学年高中生物第4章生物化学与分子生物学技术实践第2节分子生物学技术学案.docx

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学年高中生物第4章生物化学与分子生物学技术实践第2节分子生物学技术学案

第二节　分子生物学技术

1．简述PCR技术的原理及基本操作步骤。

（重难点）

2．尝试进行DNA片断的PCR扩增。

（难点）

PCR扩增的原理和过程

1．细胞内DNA复制的条件

原料

4种脱氧核苷酸

模板

2条DNA母链

酶

解旋酶和DNA聚合酶

引物

使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸

2.PCR扩增技术

（1）概念：

在体外快速扩增特定基因或DNA序列（目的DNA片段）的实验技术，又称为体外基因扩增技术或DNA扩增技术。

（2）PCR技术的原理：

①条件：

DNA模板、TaqDNA聚合酶、脱氧核苷酸引物、四种脱氧核苷酸。

②PCR扩增的特点：

快速、简便和灵敏。

③进行PCR的先决条件：

待扩增的DNA片段3′端的脱氧核苷酸序列要为已知。

④引物序列确定的依据是：

被扩增区域的3′端边界DNA序列。

3．PCR反应的过程

变性—

↓

退火（复性）—

↓

延伸—

[合作探讨]

探讨1：

什么是引物？

DNA复制时为什么需要引物？

提示：

所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。

在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。

探讨2：

为什么PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶？

提示：

因为PCR反应过程中变性和延伸都需要较高的温度，一般的DNA聚合酶在这种温度下会变性失活，只有耐高温的TaqDNA聚合酶在这种温度下可以正常发挥作用。

探讨3：

如果某DNA片段经过PCR反应扩增了4个循环，请计算双链中都含引物的DNA分子的数目。

提示：

由于DNA复制具有半保留复制的特点，所以含有母链的DNA分子只有两个，其他分子的两条链都含有引物。

复制4次共形成24＝16（个），有14个DNA分子的两条链均含引物。

[思维升华]

1．PCR解旋与复旋的原理：

DNA热变性的原理

2．PCR的反应过程

（1）变性：

当系统温度上升到90℃以上时，双链间的氢键打开，DNA解旋为单链，如图：

（2）复性：

当系统温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合，如图：

（3）延伸：

当系统温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸（A，G，C，T）在DNA聚合酶的作用下，从引物的3′末端开始，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图：

3．PCR扩增的计算

理论上DNA呈指数方式扩增。

若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。

1．下列有关PCR的描述，不正确的是（　　）

A．PCR的技术原理是DNA复制

B．是一种酶促反应，需耐高温的解旋酶和DNA聚合酶

C．一个DNA片断经PCR扩增，可形成2n个DNA片断（n代表循环的次数）

D．PCR技术利用DNA的热变性来控制DNA的解聚与结合

【解析】　PCR技术是利用热变性原理让模板DNA分子解旋的而不是通过解旋酶的作用。

【答案】　B

2．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，从而被广泛应用，此过程需要TaqDNA聚合酶。

请回答有关问题：

（1）体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用

____________________________________________________________

____________________________________________________________。

（2）TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的。

①为什么在热泉中只筛选出来Taq细菌呢？

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________。

②TaqDNA聚合酶的功能是_________________________。

③TaqDNA聚合酶的化学本质为蛋白质，可用________________法和________________法进行分离。

（3）与体内DNA复制相比较，PCR反应要在________中才能进行，并且要严格控制________条件。

（4）PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是________________。

【解析】　

（1）PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋。

（2）①利用细菌特有的特性而与其他细菌区分开来，Taq细菌具有耐高温的特性，放在高温环境下，其他绝大多数细菌死亡，而Taq细菌得以保留。

②在DNA分子复制中，TaqDNA聚合酶将一个脱氧核苷酸的脱氧核糖和另一脱氧核苷酸的磷酸连接形成磷酸二酯键。

③蛋白质的分离可以根据其分子大小和带电的性质和多少使之分离，即凝胶色谱法和电泳法。

（3）PCR反应是在一定的缓冲溶液中进行的，并需严格控制好温度条件。

（4）PCR与体内DNA复制过程中的原料是完全相同的，并加入小段单链DNA或RNA作为引物，引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

