反向遗传在RNA病毒中的应用.pptx

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（一）概念

（二）研究背景介绍研究进展DNA病毒反向遗传操作正链RNA病毒的反向遗传操作负链RNA病毒的反向遗传操作,一、反向遗传在RNA病毒中概述,

（一）概念：

经典遗传学（正向遗传学）：

表型基因经典遗传学是从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。

反向遗传学：

基因表型反向遗传学指直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象。

（一）概念,RNA病毒的反向遗传操作：

指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆,在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作,如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造,以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究,以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制。

（二）研究背景介绍,1.研究进展：

Q噬菌体是第一个在基因水平上进行遗传修饰的RNA病毒。

首先成功拯救出有感染性的病毒是单分子不分节段负链RNA病毒目中的狂犬病病毒，随后,其它一些不分节段的负链RNA病毒也相继用感染性cDNA克隆技术获得成功,包括水泡性口炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、呼吸道合胞体病毒、人副粘病毒3型、传染性猴病毒5型、新城疫病毒和犬瘟热病毒等。

长达27kb的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）RNA得以克隆是现今克隆的最长的cDNA。

流感病毒是反向遗传技术应用于负链分节段RNA病毒的成功范例。

（二）研究背景介绍,2.DNA病毒反向遗传操作：

在DNA病毒、正链RNA病毒和负链RNA病毒中，对于DNA病毒进行的基因操作困难最小，因此最先开始进行。

策略：

使用编码病毒基因组的质粒转染细胞，亦或通过对携带病毒基因组序列的质粒之间进行异源重组来得以实现。

（二）研究背景介绍,3.正链RNA病毒的反向遗传操作：

由于病毒基因组即是mRNA，并具有感染性，因此简单地将含有病毒基因组的质粒或从质粒体外转录来的RNA转染敏感细胞，便可获得完整的有感染性的病毒。

虽然通常认为获得感染性克隆需全长病毒序列,但病毒不完全cDNA克隆也会产生感染性转本。

（二）研究背景介绍,4.负链RNA病毒的反向遗传操作：

负链RNA病毒基因组进行人工操作较正链RNA病毒困难：

负链RNA病毒裸露的基因组RNA或由cDNA克隆转录的RNA本身没有感染性,因为负链RNA病毒的复制需要病毒核蛋白和聚合酶，才能表达和包装出活病毒。

反向遗传在负链RNA病毒中的应用,二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用

（一）、流感病毒的反向遗传操作

（二）、反向遗传操作在鸡新城疫病毒的应用（三）、反向遗传操作在其它负链RNA病毒的应用反向遗传操作在布尼亚病毒应用反向遗传操作在狂犬病毒的应用反向遗传操作在埃博拉病毒应用,二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,完整的负链RNA病毒主要跨越了六个病毒科：

未分节段的杆状病毒科、负粘病毒科、丝状病毒科及分节段的正粘病毒科（8节段）、布尼亚病毒科（3节段）、沙拉病毒科（2节段）。

目前已在流感病毒、鸡新城疫病毒、布尼亚病毒、埃博拉病毒、狂犬病病毒上成功拯救!

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

流感病毒的基因组结构：

流感病毒属单股负链RNA病毒，由大小不等的8个独立片段组成。

这8个基因片段编码10个基因产物，其中片段1-3分别编码PB2、PB1、PA聚合酶，片段4和片段6分别编码血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），片段5编码核蛋白（NP），片段7编码病毒基质蛋白Ml和离子通道蛋白M2，片段8编码非结构蛋白NS1,NS2。

PB1、PB2和PB3与NP蛋白和病毒RNA相连接，构成病毒特异性的聚合酶蛋白复合体（RNPs），具有转录和核酸内切酶的活性，是病毒拯救所必需。

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

流感病毒复制过程：

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

2.LuytiesW等（1989）首先用包含流感病毒基因组末端序列及氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因的转录本,在纯化的流感病毒核衣壳蛋白（NP）及聚合酶蛋白（PA,PB1,PB2）的参与下,在体外包装，再转染已用流感病毒感染的MDCK细胞，产生了含CATRNA和其它8片段的子代病毒。

