需氧培养为阴性者。
第二节厌氧菌的微生物学检验
一、标本的采集与运送
（一）标本采集
标本种类：
血液、关节液、心包液、腹腔液、膀胱穿刺液等体液；深部脓肿渗出液、肺部渗出液、其他组织穿刺液。
厌氧菌培养最好的标本是组织标本，厌氧菌在其中更易生长。
采集注意事项：
避免正常菌群污染，尽量避免接触空气。
有些标本如鼻咽拭子、痰液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等因含大量的正常菌群，故不宜作厌氧菌培养。
采集方法：
采取深部的组织标本：
需经碘酒消毒皮肤后，用注射器插入病变部位深部，抽取数毫升后，弃去一滴于酒精棉球上。
（不同标本采集见P291表）
（二）标本的运送与处理
注意尽快送检，避免干燥，避免接触空气
1.针筒运送法 适宜液体标本。
标本抽取后排尽空气，并将针头插入无菌橡皮塞中即可送检。
2.无氧小瓶运送法 常用于少量脓液标本的运送。
用无菌青霉素小瓶，瓶内装入0.5ｍｌ的心脑浸液（含有0.0003%的刃天青---氧化还原指示剂）,加橡皮塞后,铝盖密封，真空泵抽出瓶中空气，充入N2，连续充抽3次，最后充以CO2，高压灭菌备用。
如有氧渗入小瓶，培养基则显粉红色，应弃去。
运送时挑选无色小瓶，将标本用无菌注射器注入瓶中即可。
3.标本充盈法送检适宜于大量液体标本运送。
将液体标本装满标本瓶，加盖密封，可驱除瓶中空气。
4.组织块运送法将组织块放在密封的厌氧罐中运送。
罐内放入经酸化硫酸铜浸泡过的钢丝绒，其表面即有金属铜，具强还原性，能迅速吸氧，造成厌氧罐中无氧状态。
5.厌氧袋运送法
6.棉拭运送法（略）
应在20~30min内处理完毕，最迟不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过度生长，抑制厌氧菌的生长。
如不能及时接种，应将标本保存于室温（因冷藏对厌氧菌有害）。
二、检验程序
三、检验方法
（一）肉眼观察
应观察标本的性状，如是否为脓性、带血，有无黑色坏死组织或黑色分泌物，有无硫磺样颗粒或恶臭气味等。
这些有助于厌氧菌的鉴定和培养基的选择。
（二）直接镜检
在接种前除血液外，各种临床标本均需直接涂片染色、镜检，以了解标本中细菌的数量、形态及染色性，便于选择合适的培养基和培养方法，还可验证培养结果的成功与失败。
（三）分离培养
1、初代培养
（1）培养基的选择：
1）非选择培养基 以牛心脑浸液及布氏肉汤为基础，补充0.5%酵母浸出液，5μg/ml氯化血红素、10μg/ml维生素K1及5%－10%的脱纤维血的强化血平板。
2）选择培养基 常用的有:
七叶苷胆汁平板（BBE，用于脆脆弱类杆菌）
卡那万古冻溶血平板（KVLB，可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期产生黑色素）
FS培养基（梭杆菌选择培养基）
VS培养基（韦荣球菌选择培养基）
CCFA培养基（艰难梭菌）
上述培养基使用注意：
①尽量使用新鲜培养基，2~4ｈ内用完；②使用前放入无氧环境，预还原处理24~48ｈ；③也可采用预还原灭菌法制备的培养基；④液体培养基应煮沸10min，驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。
（2）标本接种
初代培养应同时接种固体和液体两种培养基，且每份标本应同时接种3个平板，分别置有氧、无氧和含5~10%CO2环境培养。