【答案】　

（1）高温使DNA分子热变性　

（2）①热泉70℃～80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物

②催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键

③凝胶色谱　电泳　（3）一定的缓冲溶液　温度

（4）2　作为DNA复制的起点

目的DNA片段的体外扩增

1．DNA片段的PCR扩增

（1）准备器材

（2）在0.2mLPCR薄壁离心管中加入5_μL10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5μL,1_μL模板DNA，5_μL引物1和5_μL引物2,29_μL双蒸水。

（3）煮沸5_min之后冰浴2min，低速离心，按照1单位/μL加入Taq聚合酶。

（4）扩增DNA片断的反应程序：

将离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。

在94_℃的条件下预热5min，再设置反应程序为：

94℃，30s―→55℃，30s―→72℃，1min（以上过程循环30次）。

最后一次延伸条件为72_℃，1_min。

运行反应程序。

2．DNA分子的测定

[合作探讨]

探讨1：

如何避免在PCR操作中被外源DNA污染？

提示：

在PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水都要在使用前进行高压灭菌。

探讨2：

为什么要将微量离心管放在离心机上进行离心？

提示：

离心的目的是使反应液集中在离心管底部。

探讨3：

PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶、引物等条件，如何通过设置对照实验进行验证？

提示：

在对照组中不加入TaqDNA聚合酶或引物，与实验组形成对照，就可以证明PCR需要耐高温的TaqDNA聚合酶和引物。

[思维升华]

1．PCR实验操作的注意事项

（1）PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。

（2）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

（3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。

（4）PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。

（5）PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。

2．PCR技术的应用

（1）医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断。

（2）对单细胞中的DNA进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用。

（3）法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定。

（4）古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹。

（5）在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。

1．下列操作过程的叙述中错误的是（　　）

A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存

C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换

【解析】　为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等，在使用前要进行高压灭菌；还要将所用的缓冲液和酶分装成小份；并且使用一次性吸液枪头，则A、B、D项都正确。

在使用前，将PCR所需试剂从冰箱内拿出来，放在冰块上缓慢融化，则C项错误。

【答案】　C

2．PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是（　　）

【导学号：

67850055】

①94℃，使DNA分子变性，失去生物活性

②94℃，使DNA分子变性，解开螺旋　③56℃，使DNA分子开始复制、延伸　④56℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性　⑤72℃，使DNA分子开始复制、延伸　⑥72℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性

A．①③⑤　　　　　　B．②③⑤

C．②④⑤D．②④⑥

【解析】　PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。

当温度上升至94℃时，DNA分子变性，解开双螺旋结构；温度下降到50℃左右（56℃），引物与DNA单链结合，DNA恢复双螺旋结构，恢复活性；温度上升至72℃，DNA分子开始复制延伸，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

【答案】　C

3．有关PCR技术，下列叙述不正确的是（　　）

A．多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术

B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似

C．PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸

D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性、延伸

【解析】　PCR是多聚酶链式反应的英文缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板（母链）、酶、原料、引物等条件。

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步。

【答案】　C

1．PCR利用了DNA热变性的原理，PCR仪实际上是一种能自动调节温度的仪器。

下列关于PCR过程中温度控制的说法，错误的是（　　）

A．酶促反应需要高温，是为了保证模板是单链

B．延伸的温度必须高于退火的温度，而低于变性的温度

C．要用耐高温的DNA聚合酶

D．需要耐高温的解旋酶

【解析】　PCR是体外DNA扩增技术，DNA双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性。

【答案】　D

2．右图为DNA变性和退火示意图，下列相关说法正确的是（　　）

【导学号：

67850056】

A．向右的过程为加热（94℃）变性的过程

B．向左的过程是DNA双链迅速制冷退火

C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同

D．图中DNA片段共有4个游离的磷酸基、4个3′端

【解析】　变性后的DNA在缓慢降温后才会退火；变性与在生物体内解旋过程的条件不同，实质相同；任一DNA片段都有2个游离的磷酸基（5′端）和2个3′端。

【答案】　A

3．PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链做模板时将（　　）

A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸

B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸

C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸

D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链

【解析】　当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链做模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物Ⅱ结合延伸DNA子链。

