活性污泥相及大肠杆菌培养及染色实验.docx
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活性污泥相及大肠杆菌培养及染色实验
实验三微生物菌体的革兰氏染色镜检实验
一、实验目的
1．熟练掌握显微镜的使用。
2．掌握单染及革兰氏染色原理及实验技术。
二、实验原理
一般微生物尤其是细菌菌体是无色透明的，在光学显微镜下，细胞体液及结构的折光率与其背景相差很小，因此在普通光学显微镜下难以分辨其细胞结构及形态，菌体染色后与背景的折光指数差异增大，提高了分辨率，增加了细胞的反差，所以就较易观察。
1．单染原理
细菌菌体内含大量蛋白质，蛋白质分子中有羧基及氨基，当在某一pH值溶液中时，蛋白质所带正负电荷相等，此时pH值就称作此蛋白质的等电点。
同样，在等电点的pH值时，细菌所带的正负电荷相等。
细菌的等电点大约在pH值2~5左右。
当环境pH值比细菌细胞等电点pH值高时，细胞带负电荷，碱性染料（带正电荷）作为阳离子可与带负电荷的细胞结合着色。
同样环境pH值比细菌细胞等电点pH值低时，细胞带正电荷，酸性染料（带负电荷）作为阴离子与带正电荷的细胞结合着色。
2．革兰氏染色原理
细菌的等电点大致在pH值2~5之间，由于细菌菌种不同，所以等电点也不同，大致可分为两大类：
一类为革兰氏阳性菌，其等电点在pH值2~3之间；另一类为革兰氏阴性菌，等电点在pH值5左右。
在这两类之间为一些革兰氏染色不稳定的细菌。
（1）染色作用：
初染时结晶紫为碱性染料（着色原理同单染），革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌等电点低，所以在同一pH值时，革兰氏阳性菌所带负电荷比革兰氏阴性菌多，因而革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌摄取结晶紫染料多。
（2）助染作用：
碘进入菌体细胞内与结晶紫形成一种不溶于水稍溶于乙醇和丙酮的混合物，碘还能降低细菌的等电点增加摄取染料作用，碘又能与蛋白质中巯基（–SH）作用，帮助染料与菌体蛋白结合。
（3）脱色作用：
革兰氏阴性菌细胞壁较革兰氏阳性菌薄，且脂类含量高，当加乙醇时，由于革兰氏阴性菌细胞壁薄，乙醇较易透入，同时乙醇可溶解脂类物质，抽掉革兰氏阴性菌中脂类物质增加了革兰氏阴性菌的通透性，于是革兰氏阴性菌细胞中的结晶紫与碘的复合物较易被抽提出来。
革兰氏阳性菌细胞壁较厚而均匀且通透性较小，结晶紫与碘的复合物被保留在细胞内，在同样的时间内不易脱色。
（4）复染作用：
使已经脱色的革兰氏阴性菌着染。
三、实验仪器及材料
1．显微镜。
2．酒精灯。
3．载玻片、盖玻片。
4．接种环、接种针。
5．香柏油（或液体石蜡）。
6．滴瓶
四、染色液
1．结晶紫溶液
结晶紫乙醇饱和溶液（取结晶紫约4~8g溶于95%乙醇100mL中）20mL，1%草酸铵溶液80mL，将上述两溶液混合，过滤。
该溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
2．助染剂
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300mL
将碘与碘化钾混合，加入少许蒸馏水，充分振摇。
待完全溶解后再加入其余的蒸馏水。
当溶液由棕黄色变为淡黄色时即应弃去。
为易于储备，可将上列碘与碘化钾溶于30mL蒸馏水中，用前稀释。
3．脱色剂
95%乙醇
4．复染剂
沙黄0.25g
95%乙醇10mL
蒸馏水90mL
将沙黄溶于95%乙醇中，待完全溶解后加入蒸馏水。
五、实验步骤
1．将培养22~24小时的培养物涂片，要涂得薄些。
2．将涂片在火焰上加温固定，待冷却后滴加结晶紫溶液，1分钟后水洗。
3．滴加助染剂，1分钟后水洗。
4．滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止（约20~80s）水洗。
5．滴加复染剂，1分钟后水洗，凉干，镜检（显微镜的使用方法见附录一），呈紫色者为革兰氏阳性菌，红色者为革兰氏阴性菌。
实验四水中总大肠菌群的测定
（滤膜法）
一、实验目的
1．掌握培养基的制备方法。
2．熟悉滤膜法测定总大肠菌群的全过程。
二、实验原理
用滤膜法测定的总大肠菌群是指所有能在含乳糖的品红亚硫酸钠培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
滤膜是一种微孔薄膜。
将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在滤膜上，然后将滤膜贴于品红亚硫酸钠培养基上，进行培养。
因大肠菌群细菌可发酵乳糖，在滤膜上出现紫红色具有金属光泽的菌落等，计数滤膜上生长的此类特性的菌落数，计算出每1L水样中含有总大肠菌群数。