如只要求厌氧培养，只需种一个厌氧血平板，并将其分为三个区，在第一、二区交界处贴放一枚灭滴灵，如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在。
（3）培养方法
原理是通过物理、化学或生物学等方法，创造一种无氧的环境。
1）厌氧罐培养法：
即利用物理或化学的方法在一个密闭的罐子里造成无氧的环境。
有抽气换气法和冷触媒法。
抽气换气法：
将种好的培养基放于罐内，放入经烘烤的催化剂（钯粒）盘，盖子拧紧。
通过罐盖上的三通管，用真空泵抽尽罐内空气，再用N2反复充气与抽气3次，最后充入含80%N2、10%H2、10%CO2的混合气体。
钯粒用过既失活，再次使用前需将其加热至灼红。
如此反复使用：
2H2+O2→2H2O
冷触媒法：
利用化学方法产生H2和CO2，产生的H2在触媒的作用下，与罐内的氧结合生成水，将氧消耗掉，造成无氧环境。
使用时同抽气换气法将钯粒和接种好的平板放于厌氧罐内，然后将配套的气体发生袋剪去一角，加入10ml水，立即放于罐内，密封厌氧罐即可。
2）厌氧气袋法：
原理与冷触媒法相同，只是用无毒的塑料薄膜制成的特殊气袋取代厌氧罐。
优点：
简便易行，携带方便，尤适宜于床边接种，和基层医院使用。
3）厌氧手套箱：
为国际公认的厌氧菌培养的最佳设备。
为一个密闭的大型金属箱，由手套操作箱和传递箱两个部分组成，操作箱内还附有小型恒温培养箱，通过自动化装置自动抽气、换气，保持箱内的厌氧状态。
优点：
因接种、培养和鉴定等都是在无氧状态下进行，提高了检验的阳性率；缺点：
设备昂贵，耗气。
4）疱肉培养法：
肉渣加适量液体培养基，表面盖以凡士林。
肉渣含不饱和脂肪酸，可吸收氧，并含谷光甘肽，可降低培养基的氧化还原电势。
适用于所有厌氧菌的培养和菌种保存
（4）结果观察
厌氧菌的初代培养生长较慢，故应在48ｈ后才能初步观察，如疑为放线菌则应延长至72－96ｈ。
观察时应注意：
①厌氧菌在对数生长期对氧非常敏感，故在培养的48ｈ不应使细菌暴露于空气中；②标本镜检阳性，但培养48ｈ却无菌生长，应继续培养5－7ｄ。
2.次代培养和厌氧菌的确定
初代厌氧培养有细菌生长时，需做耐氧试验，确定是否为厌氧菌。
方法是：
从每个平板上挑取4－5个不同性状的菌落，每个菌落分别接种3个平板（每个平板分4－6个区，可同时做4－6个菌落的次代培养）。
分别放有氧、无氧和含5%－10%CO2环境中培养48ｈ，如只在厌氧环境中生长的细菌，即为厌氧菌。
四、鉴定试验
初步鉴定：
菌体形态、染色反应、菌落性状、对某些抗生素的敏感性；
最后鉴定：
依据生化反应和终末代谢产物。
1.形态与染色：
对其鉴定较为重要。
2.菌落性状：
包括其形态、大小、色素、荧光及溶血等。
（1）色素：
产黑色素普雷沃菌、不解糖紫单胞菌2~10天——黑色素
龋齿放线菌3~4天——粉红色色素
奈氏放线菌—培养时间延长——黄褐色
（2）溶血：
产气荚膜芽胞梭菌血平板）—形成双溶血环
（3）荧光：
产黑色素普雷沃菌、不解糖紫单胞菌某些株——在紫外线照射下—红色荧光
梭杆菌—黄绿色荧光；
艰难梭菌—绿色荧光
3.抗生素敏感鉴定试验
常用抗生素：
卡那霉素、万古霉素、多黏菌素；一般抑菌环直径＜10mm为耐药。
分梭杆菌属对卡那霉素（敏感）—类杆菌（多数不敏感）
革兰阳性厌氧菌对万古霉素（敏感），对黏菌素耐药。
4.聚茴香脑磺酸钠（SPS）敏感试验
用于鉴定厌氧消化链球菌（特别敏感）。
5.生化试验糖发酵、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触媒试验等。