【答案】　B

4．近十年来，PCR技术（多聚酶链式反应）成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

（1）加热使DNA双链打开，这一步是打开________键，称为________。

（2）当温度降低时，引物与模板________端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是________，遵循的原则是________。

（3）PCR技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个条件，即：

液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度由________自动调控，酸碱度则靠________来维持。

（4）DNA的复制需要引物，其主要原因是（　　）

A．可加快DNA的复制速度

B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合

C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链

D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链

【解析】　

（1）PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为变性。

（2）PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样，为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。

引物与模板的3′端结合后，DNA聚合酶才发挥作用。

（3）PCR技术除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度靠PCR仪自动调控，而酸碱度靠缓冲液来维持。

（4）引物的作用是结合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位点，而DNA聚合酶的作用是从引物的3′端开始催化DNA链的延伸，故选D。

【答案】　

（1）氢　变性　

（2）3′　四种脱氧核苷酸　碱基互补配对原则　（3）PCR仪　缓冲液　（4）D

课堂小结：

网络构建

核心回扣

1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

2.PCR反应需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。

3.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

4.PCR每次循环都包括变性、退火（复性）和延伸三步。

5.PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。

6.测定DNA分子的试剂是二苯胺。

DNA在酸性条件和加热下，能与二苯胺试剂生成蓝色的物质。

学业分层测评（十）

（建议用时：

45分钟）

[学业达标]

1．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是（　　）

A．PCR技术利用的是碱基互补配对原则

B．PCR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等

C．PCR技术需在体内进行

D．PCR技术可能为变性、退火、延伸三个阶段

【解析】　PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。

【答案】　C

2．下列有关PCR技术中引物的叙述，正确的是（　　）

A．引物是一小段DNA分子或双链RNA分子

B．扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目

C．两种引物之间能够发生碱基互补配对

D．DNA聚合酶只能从引物的5′端连接脱氧核苷酸

【解析】　引物是一小段单链DNA分子或单链RNA分子；在DNA分子扩增时，需要两种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，则扩增一个DNA分子至少需要的引物数目等于新合成的DNA子链数目；两种引物分别与DNA母链之间发生碱基互补配对，并不是两种引物之间发生碱基互补配对；DNA聚合酶只能从引物的3′端连接脱氧核苷酸，从而使子链DNA分子的复制方向只能是5′端→3′端。

【答案】　B

3．下列属于PCR技术的条件的是（　　）

【导学号：

67850057】

①单链的脱氧核苷酸序列引物　②目的基因所在的DNA片段　③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　⑥耐热的DNA聚合酶　⑦DNA限制性核酸内切酶

A．①②③⑤　　　　　　　B．①②③⑥

C．①②③⑤⑦D．①②④⑤⑦

【解析】　PCR技术的条件：

模板，本题为第②项；引物，本题为第①项；原料，本题为第③项；酶，本题为第⑥项。

【答案】　B

4．使用PCR仪具体实验操作顺序应为（　　）

①设计好PCR仪的循环程序　②按配方准备好各组分　③用自动取液器在微量离心管中依次加入各组分

④进行PCR反应　⑤离心使反应液集中在离心管底部

A．②③⑤④①B．①⑤③②④

C．②③⑤①④D．④②⑤③①

【解析】　PCR反应的操作步骤一般分为准备器材（包括配制配方及将各配方放于实验台上）→移液→混合→离心→反应，因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。

