第一章 沉淀与膜分离.docx
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第一章沉淀与膜分离
高级生物化学（生化分离与分析技术或生物化学研究技术）
研究生的特点：
“研究”系统性、专一性。
各学科研究的共性：
机理的研究（物质基础—蛋白质），通过机理的研究，使研究者由一叶障目不见泰山一叶知秋（蛋白质种类与含量的变化）。
恩格斯曾说:
"生命是蛋白质的存在方式,这种存在方式本质上就在于蛋白质化学成分的不断自我更新."这就是说:
没有蛋白质的存在,也就没有生命。
本课程的主要内容：
沉淀技术、离心技术（常与沉淀技术结合使用）、层析（色谱）技术、电泳技术、免疫化学技术（与亲和层析有重叠）、酶分析技术、同位素示踪技术、蛋白质与核酸的序列分析技术。
以蛋白质为主线（因为还有基因工程原理课）。
生物化学与分子生物学研究技术：
生物化学与分子生物学研究技术是研究生物大分子最基本、最重要的技术之一，是生命科学发展过程中必不可少的重要组成部分。
生物化学与分子生物学研究技术都是以生物大分子为研究对象，是目前在生物大分子水平上研究的最常用技术。
生物化学研究技术是以蛋白质研究技术为主，介绍一些相关生物化学技术如：
光谱技术、色谱技术、蛋白质电泳技术、蛋白质测序技术、超离心技术等。
分子生物学研究技术是以核酸化学为主介绍一些相关的研究技术：
如基因构件、分子克隆、DNA测序、核酸电泳等技术。
从基因工程或蛋白质工程的角度说分子生物学研究技术称之为基因工程上游技术，生物化学研究技术称之为基因工程下游技术。
前者具有一定的共性，后者具有一定的个性特点。
但是从广义上来说许多技术的分析原理都是相同的，只是在实际应用中各有侧重。
生物工程下游技术：
泛指从工程菌或工程细胞的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量监测所需要的一系列操作技术。
其中产品的分离纯化是最重要的部分。
主要包括离心、沉淀、膜分离、色谱分离、电泳分离等。
目标产品蛋白质的分析检测：
1.蛋白质的含量与纯度；2.氨基酸分析；3.蛋白质的分子量测定；4.等电点；5.肽谱分析（结合裂解方法）；6.蛋白质的突变点分析（酶）；7.二硫键分析；8.序列测定；9.蛋白质翻译后修饰的分析。
随着蛋白质组计划的展开，下游技术显得越来越重要，以致多数用人单位要求熟悉“色谱技术等下游技术”本课程采用讨论式欢迎大家提出问题、积极参与讨论！
参考书目
1．赵永芳编著，生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，1995年7月第二版
2．（美）C.W.迪芬巴赫等著，黄培堂等译，PCR技术实验指南，科学出版社，1998年8月第一版，1999年4月第二次印刷
3．（美）F.奥斯伯等著，颜子颖等译，精编分子生物学实验指南，科学出版社，1998年6月第一版
4．杨安钢、毛积芳、药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年2月第1版
5.陈毓荃主编，生物化学实验方法和技术，科学出版社，2002年8月第一版
前序：
要从生物体内获得某一组分进行分析与研究，首先要确定取样对象及其部位！
一、取样的原则
1、取样的代表性：
代表研究对象的本质，从自然群体或待研究的群体中取样；样本量小于30份为小样本，大于30则为大样本；研究病例时，可能只有一个样本，难于总结出规律（只能对症医治）
2、部位：
表现研究特征与本质的部位，越精细越好，如：
表现特征的部位，缺锌的叶主脉两侧、缺钙的根尖、茎尖等停长坏死。
研究癌细胞就要从癌组织中取样。
细胞分化常常从某一个细胞或几个细胞开始，所以取样要精细，才能有针对性。
二、提取与分离或制备样品分子
1.生化分离分为分离分析与分离制备，分离分析即分离各组分，而进行定量与定性鉴定，不一定把某组分从混合物中分离提取出来，如，氨基酸的定性与定量分析。
分离制备则是为获得某一单纯组分。