可用自动微生物鉴定系统如：
VITEK-ANT\Microscan-ANI等；
胞外酶快速鉴定试验：
利用厌氧菌产生的酶，与少量的生化基质反应，不需培养，只需浓菌液即可，4小时可观察结果。
6.气液相色谱技术
第三节厌氧芽胞梭菌属
（Clostridium）
简称梭菌属，又称厌氧芽胞杆菌，革兰氏染色阳性，都能产生芽胞，芽胞直径大多比菌体宽，使菌体膨大成梭形，故得名。
芽胞的形状和位置在鉴别上有意义。
除产气荚膜梭菌外，均无荚膜。
大多数为严格厌氧；能产生多种外毒素和侵袭性酶，致病性强。
本属细菌主要包括破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、肉毒杆菌等。
一、破伤风梭菌
（Clostridiumtetani）
是引起破伤风的病原菌，大量存在于人和动物肠道中，由粪便污染土壤，经伤口感染引起疾病。
（一）生物学性状
1、形态：
菌体细长，有周身鞭毛，芽胞呈圆形，位于菌体顶端，比菌体宽大，似鼓槌状，是本菌形态上的特征。
繁殖体为革兰氏阳性，带上芽胞的菌体易转为革兰氏阴性。
2、培养特性：
为专性厌氧菌，营养要求不高。
血平板：
呈移行生长，菌落：
d2~4mm，扁平，半透明，灰白色，边缘不齐，周边呈羽毛状，有β溶血。
在普通琼脂平板上培养24～48小时后，可形成直径1mm以上不规则的菌落，中心紧密，周边疏松，似羽毛状菌落，易在培养基表面迁徒扩散。
在疱肉培养基中培养，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇（有腐败臭味）及硫化氢。
3、生化反应：
一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢，形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐。
对蛋白质有微弱消化作用。
4、抵抗力：
本菌繁殖体抵抗力与其他细菌相似，但芽胞抵抗力强大。
在土壤中可存活数十年，能耐煮沸40～50分钟。
对青霉素敏感，磺胺类有抑菌作用。
（二）致病性
1、致病条件：
由伤口侵入人体，一般伤口中不能生长，伤口的厌氧环境是破伤风梭菌感染的重要条件。
①窄而深的伤口（如剌伤），②有泥土或异物污染，或大面积创伤、烧伤、坏死组织多，局部组织缺血或③同时有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染，均易造成厌氧环境，局部氧化还原电势降低。
有利于破伤风杆菌生长。
2、致病因素：
产生强烈的外毒素，即破伤风痉挛毒素（Tetanospasmin）或称神经毒素（Neurotoxin）。
为蛋白质，不耐热，可被肠道蛋白酶破坏，故口服毒素不起作用。
毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素。
毒素能与神经组织中的神经节苷脂结合，封闭了脊髓抑制性突触末端，阻止释放抑制冲动的传递介质甘氨酸和γ氨基丁酸，从而破坏上下神经原之间的正常抑制性冲动的传递，导致超反射反应（兴奋性异常增高）和横纹肌痉挛。
3、症状：
破伤风潜伏期不定，平均7～14天。
潜伏期越短，病死率越高。
发病早期有发热、头痛、不适、肌肉酸痛等前驱症状，局部肌肉抽搐，出现张口困难，咀嚼肌痉挛，患者牙关紧闭，呈苦笑面容。
继而颈部、躯干和四肢肌肉发生强直收缩，身体呈角弓反张，面部紫钳、呼吸困难，最后可因窒息而死。