【答案】　C

5．下图是PCR反应过程中哪次循环的产物（　　）

A．第一次循环　　　　B．第二次循环

C．第三次循环D．第四次循环

【解析】　在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子代DNA中只有一种引物。

【答案】　A

6．DNA体内复制和PCR分别利用了DNA的哪种特性原理来控制DNA的解聚与结合（　　）

A．酶催化、特异性B．热变性、稳定性

C．酶催化、热变性D．热变性、多样性

【解析】　只有解开DNA双链，才能进行碱基配对，进行DNA的复制。

DNA体内复制时，通过解旋酶打开氢键。

PCR过程中，无解旋酶来打开双链中的氢键，因此DNA的解旋和复性都是通过控制温度来完成的，依据的原理是热变性。

【答案】　C

7．PCR实验中用到微量离心管、缓冲液和蒸馏水，使用前必须进行的关键步骤是（　　）

【导学号：

67850058】

A．反复洗涤B．用酒精擦洗

C．高压灭菌D．在－20℃保存

【解析】　在PCR实验中，为了避免外源DNA等因素的污染，微量离心管、枪头、缓冲液和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

同时也不能忽视其他操作步骤，如缓冲液和酶应该分装成小份，并且在－20℃保存。

【答案】　C

8．关于PCR技术的应用，错误的一项是（　　）

A．古生物学、刑侦破案、DNA序列测定

B．诊断遗传病、基因克隆、古生物学

C．DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案

D．诊断遗传病、合成核苷酸、DNA序列测定

【解析】　本题考查PCR技术在生活实践中的应用，目前常用于古生物学研究、刑侦破案、DNA序列测定、基因克隆、遗传病的基因诊断等方面。

【答案】　D

9．关于DNA分子测定的以下叙述，不正确的是（　　）

A．所用的试剂是二苯胺，该试剂分为A液和B液

B．在测定时应将0.1mLB液加入10mLA液中混匀后使用

C．在常温条件下进行测定，注意观察颜色的变化

D．根据蓝色的深浅，能粗略地比较出扩增前后溶液中DNA含量变化

【解析】　测定DNA分子应在沸水浴加热条件下进行，不能在常温条件下进行。

【答案】　C

10．在遗传病及刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。

据图回答相关问题：

（1）在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。

（2）在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。

（3）若将作为原料的4种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：

____________________________________________________________

____________________________________________________________

____________________________________________________________，

循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________。

（4）PCR反应过程的前提条件是________，PCR技术利用DNA的________原理解决了这个问题。

（5）在对样品DNA分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是________。

【解析】　

（1）DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH，复性结果为：

HO—A—G—5′

5′—G—G……T—C—3′。

（2）经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。

（3）由于作为原料的4种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA中各有一条链含32P，若复制n次，共产生子链2n×2，其中只有DNA母链不含32P，则其所占比例为2/（2n·2）＝1/2n。

（4）DNA复制是以两条母链为模板，按照碱基互补配对原则进行的。

因此，首先要解旋，使两条母链的碱基暴露出来，才能按照碱基互补配对原则把相应的碱基一个个地连接起来。

DNA分子在80～100℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。

（5）本题考查了DNA中杂质蛋白质的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。

【答案】　

（1）5′—G—A—OH　将HO—A—G—5′

填在复性步骤中5′—G—G……T—C—3′的上面

（2）3′—C—C……A—G—5′

5′—G—G……T—C—3′

5′—G—G……T—C—3′

3′—C—C……A—G—5′

（3）每个DNA分子各有一条链含32P　1/2n

（4）DNA解旋　热变性　（5）蛋白酶

[能力提升]

11．DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是（　　）

【解析】　PCR反应中DNA的扩增数目和生物体内的DNA复制是类似的，即1个DNA分子复制1次，产生2个DNA分子，复制2次，产生4个DNA分子，呈指数扩增，开始有1个DNA分子为模板，经过n次复制后得到的DNA分子的数量为2n，与曲线C相符合。

【答案】　C

12．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是

（　　）

①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA

②PCR过程不需要DNA聚合酶

③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的

④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制

A．③④B．①②

C．①③D．②④

【解析】　PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同：

一是PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸。

二是在PCR过程中，DNA解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。

【答案】　C

13．复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。

变性后温度快速冷却至40～60℃，可使