如有必要，对可疑菌落应进行涂片染色镜检，并再接种乳糖发酵管做进一步鉴定。
三、实验仪器及材料
1．显微镜。
2．高压蒸汽灭菌器。
3．干热灭菌箱。
4．冰箱。
5．恒温培养箱。
6．无菌操作台。
7．真空泵。
8．滤器：
容量500mL。
9．滤膜：
多孔性硝化纤维薄膜，孔径0.45μm，直径47mm，厚0.1mm。
10．酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环、接种针、香柏油（或液体石蜡）。
11．无齿镊子。
12．脱脂棉。
13．平皿（直径9cm）。
14．2000mL烧杯、500mL三角烧瓶。
15．1mL、10mL、20mL刻度吸管。
16．15×150、20×200试管、小玻璃倒管。
四、培养基
1．品红亚硫酸钠培养基
蛋白胨10g
牛肉浸膏5g
酵母浸膏5g
乳糖10g
琼脂20g
磷酸氢二钾3.5g
蒸馏水1000mL
无水亚硫酸钠5g
5%碱性品红乙醇溶液20mL
（1）储备培养基的制备：
先将琼脂、牛肉浸膏及酵母浸膏加至盛900mL蒸馏水的烧杯中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000mL，调pH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于三角烧瓶内，瓶口塞脱脂棉，置高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
（2）平皿培养基的配制：
将上述储备培养基加热融化，以无菌操作，根据瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按1∶50的比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液置于灭菌空试管中；再按1∶200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色退成淡粉红色为止（不宜多加）。
将此混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡）。
立即将此种培养基适量（约15mL）倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后，倒置冰箱内备用。
此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过二周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
2．乳糖蛋白胨培养液
蛋白胨10g
牛肉浸膏3g
乳糖5g
氯化钠5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL
蒸馏水1000mL
将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，试管口塞脱脂棉，于高压蒸气灭菌器中，以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
3．.乳糖蛋白胨半固体培养基
蛋白胨10g
牛肉浸膏5g
酵母浸膏5g
乳糖10g
琼脂5g
蒸馏水1000mL
将上述成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH为7.2~7.4，过滤后分装于小试管内，置高压蒸气灭菌器中，在115℃灭均20min。
冷却后置于冰箱内保存，此培养基存放以不超过二周为宜。
五、实验步骤
1．滤膜及滤器的灭菌
将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次15min。
前二次煮沸后需更换水洗涤2~3次，以除去残留溶剂。
也可用121℃高压蒸气灭菌10min，10min一到，迅速将蒸汽放出，这样可以尽量减少滤膜上凝集的水分。
滤器、接液瓶和垫圈分别用纸包好，在使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30min。
滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
2．水样量的选择
待过滤水样量是根据所预测的细菌密度而定的（见表4-1）。
表4-1对总大肠菌群做滤膜实验时应过滤水样的参考体积
水样种类
过滤的体积（mL）
100
50
10
1
0.1
0.01
0.001
0.0001
饮用水
×
游泳池水
×
井水、泉水
×
×
×
湖泊、水库水
×
×
×
给水的水源水
×
×
×
沙滩浴场水
×
×
×
河水
×
×
×
×
加氯的污水
×
×
×
原污水
×
×
×
×