病死率约50%，新生儿和老年人尤高。
新生儿破伤风（俗称脐风）尤为常见。
（三）微生物学检查
破伤风梭菌分布广泛，如果病人无临床症状，即使伤口找到破伤风梭菌也不能作为诊断的依据。
故破伤风的诊断主要根据有无创伤病史和临床症状，一般不需要作微生物检验，仅在必要时才进行检验。
（四）特异防治
破伤风一旦发病，治疗困难，应以预防为主。
1．人工自动免疫对战士、建筑工人等接种吸附精制破伤风类毒素全程基础免疫，以刺激机体自动产生抗毒素。
儿童则注射白喉、破伤风类毒素混合制剂。
当受伤后有可能感染时，应加强免疫一次吸附精制破伤风类毒素。
2．人工被动免疫
（1）紧急预防如遇严重污染创伤或受伤前未经全程基础免疫者，除用类毒素加强免疫外，可再注射破伤风抗毒素（Tetanusantitoxin,TAT）。
即在一臂注射抗毒素，另一臂注射类毒素，6～12周后再注射一针类毒素。
实践证明，同时注射抗毒素和类毒素，预防效果好，
（2）特异治疗一旦发现病人，应立即注射破伤风抗毒素，要早期足量，每次可肌肉或静脉注射6～10万单位，注射前必须作皮肤试验，防止马抗毒素血清过敏性休克的发生。
大剂量的青毒素（或四环毒）能有效地抑制破伤风梭菌在局部病灶中繁殖，并且对混合感染的其他细菌也有作用，故亦可用于治疗。
二、产气荚膜梭菌
（Cl.perfringens）
是气性坏疽的主要病原菌。
与破伤风梭菌不同，除具有外毒素外，还有多种侵袭性酶及荚膜构成强大的侵袭力，因此入侵创口后造成严重局部感染及全身中毒因局部组织出现坏死、水肿、产气，临床称为气性坏疽。
气性坏疽是战时多见的一种严重的创伤感染，以局部水肿、产气、肌肉坏死及全身中毒为特征。
病原菌约有6～9种之多，常为混合感染。
以产气荚膜梭菌为最多见（约占60～90%），其次是水肿梭菌和败毒梭菌，其他还有产芽胞梭菌、溶组织梭菌和双酶酸菌等。
（一）生物学性状
1、形态染色：
G+大杆菌，芽胞卵圆形，位于菌体次极端，不大于菌体宽度。
有荚膜。
无鞭毛
2、培养特性：
专性厌氧。
血平板：
菌落较大、灰白色、不透明，边缘呈锯齿状，多数菌株有双层溶血环。
内环是θ毒素的作用，而外环不完全溶血是a毒素所致。
疱肉培养基：
不消化肉渣，有时呈肉红色。
牛乳培养基：
分解乳糖可使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，冲破凝固的酪蛋白，可将覆盖在培养基上层的凡士林冲至试管顶部，甚至冲开管口棉塞，气势汹猛，称为“汹涌发酵”。
３、生化反应
能分解多种糖类，如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖，产酸产气，不发酵甘露糖或水杨苷，能液化明胶，产生硫化氢，不能消化已凝固的蛋白质和血清。
（二）致病性
1、致病物质
致病条件与破风梭菌相似。
既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力。
毒素种类多，外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν等12种，具多种毒性酶，如卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和DNA酶等，构成强大的侵袭力。
在各种毒素和酶中，以α毒素最为重要，α毒素是一种卵磷脂酶，能分解卵磷脂，人和动物的细胞膜是磷脂和蛋白质的复合物，可被卵磷脂酶所破坏，故α毒素能损伤多种细胞的细胞膜，引起溶血、组织坏死，血管内皮细胞损伤，使血管通透性增高，造成水肿。