并有活性或生理功能，这与其结构有关，所以，生化分离与化学分离不同，要保证其结构和性质不改变。
有如下特点：
⑴成分复杂且时刻在发生代谢变化。
⑵有的含量很少，用材料多。
如，激素、酶等。
⑶离开活体易变性，所以条件要温和，且低温使代谢减慢不变质。
⑷都在溶液中进行，影响因素多，要重复性好，就必须严格规定材料、方法、条件与试剂等。
⑸均一性鉴定需多种方法：
层析、电泳、染料显色、理化特性分析等。
故生化分离与制备大都根据混合物中不同组分分配率的差别（顺其自然，先试验再总结规律，用于实践），将它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（如有机溶剂抽提油脂、盐析、结晶等沉淀分离蛋白），或将混合物置于某一物相中（多是液相），外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域而分离（如电泳、超离心、超滤等）。
先介绍溶剂提取、沉淀、膜分离、浓缩与干燥。
现代生化分离制备常用沉淀、离心、层析、电泳四大技术。
第一节溶剂提取法
利用溶剂的溶解作用，从细胞中提取所需物质，这里影响物质溶解度即影响提取的因素主要有：
1．溶质的性质：
如，DNA、RNA易溶于盐溶液中【DNA提取缓冲液（500mMNaCl、100mMTris·HCl、50mMEDTA）】，微溶于水，不溶于有机溶剂。
蛋白质中清蛋白：
溶于水与稀盐溶液；球蛋白不溶于水，溶于稀盐；谷蛋白可溶于稀酸稀碱，但不溶于水……
2．溶剂的性质，⑴相似相溶原理（极性）。
⑵酸、碱互溶机制：
碱性物质易溶于酸性溶剂中，反之亦然；⑶极性溶剂中，溶解极性物质，溶剂的介电常数减小一些溶质的溶解度就减小。
可通过丙酮等沉淀一些蛋白。
3．离子强度：
I=1/2ΣCZ2（Z：
离子价数，C：
离子的摩尔浓度）高盐中DNA溶解度大，低离子强度下RNA溶解度大，0.14mol/LNaCl中可溶出RNA而沉淀DNA（一般以2mol/L氯化钠溶解）。
蛋白质在稀盐中，比水中溶解度大，称为盐溶效应，此乃少量离子的活动，减少了蛋白质分子极性基团之间的静电引力，加强了蛋白质与溶剂间的相互作用之故。
低盐还可稳定一些物质的生理活性，所以生化物质多用之提取。
4．pH：
溶剂的pH值影响溶质的解离状态，离子态易溶于水，分子态则易溶于有机溶剂，酸性物质在低pH下或碱性物质在高pH下均可转溶于有机溶剂，两性物质在等电点之外，均成离子态，所以AA一般不用有机溶剂提取。
Pr、酶等还要考虑pH对其活性的影响，一般控制在pH6～8左右，避免过酸、过碱。
5．温度：
高温时溶解度增大，但易变性，绝大多数生物大分子，提取温度选在0～10℃，避免变性。
6．去够剂（双亲物质）：
具有乳化、分散和增溶作用；有阴、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂有Tween20、40、60、80（聚氧乙烯（20）山梨醇酐单油酸酯），TritonX-100（非离子型系列去污剂的商品名）等，对蛋白质和酶的变性影响较小，宜用于蛋白质与酶的提取，常用的阴离子去垢剂SDS（十二烷基硫酸钠）可促进核蛋白的解体（使蛋白变性），释放出核酸，并抑制核酸酶，所以，常用于核酸的提取。
提取酶等的新鲜材料的储存：
保鲜的最佳方法是冷冻贮藏：
冰壶、冰袋、冰箱、冷藏库等。
组织细胞内蛋白质的提取：
组织细胞的破碎：
⑴研磨法：
研钵等需预冷，磨料石英沙等要洗净消毒（幼嫩组织可不加）；以预冷的水或缓冲液抽提。
⑵渗透压法：
动植物组织在0～4℃下，用20%蔗糖的缓冲液处理1～2h而后转入无蔗糖的水或缓冲液内，使细胞破裂。
突然吸水胀破！
多用于动物细胞和幼嫩的植物细胞（成熟的壁厚不易破）
⑶自溶法：
自溶法是在一定的pH和适当的温度下,利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法.自溶法所需时间较长,常添加少量防腐剂如甲苯,氯仿等防止细菌的污染.