一个理想的水样体积，可以产生大约50个大肠菌群细菌菌落，而全部类别的菌落数则不超过200个。
当过滤水样（稀释的或未稀释的）体积少于20mL时，应在过滤之前加少量的无菌稀释水到过滤漏斗中，以便水量的增加有助于悬浮的细菌均匀分布在整个过滤表面。
3．水样的过滤
用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。
将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤，将细菌截留在滤膜上，水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门取下滤器。
4．培养
用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃恒温箱内培养24h。
培养期间，保持充足的湿度（大约90%相对湿度）。
5．染色、镜检
挑选符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检。
紫红色，具有金属光泽的菌落；深红色，不带或略带金属光泽的菌落；淡红色，中心色较深的菌落。
革兰氏染色、镜检步骤按实验三进行。
6．接种观察
凡系革兰氏染色阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨培养液或乳糖蛋白胨半固体培养基（接种前应将此培养基放入水浴中煮沸排气，冷却凝固后方能使用）经37℃培养，前者于24h产酸产气；或后者经6~8h培养后产气，则判定为总大肠菌群阳性。
六、结果计算
计数滤膜上生长的大肠菌群菌落总数，根据过滤的水样量计算1L水样中总大肠菌群数。
滤膜上菌落数以20~60个/片较为适宜。
计算公式见式（4-1）
N=
（4-1）
式中：
N——水中总大肠菌群数，个/L；
n——滤膜上生长的大肠杆菌菌落数，个；
V——过滤水样量，mL。
实验六活性污泥的生物相观察
一、实验目的
1．掌握生物相观察方法。
2．了解废水处理中正常活性污泥的生物学特点。
二、实验原理
活性污泥净化废水是通过微生物的代谢作用完成的，活性污泥中微生物的组成与环境条件有关，因此，观察活性污泥中的微生物（尤其是微型动物）的组成就可了解处理过程的状态。
在正常活性污泥中，细菌多以菌胶团的形式生活于污泥絮状体中，游离细菌较少；原生动物以固着型纤毛虫占优势，钟虫大量活跃存在是处理效果良好的象征。
霉菌和丝状细菌的菌落少量存在无害，但大量存在可造成活性污泥膨胀；轮虫等后生动物大量出现，则意味着活性污泥的老化。
三、实验仪器及材料
1．显微镜（见附录一）。
2．载玻片、盖玻片。
3．镊子。
4．50mL烧杯、1mL刻度吸管、滴管。
5.活性污泥混合液。
四、实验步骤
1．将活性污泥混合液小心混匀，用刻度吸管吸取1mL，转移到小烧杯中，然后用滴管全部吸取混合液后再逐滴滴入烧杯，标定每毫升相当于多少滴数。
2．用滴管吸取活性污泥混合液，滴一滴于洁净的栽玻片上，用镊子夹取盖玻片，盖在活性污泥滴液上，制成水浸标本片。
注意：
不要使滴液益出盖波片外，不要使盖玻片下留有气泡。
3．在低倍镜下观察活性污泥的形状，密度和折光性。
4．在高倍镜下观察细菌和微型动物（见附录二）的种类、数量和生活状态：
（1）游离细菌的数量（个/1个视野）。
（2）丝状菌的数量（个/mL），伸出活性污泥絮体外的菌丝的多少。
（3）固着型纤毛虫等原生动物的种类、数量（个/mL）、生活状态。
（4）轮虫等后生动物的种类、数量（个/mL）、生活状态。
五、结果计算
N=n×K
式中：
N——每毫升中微生物的个数，个/mL；
n——每滴活性污泥混合液中微生物的个数，个/滴；
K——每毫升相当于的滴数，滴/mL。
六、报告实验观察结果
1．按上述实验步骤3、4的内容要求，分别报出观察结果，并将所观察到的菌胶团和微型动物的形状一一画图。
2．根据观察结果判断该活性污泥性能的好坏。
附录一XSZ－G生物显微镜使用说明书
一、规格与技术参数
1．总放大倍率：
40×~1600×。
2．目镜：
10×平场目镜、16×平场目镜。
3．物镜：
消色差物镜4×/0.1、10×/0.25、100×/1.25和半平场物镜40×/0.65。
4．机械筒长：
160mm
5．机械移动载物台：
横向移动范围60mm，纵向移动范围30mm，游标格值0.1mm。
6．粗微动调焦范围25毫米：
微动调焦手轮格值为0.002mm。
7．阿贝式聚光镜数值孔径NA=1.25。
8．滤色片：
黄、绿、蓝。
附图1
二、结构和性能
G系列生物显微镜的基本结构如附图1所示。
10×、16×平场目镜可提供了宽广平坦的视场。
所有物镜符合DIN标准，40×、100×（油）物镜均设有弹簧装置，能避免因使用不慎而损坏物镜及标本：
新型的40×半平场物镜大大提高了成象质量。
四孔滚珠轴承内定位式物镜转换器可快速、准确地更换不同放大倍率的物镜。