此外，θ毒素有溶血和破坏白血球的作用，胶原酶能分解肌肉和皮下的胶原组织，使组织崩解，透明质酸酶能分解细胞间质透明质酸，有利于病变扩散。
2、临床表现
（1）气性坏疽以局部剧痛、水肿、胀气、组织迅速坏死、分泌物恶臭，以伴有全身毒血症为特征的急性感染。
潜伏期较短，一般只有8～48小时。
由于本菌分解组织中的肌糖，产生大量气体充塞组织间隙，造成气肿，挤压软组织，阻碍血液循环，进一步促使肌肉坏死。
同时毒素还可引起血管壁通透性增高，浆液渗出，形成扩散性水肿，以手触压肿胀组织可发生“捻发音”。
疼痛剧烈，蔓延迅速，最后形成大块组织坏死。
细菌一般不侵入血流，局部细菌繁殖产生的各种毒素以及组织坏死产生的毒性物质被吸收入血，引起毒血症而死。
（2）食物中毒
（3）急性坏死性肠炎
（三）微生物学检验
发病急剧，后果严重，及早诊断甚为重要。
由于本菌分布广泛，所以单凭创口发现此菌还不足以诊断。
尚需结合临床表现，才能确诊。
1．直接涂片镜检从伤口深部取材涂片，革兰氏染色镜检，可见革兰氏阳性大杆菌，并有荚膜，常伴有其他杂菌，白细胞甚少，形态不规则，这是气性坏疽标本涂片的特点。
2．分离培养与鉴定取坏死组织制成悬液，接种于血平板上或疱肉培养基中，厌氧培养，观察生长情况。
取细菌培养物涂片镜检，并进一步用生化反应鉴定。
3．动物实验
取培养液0.5～1ml给小鼠或家兔静脉内注射，10分钟后杀死动物，置37℃5～8小时。
如动物躯体膨胀，即行解剖，可见脏器和肌肉内有大量气泡，尤以肝脏最为明显，称“泡沫肝”。
取内脏或心血涂片镜检或分离培养，可发现有革兰氏阳性大杆菌，并有明显荚膜。
（四）防治原则
预防的办法主要是早期扩创，清洁伤口，局部用双氧水冲洗，以破坏厌氧环境。
除早期应用多价抗毒素外，应配合手术、抗生素及支持疗法等。
三、肉毒梭菌
（一）生物学性状
1、形态染色：
具有周鞭毛，无荚膜。
芽胞椭圆形，位于菌体次极端，大于菌体宽度呈网球拍状。
2、培养特性：
严格厌氧。
普通平板上：
直径3～5mm不规则的菌落。
血平板上有β溶血。
疱肉培养基中能消化肉渣，使之变黑，有腐败恶臭。
分解葡萄糖、麦芽糖及果糖，产酸产气。
液化明胶，产生H2S，不形成吲哚。
3、抵抗力：
肉毒梭菌芽胞抵抗力很强，经高压蒸气121℃30分钟杀死
肉毒毒素对酸的抵抗力比破伤风毒素强，故可以被胃肠吸收。
4、致病性：
引起食物中毒。
肉毒毒素是一种嗜神经毒素，经肠道吸收后进入血液，作用于脑神经核、神经接头处以及植物神经末梢，阻止乙酰胆碱的释放。
妨碍神经冲动的传导而引起肌肉松驰性麻痹表现为全身无力、视力模糊不清、吞咽及呼吸困难，严重者可因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡。
因毒素不直接刺激肠粘膜，故无明显的消化道症状。
主要因豆类、肉类、腊肠及罐头食品等被肉毒梭菌或芽胞污染，在厌氧条件下繁殖产生外毒素，被人食入所引起。
课后小结
有芽胞厌氧菌只有一个属，即梭菌属，以芽胞形式存于体外，常引起外源性感染。
无芽胞厌氧菌包括40多个属，多为体内正常菌群，引起内源性感染。
了解厌氧菌感染的细菌学指针对于其微生物学检验具有一定的指导意义。
厌氧菌感染占临床细菌感染的50-60%，在进行普通的细菌培养时往往容易漏检，因此应特别注意其标本的采集与运送、检验方法中均应尽量避免接触空气，以提高检出率。
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