⑷酶解法：
以溶菌酶（破坏糖苷键，属单纯蛋白质）破壁，多与EDTA（抑制其他酶）结合使用。
如细菌DNA提取，加EDTA可抑制核酸酶活性。
⑸冻融法：
-20℃下冻结，让冰晶（4℃时体积最小）破坏细胞（可先吸水）。
并可保持酶活性。
如动物酶的提取。
⑹超声波法：
超声波的空化作用，使不同部位产生压力差，迫使细胞破碎，此法适于悬浮样品。
超声波破碎作用基本原理：
超声波在媒质中传播可使媒质质点在其传播空间内进入振动状态强化溶质扩散、传质，即超声波机械机制。
超声波在媒质质点传播过程中其能量不断被媒质质点吸收变成热能，导致媒质质点温度升高，即超声波热学机制。
同时当大能量的超声波作用于提取介质，在振动处于稀疏状态时，介质被撕裂成许多小空穴，这些小空穴瞬时即闭合，闭合时产生高达几千大气压的瞬时压力，即空化现象。
超声法输入高能超声波可以破碎细胞，其机理与超声波作用溶液时的气泡产生、长大和破碎的空化现象有关。
空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解。
超声波破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等。
超声波破碎在处理少量样品时操作简便,效率高,液量损失少,适于实验室使用。
但应注意的是超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活,另外噪声也比较大。
⑺匀浆器法：
使细胞在高压摩擦下破裂或通过微孔而被挤破。
经过以上步骤将细胞中的组分集中溶在溶剂中。
如何分离？
第二节沉淀法（分离）
用于浓缩、纯化、利于保存
方法有：
盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、非离子多聚体沉淀法、生成盐复合物沉淀法、加热及酸碱变性沉淀法和专一性沉淀法。
1．盐析法：
盐溶与盐析——蛋白质胶体只在某一特定的低盐浓度下溶解度最大，少量离子可减少蛋白质分子极性基团之间的静电引力，加强蛋白质与溶剂之间的作用力（同时减弱蛋白质分子间的引力）——盐溶；但盐浓度增大到一定程度时，会破坏蛋白质表面的水化膜、并中和掉其表面的电荷，进而使蛋白质分子之间相互聚集而沉淀——盐析。
所以可用盐沉淀。
影响蛋白质盐析的因素：
⑴蛋白质浓度：
太浓易出现共沉淀，太稀时盐的消耗量太大，蛋白质回收率也低。
以2.5～3.0%较好（含量测定）。
蛋白质制备前期，保持一定的pH和温度而改变盐浓度，后期分离纯化，则保持一定的盐浓度而改变pH和温度（微调）。
⑵离子强度与类型：
各离子与蛋白质分子间争夺水分子，破坏其水和膜，使蛋白质溶解度减小而沉淀，离子浓度越大，越易盐析沉淀。
不同蛋白质所需的离子强度不同，所以可分步盐析。
离子半径越小，价数越高的离子（吸水能力强）盐析作用越强，所以，不同离子沉淀能力不同。
⑶pH：
影响蛋白质所带电荷，蛋白质所带静电荷越多，溶解度越大，等电点时溶解度最小。
所以盐析时可调节pH到pI（左右）。
⑷温度：
要求不严格，一般用低温，可防止蛋白质变性而丧失生理活性。
同时，低温时多数蛋白的溶解度低；不需活性的可用热变性沉淀。
如，硫酸铵盐析法：
各种中性盐均可，但硫酸铵价格便宜，溶解度大，且其溶解度受温度变化影响小，但因含氮，对蛋白质分析有影响（弊）。
用时要注意：
1.保证纯度，可重结晶后再用（去除重金属离子），其溶液成酸性，要用氨水（不要用NaOH）或H2SO4（不用HCl）调成所需的pH。
（防氨蒸发和Cl离子污染）
2.硫酸铵的饱和度及其调整法：
饱和状态时的饱和度为100%，不同饱和度的调整：
通常硫酸铵的添加以百分饱和度来表示（不是浓度百分比），例如大部分蛋白质可在80%硫酸铵饱和度下沉淀。
因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的体积，很难由浓度百分比来计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。
⑴加入固体盐法：
要求饱和度高又不增大溶液体积时用（样品少时）。
要磨细，在搅拌下、缓慢加入，各种分离分析技术工具书中均有附表，可按此加入。
硫酸铵的饱和度亦可直接加入固体硫酸铵调节，其加入量可按下式计算：
x=G（S2-S1）/（1-AS2）其由来：
x+1*S1G=（1+xB）*S2G=S2G+S2GxB
