离心分离和沉淀分离.ppt

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离心分离,0概述,固液分离的常用手段分类：

离心沉降离心过滤超离心,1离心沉降原理,球形粒子沉降,在离心力场中,1离心沉降原理,常速离心机-中速离心机高速离心,离心机的种类与用途,按速度和离心力：

1、常速离心机最大转速8000rpm（r/min）,相对离心力（RCF）104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机1104-2.5104rpm，相对离心力104105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机转速2.5-8104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。

瓶式离心机,1）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机，指离心管腔与转轴成一定倾角的转子；角度越大，沉降越结实，分离效果越好，角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。

颗粒在角转子中沉降时，先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积。

2）平抛式离心机平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。

转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200800rpm）。

颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。

样品便于收集受振动和变速搅乱后对流现象小，但转头结构复杂，最高转速相对要低容量也小一些。

平抛式离心机转子,2离心沉降设备,瓶式离心机,也称平抛式离心机结构最简单的实验室常用的低，中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。

2离心沉降设备,管式离心机,液-液分离；液-固分离结构简单转速很高可连续操作（液-液）,2离心沉降设备,碟式离心机,固体的沉降距离极短，分离效果较好。

碟片间的距离一般为0.52.5mm,与被分离物料的性质有关。

液-液分离；液-固分离连续操作,2离心沉降设备,多室式离心机,增加了沉降面积，减少了沉降距离同时还有粒度筛分的作用常用于抗菌素液液萃取分离间歇式生产,管式离心机,3离心沉降的计算,r,z,管壁,沉淀分离,概述,沉淀（定义）是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。

沉淀具有选择性有选择地沉淀杂质有选择地沉淀所需成分,优点：

操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：

针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强,概述,沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行。

操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。

不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：

蛋白质的溶解特性,蛋白质是两性高分子电解质在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。

疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。

亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。

蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。

蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域,概述,沉淀法操步骤：

沉淀剂,粒子生长,收集沉淀物,过滤,离心,概述,沉淀法,

（1）盐析法；

（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）高价金属离子沉淀法等。

除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子。

分类,蛋白质盐析,因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。

蛋白质稳定因素,水化层,双电层,使蛋白质形成稳定的胶体溶液,静电排斥作用,蛋白质盐析,中性盐,蛋白质脱水,中和电荷,沉淀,盐析法机理,

（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。

（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。

（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。

蛋白质盐析,盐析用盐的选择,盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济,盐析操作,蛋白质盐析,直接加入固体（NH4）2SO4粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或（NH4）2SO4浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。

蛋白质盐析,阴离子：

柠檬酸PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-阳离子：

NH4+K+Na+高价阳离子硫酸铵：

（1）价廉；

（2）溶解度大，稳定蛋白质；（3）水解变酸；（4）高pH释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。

盐析效果,影响因素,蛋白质盐析,pH变化,温度变化,等电点附近有极小值,随温度升高减小，热促失水膜,lgS,蛋白质盐析,盐析注意事项：

（1）稳定pH用磷酸缓冲液

（2）硫酸铵加入后体积变大（3）选择饱和度（4）分步盐析（5）初始蛋白浓度,S=-sS蛋白质的溶解度，g/L;I离子强度，I=1/2mizi2mi离子i的摩尔浓度；Zi所带电荷常数，图中截距Ks盐析常数，图中直线斜率,Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系,等电点沉淀法,原理：

调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。

适用于疏水性较强的蛋白质,pH=pI,等电点沉淀法,

（1）适用于疏水性强的蛋白质

（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。

（3）无机酸通常价格便宜，无毒（4）蛋白质对低pH敏感，易失活,操作注意事项,等电点沉淀实例,从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：

胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质（pI=3O）。

工业生产胰岛素（pI5.3）时：

先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质（同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果）。

等电点沉淀法,细胞色素C洗脱液（离交）+硫酸胺（饱和度86%）低温离心上清液调pH4.8-5.1产物沉淀（杂蛋白）,有机溶剂沉淀法,概念：

在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

优点在于：

1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。

3）成本高,A降低溶剂介电常数.B破坏水化膜：

C相反力：

有机溶剂沉淀法机理,减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，,从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层,疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层,降低介电常数破坏水化膜,常用的有机溶剂沉析剂,选择依据：

水溶性要好介电常数要小致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中容易获取沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。

沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。

乙醇是最常用的沉淀剂乙醇：

沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：

沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；,温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，,有机溶剂沉淀法的影响因素,pH值：

pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。

举例：

固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究-淀粉酶（米曲霉）菌体+水过滤水抽提清液加乙醇（70%）搅拌-淀粉酶,*pH影响收率%酶活收率酶活6.5pH*适宜的pH5.66.0,*温度影响收率%酶活酶活收率1020T*适宜的温度1020,例：

调pH4.2上清液胰岛素粗品溶液30%丙酮沉淀（杂蛋白）调pH6.0上清液Zn2+胰岛素锌盐,