粗微动调焦机构为同轴式（如附图2所示），该机构设有调节手轮，以调整粗动手轮的松紧，以适应不同操作者的手感和防止因长期使用而产生的载物台自动下滑现象。
此机构还设有限位圈，以便确定载物台上限位置，既方便使用又安全可靠。
矩形机械移动式载物台上的标本片夹，可方便地装夹标本。
搬动片夹手柄，放入标本后松开手柄，标本就被夹持在载物台。
纵、横向移动手轮同轴安装，使用方便。
载物台上刻有记取纵、横向移动量的刻尺和游标。
（如附图3所示）。
载物台下面的阿贝式聚光镜（如附图4所示）采用齿轮、齿条机构传动，使聚光镜升降平稳。
调整三个紧定螺钉，可使聚光镜中心和光轴重合。
拨动聚光镜下的光栏调节杆，可改变孔径光栏的大小。
转动滤色片框，可方便地更换不同颜色的滤色片。
旋松滚花螺钉，可方便地将聚光镜取下。
XSZ—G系列生物显微镜采用同一机架及标准配套，可供多种选择。
附图4
凡带电光源的G系列生物显微镜均可选购专用反光镜，以备停电时继续工作。
带电光源的G系列生物显微镜都备有保险丝管，以确保使用安全。
三、使用
将主机取出后置于桌子上，旋出止紧螺钉，将单（双）目镜筒放入后锁紧止紧螺钉（参见附图1）。
转动粗动手轮，使载物台降至最低位置，旋上所需物镜。
将标本放在载物台上，用标本片夹固定。
把10×物镜升至最高位置。
使用自然光照明时调整反光镜，使用人工光源时接通电源，打开开关，调整电位器手柄，使光亮合适并充满整个视场。
转动粗微动手轮，使之成象清晰。
移动平台纵横向手轮，便能方便地观察标本和选择研究对象。
根据需要，可转动物镜转换器，选择不同放大倍率的物镜。
所在物镜都满足齐焦要求，转换物镜后，只要调整微动手轮，即可使之成像清晰。
使用100×（油）物镜时，需在物镜前片与盖玻片、聚光镜前片与载玻片之间滴入香柏油，然后转动物镜消除香柏油中的微小气泡。
注意：
用后必须用酒精、乙醚的混合液擦净香柏油。
采用自然光照明的机型，使用4×物镜时，应将聚光镜降下，并在滤色片框内放置毛玻璃，以使光线充满视场。
正确调整孔径光栏的大小，可提高象的衬度。
其调整方法是：
把标本象调清晰后，取出目镜，从目镜管中观察，拨动孔径光栏调节杆，使孔径光径的大小为视场的三分之二。
根据标本和使用情况，合理选择滤色片，可提高反差，有利观察。
一般滤色片的选择见下表：
标本色
蓝
红、紫
黄、棕
滤色片
黄
绿
蓝
使用双目镜筒时（见附图5），先水平方向拉动目镜筒，使两目镜的中心距与观察者的瞳孔距一致，然后调节目镜筒刻度值使之和刻度盘示值相同。
使用转轴双目时（附图6），直接转动目镜筒使用两目镜的中心距与观察者的瞳孔距一致。
以右眼观察到清晰的标本象为准，调节左眼目镜筒的视度圈，使之左右成象清晰相一致。
使用卤钨灯光源的机型时，灯泡的更换十分方便。
如使用普通机型（见附图7），旋出滚花不脱出螺钉，将灯座板翻出，按下灯固定压板，取出坏灯泡，换上新灯泡，旋进滚花不脱出螺钉将灯座板固定即可。
如使用白炽灯泡的机型，只需将底盘上的集光镜旋下，更换灯泡即可。
注意：
所有采用电光源的XSC-G系列生物显微镜，电源插座必须接地，在更换灯泡或保险丝管前，必须先切断电源（拔下电源插头），严禁带电操作。
更换灯泡时，应等灯泡完全冷却后进行，以免烫伤手指。
XSZ-5G摄影显微镜是由XSZ-3G生物显微镜和135摄影装置两部分组成。
使用XSZ-5G摄影显微镜时，用监视目镜替代目镜观察，将标本象调焦至清晰，此时观察和摄影同步，再根据标本和光线情况选择合适的曝光时间，就能获得满意的显微照片。
其具体操作见《XSZ-5G摄影生物显微镜》说明书。
XSZ-6G摄影显微镜是由XSZ-3G摄影显微镜和P01半自动测光装置两部分组成。
其显微摄影的曝光时间由半自动测光装置P01决定，以确保每一张照片都能获得满意的效果，其具体操作见随机所附的《P01显微摄影仪》说明书，两种摄影显微镜都可配备CCD摄像装置。
用XSZ—1G生物显微镜作相衬观察时，在完成一般观察的调整后再进行如下工作：
插入相衬环板并将孔径光栏开至最大的位置，将相衬物镜旋入转换器并转入光路，即可进行相衬观察。
注意：
聚光镜中的相衬环板座在出厂时经严格调整及检查请勿随便拆卸。
不作相衬观察时，环板一定要抽去，相衬物镜也不能作普通物镜用，否则要影响成像质量。
相衬观察时孔径栏必须开到最大。
四、保养
显微镜应安放在干燥、清洁、无震、无腐蚀性气体和阴凉通风的地方。
物镜在出厂时都经严格校正和检验，不得自行拆开。
请勿用手或硬物接触光学镜片，若镜片表面不清洁，可用擦镜纸或用脱脂棉沾少许酒精、乙醚混合液轻轻擦洗，严禁用二甲苯擦洗。
粗动手轮松紧的调节，请一定使用调节手轮，切忌将两个粗动手轮向相反的方向同时旋转，以免造成损坏。
仪器不用时，应切断电源，并用防尘罩罩好。
附录二废水生物处理中常见的微生物
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