令B*G=A则x+S1G=S2G+AS2xx（1-AS2）=S2G-S1Gx=G（S2-S1）/（1-AS2）式中X是将1升饱和度为S1的溶液提高到饱和度为S2时所需硫酸铵的重量（g），G（由饱和度转化为重量的系数均值）及A（B为将重量x换算为体积的常数）为常数，与温度有关。
G在0℃时为488.34，20℃时为533；A在0℃时为0.356，20℃时为0.29。
G在25℃时为541，A在25℃时应为0.3
1.调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25℃）
硫酸铵终浓度,%饱和度（25℃）
10
20
25
30
33
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
90
100
每1升溶液加固体硫酸铵的克数
硫
酸铵
初
浓
度
，
%
饱和
度
0
56
114
144
176
196
209
243
277
313
351
390
430
472
516
561
662
767
10
57
86
118
137
150
183
216
251
288
326
365
406
449
494
592
694
20
29
59
78
91
123
155
190
225
262
300
340
382
424
520
619
25
30
49
61
93
125
158
193
230
267
307
348
390
485
583
30
19
30
62
94
127
162
198
235
273
314
356
449
546
33
12
43
74
107
142
177
214
252
292
333
426
522
35
31
63
94
129
164
200
238
178
319
411
506
40
31
63
97
132
168
205
245
285
375
469
45
32
65
99
134
171
210
250
339
431
50
33
66
101
137
176
214
302
392
55
33
67
103
141
179
264
353
60
34
69
105
143
227
314
65
34
70
107
190
275
70
35
72
153
237
75
36
115
198
80
77
157
90
79
指在25℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液所加固体硫酸铵的克数。
2.调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0℃）
在0℃硫酸铵终浓度,%饱和度
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
每100毫升溶液加固体硫酸铵的克数
硫
酸铵
初
浓
度
，
%
饱和
度
0
10.6
13.4
16.4
19.4
22.6
25.8
29.1
32.6
36.1
39.8
43.6
47.6
51.6
55.9
60.3
65.0
69.7
5
7.9
10.8
13.7
16.6
19.7
22.9
26.2
29.6
33.1
36.8
40.5
44.4
48.4
52.6
57.0
61.5
66.2
10
5.3
8.1
10.9
13.9
16.9
20.0
23.3
26.6
30.1
33.7
37.4
41.2
45.2
49.3
53.6
58.1
62.7
15
2.6
5.4
8.2
11.1
14.1
17.2
20.4
23.7
27.1
30.6
.4.3
38.1
42.0
46.0
50.3
54.7
59.2
20
0
2.7
5.5
8.3
11.3
14.3
17.5
20.7
24.1
27.6
31.2
34.9
38.7
42.7
46.9
51.2
55.7
25
0
2.7
5.6
8.4
11.5
14.6
17.9
21.1
24.2
28.0
31.7
35.5
39.5
43.6
47.8
52.2
30
0
2.8
5.6
8.6
11.7
14.8
18.1
21.4
24.9
28.5
32.3
36.2
40.2
44.5
48.8
35
0
2.8
5.7
8.7
11.8
15.1
18.4
21.8
25.4
29.1
32.9
36.9
41.0
45.3
40