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

3.Fodor等（1999年）首次通过12个质粒系统，不借助辅助病毒拯救出流感病毒，其中8个含有人源polI启动子和丁型肝炎病毒核酶序列调控的转录质粒（transcriptionplasmid）分别克隆出8条流感vRNA，另4个表达质粒pGT表达出PB1,PB2,PA和NP蛋白；,二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

12质粒拯救流感病毒流程图：

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

4.Hoffman等（2000年）在此基础上进行改进，通过8个质粒共转染，成功地拯救出流感病毒，主要方法是构建含有polI-polII双启动子的质粒载体，在polI启动子与终止子间插入polII启动子和多聚腺苷酸，再将病毒基因插入该系统，利用细胞酶系统拯救出流感病毒,二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

构建的polI-polII双启动子质粒载体,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

TheprocedureforTransfectionVirusesproducedinthe293TcellsaftertransfectioncantheninfectMDCKcellsandreplicate.,二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（一）、流感病毒的反向遗传操作：

Theeight-plasmidpolIpolIIsystemforthegenerationofinfluenzaAvirus.,在拯救流感病毒过程中，发现若缺少NS1基因，无法拯救出流感病毒。

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（二）、反向遗传操作在鸡新城疫（NDV）病毒中的应用反向遗传技术用于拯救负链RNA病毒的另一策略是利用痘苗病毒所建立的拯救系统：

表达病毒蛋白的质粒表达T7RNA聚合酶的重组痘病毒以及含有病毒cDNA（常带有报告基因）的质粒并将其共转染来获得具有感染性的病毒粒子，这一技术1994年首先用于拯救狂犬病病毒。

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（二）、反向遗传操作在鸡新城疫（NDV）病毒中的应用1999年，Romer利用痘苗病毒拯救系统拯救了NDV具体方法：

是将NDVcDNA置于噬菌体T7RNA聚合酶启动子和-肝炎病毒终止子之间将含有NDVcDNA的质粒和表达NP、P、L蛋白的质粒共同转染稳定表达T7RNA聚合酶的BHK21细胞，获得了NDV具有亲本NDV特性的克隆毒株,二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,

（二）、反向遗传操作在鸡新城疫（NDV）病毒中的应用同年，Peeter等利用反向遗传方法直接证明F0蛋白是决定NDV毒力的主要原因。

对NDV的感染性分子克隆F0切割位点进行改造，将F0切割位点的氨基酸序列从GGRQGRL/L转变为GGRQORR/F时，病毒的毒力显著增强。

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,（三）、反向遗传操作在其它负链RNA病毒的应用利用痘苗病毒拯救系统还成功拯救了狂犬病毒、布尼亚病毒、埃博拉病毒。

痘苗病毒拯救系统拯救Ebola病毒示图：

二、反向遗传在负链RNA病毒中的应用,（三）、反向遗传操作在其它负链RNA病毒的应用利用反向遗传方法研究基因的功能特性L和N蛋白在布尼亚病毒病毒转录和复制中是必需的，NSs对病毒RNA的复制和转录是非必需的。

研究埃博拉病毒糖蛋白（GP）反义后切割对病毒复制的影响，发现GP切割并不重要。

三、反向遗传引起的思考,1.应用RNA病毒反向遗传系统重现病毒的生活周期和感染模式,对阐明病毒的起源和致病机制提供一种切实可行的方法。

2.开展病毒拯救的机制研究，通过重拯RNA病毒，为在基因水平对RNA进行基因操作，研制出服务于人类的疫苗创造条件。

3.科学的双刃剑，提示我们反向遗传技术可能被用来研制生化武器，给人类造成危害。