0
2.9
5.8
8.9
12.0
15.3
18.7
22.2
25.8
29.6
33.5
37.6
41.8
45
0
2.9
5.9
9.0
12.3
15.6
19.0
22.6
26.3
30.2
34.2
38.3
50
0
3.0
6.0
9.2
12.5
15.9
19.4
23.0
26.8
30.8
34.8
55
0
3.0
6.1
9.3
12.7
16.1
19.7
23.5
27.3
31.3
60
0
3.1
6.2
9.5
12.9
16.4
20.1
23.1
27.9
65
0
3.1
6.3
9.7
13.2
16.8
20.5
34.4
70
0
3.2
6.5
9.9
13.4
17.1
20.9
75
0
3.2
6.6
10.1
13.7
17.4
80
0
3.3
6.7
10.3
13.9
85
0
3.4
6.8
10.5
90
0
3.4
7.0
95
0
3.5
100
0
指在0℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每100毫升溶液所加固体硫酸铵的克数。
⑵加入饱和溶液法:
V=V0（S2-S1）/（1-S2）S1、2分别为调整前后的饱和度
因为：
V0×S1＋V×1=（V0+V）*S2V0*S2+V*S2=V0×S1＋V×1
V×1-V*S2=V0*S2-V0*S1V=V0（S2-S1）/（1-S2）
⑶透析平衡法：
将待透析的样品溶液装入透析袋中，浸入饱和硫酸铵溶液中进行透析（反向），使外部的硫酸铵靠扩散作用不断进入透析袋中，逐步达到所需的盐析饱和度，使蛋白质沉淀，此时停止透析。
因硫酸铵浓度变化是连续的，所以盐析效果较好，多用于蛋白质的结晶。
注意问题：
1.加入硫酸铵（固液）时要在搅拌中缓慢加入，以免局部浓度过高造成共沉淀影响分离。
分不开各段都有。
研究时尽量不用，而用加入饱和溶液的方法。
2.要保证盐析条件的稳定性，如pH、温度及硫酸铵的纯度等。
摸索条件，以后备用，也作为蛋白的一个特性。
3.盐析后要放置0.5-1小时，待沉淀完全后再分离（沉淀需要过程）（离心或过滤），以免影响回收率。
4.分离沉淀时，低浓度硫酸铵溶液用离心分离，高浓度时则用过滤，因为此时需要较高的离心速度与时间，所以不如过滤快。
如：
超氧化物歧化酶（SOD）的分段分离蚯蚓SOD主要在70-80%硫酸铵饱和液的沉淀中。
杂质中有共沉淀的SOD.测定及纯化需透析除盐。
二、有机溶剂沉淀法
降低溶液的介电常数（束缚电荷的能力），增加溶质分子间的相互作用，使溶解度减小，同时还有破坏溶质分子表面水化膜的作用，使大分子溶质脱水而相互集聚析出。
V=V0（S2-S1）/（S3-S2）S3：
表示需要加入的有机溶剂的浓度。
S1、S2分别表示原浓度和所要达到的浓度。
有机溶剂沉淀法比盐析法分辨能力高，且不用脱盐，易于过滤；但易引起生物大分子变性，常需在低温下操作。
最常用的是乙醇、丙酮等。
样品浓度要适宜，过浓易引起共沉淀（近饱和时）和溶质变性，过稀回收率低；此外，pH值、离子强度与种类也应使溶质的溶解度最低才好。
三、等电点沉淀法：
在等电点时，两性电解质的净电荷为零，这样的物质分子在溶液中因为没有相同电荷而相互排斥的影响，极易借静电引力迅速结合成较大的聚集体，而沉淀析出，所以这时最不稳定，溶解度最小。
不同的两性电解质因pI不同，故可用之分离，如氨基酸、蛋白质（酪蛋白）、核苷酸等，常与盐析、有机溶剂沉淀等一起使用，提高沉淀效果。
四、非离子多聚物沉淀法：
如PEG（聚乙二醇）、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠（右旋糖酐系葡萄糖组成的多糖,右旋糖酐硫酸钠是带有电荷的葡聚多糖）、聚丙烯酰胺干凝胶等，通过空间位置排斥使溶液中的溶质颗粒被挤在一起而引起沉淀，此法不易引起生物大分子变性，同时沉淀效能高，沉淀后多聚物易于除去，所以多用于核酸、蛋白质及酶的沉淀分离，有两种操作方法：
1.用两种非离子多聚物，组成液液两相系统（互不相溶的），使生物大分子在两相中不等量分配而分离，如可用葡聚糖和聚乙二醇为两相系统分离单链DNA、双链DNA和多种RNA制剂；在20世纪六十年代，聚乙二醇开始用于蛋白质纯化，其分子量多在2000-6000之间变化，多
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