生物基因组测序发展现状和对策建议.docx

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生物基因组测序发展现状和对策建议

生物基因组测序发展现状和对策建议

已有198次阅读2011-3-2811:

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里程碑科学家基因组噬菌体定向

张江丽

生物信息的序列化，是生命科学进入21世纪的划时代里程碑，也是生命科学走向成熟的一个阶段性标志。

生物基因组全序列的测定对于科学家从整个基因组规模深刻认识、研究物种，阐明基因的结构与功能关系，细胞的发育、生长、分化的分子机理，疾病发生的机理，利用有利基因加速定向改良和培育生物新品种等发挥巨大作用。

除科学价值外，生物基因组全序列测定还具有重大的经济价值，医药、保健、农业和食品制造等产业因此而率先形成了新兴产业，成为全球新的经济增长点，创造了巨大的经济价值，基因作为生物资源的载体，已成为继国土（矿产等）资源之后一种战略资源，使得生物基因组全序列的测定成为世界关注的焦点和竞争的热点。

1生物基因组测序现状

1980年，噬菌体Φ-X174（5368bp）碱基对得到完全测序，成为第一个被测定的基因组。

1995年，嗜血流感菌（Haemophilusinfluenzae，1.8Mb）测序完成，是第一个被测定的自由生活物种。

随后，越来越多的生物被纳入基因组测序的名单。

截至2007年，已完成测序的生物包括原核在内大概有300多种。

2008年以来已至少有34个物种（不完全统计，不包括微生物）完成了基因组全序列测定或框架图。

植物类主要有18个物种（番木瓜，黄瓜，马铃薯，白菜，甘蓝，兰花，木薯，油菜，大豆，高粱，玉米，小麦，西瓜等瓜类，青蒿，团藻，丹参，棕榈树，苹果）；动物类主要包括16类（家蚕，大熊猫，藏羚羊，猪，马，牛，老鼠，血吸虫，致命疟疾寄生虫、蜜蜂微孢子虫、脑癌细胞系，蚜虫，金小蜂，水螅，蚂蚁，海绵）。

微生物类截止到2010年1月15日，已完成基因组测序6088个,其中病毒2327个，真菌细菌1363个（株）。

同时，更多物种的基因组测序计划启动，测序工作正在大规模开展中。

2008年1月由中国、英国和美国的科学家组成的国际协作组宣布国际“千人基因组计划”正式启动。

中国在这方面的研究进展是：

2009年4月深圳华大基因研究院启动“世界三极动物基因组计划”，8月，又联合中国微生物领域顶尖研究机构、院校和企业启动“万种微生物基因组计划”，2010年启动“1000种动植物基因组计划”和“狮虎豹基因组计划”；中国水产科学研究院2009年12月组织启动“鲤鱼基因组计划”项目；2010年2月茶树基因组测序计划在昆明启动；4月，人参基因组计划在长春启动；8月由中国农业科学院特产所牵头的中国梅花鹿全基因组测序计划启动；11月，“莲藕基因组计划”依托武汉市蔬菜科学研究所启动；12月，深圳华大基因研究院与“万种脊椎动物基因组计划”联盟（G10KCOS）的科学家联合宣布启动万种脊椎动物基因组一期计划。

Nature杂志在2010年的“Newyear,newscience”文章中用“Afloodofgenomes”来形容基因组测序的进展速度。

2DNA测序技术发展现状

DNA测序技术自发明以来就一直在推动分子生物学发展方面起着至关重要的作用。

近年来被测序物种之所以高速增长，与DNA测序技术的更新换代密不可分。

从早期FrederickSanger的手工测序，以及基于Sanger法开发的第1代自动化测序仪，到目前第三代测序平台，这一领域发生了巨大变化。

第一代基因组测序仪主要采用Sanger双脱氧方法，该方法耗时长，费用高。

中、美、英、日、法、德等国科学家用此法历时13年、耗资30余亿美元才绘制出首份人类基因组图谱。

2007年，伊鲁米那公司（Illumina）出资6亿美元收购了基因分析系统制造商Solexa，推出了Solexa测序仪，被称为第二代基因测序仪，此后便进入了高通量、低成本的基因测序时代。

2011年2月美国太平洋生物科技公司在“基因组生物学与技术进展大会”上介绍了第三代基因组测序仪，该测序仪实现了一次标记一个分子式的单分子速读，读出碱基对的平均长度是1500对，这是Solexa测序仪的10倍。

3中国生物基因组测序发展重点与对策建议

物种基因组测序竞争的实质是基因和知识产权的竞争，关系到国家发展战略。

中国主要参与了人类和水稻的基因组测序计划，并主导完成了血吸虫、家蚕、黄瓜和大熊猫的全基因组测序，在国际上引起了巨大反响。

对今后5～10年中国生物基因组测序的发展重点，建议重视以下工作：

1）加速研制生物基因组测序基础装备。

当前，中国从事基因研究使用的第二代基因测序仪完全依靠进口，不但费用高，而且受制于人。

因此中国应加紧研制具有国际先进水平的第三代基因测序仪，提升装备自主化水平，使中国生命科学研究机构能够获得低成本、高效率的测序工具，更有效地开发和利用中国丰富的基因资源，加速我国基因战略的发展。

2）加速具重要经济价值的动、植和微生物基因组的测序。

对具有重要经济价值的动物、植物和微生物等物种进行全面的全基因组测序，发掘基因组内蕴含的海量遗传信息，破解决定品质、产量、生长速度、抗病害能力等各类性状的基因奥秘

生物基因组测序在“十二五”时期将更加快速发展。

中国应抓住机会，整合资源，建立国家级基因组测序工作协调机制，以对测序工作进行总体、全面的统筹、协调和推进。

在目标物种的技术水平、资金投入以及研究基础等方面统筹安排，制定切实可行的工作框架，选取合适的实验材料和技术路线，分类分步、分工合作，对有重要经济和社会贡献的遗传学和基因组学基础较好的、可操作性强的各类生物开展全基因组测序，在5～10年时间内使中国生物基因组研究水平和可用基因资源处于国际领先水平。

3）加大投入。

加大对生物基因组测序的经费投入，建立生物基因组研究和资源开发平台，培养一批生物基因组学研究人才，注重有效保护中国的基因知识产权，使中国各个领域基因组学研究处于国际前列。

2010，高通量测序技术日渐成熟

张广丰/上海伯豪生物技术有限公司分享

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测序在生命科学研究中一直发挥着重要作用。

以Sanger法（双脱氧核苷酸末端终止法）为代表的第一代测序技术帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组图谱等大量测序工作，但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是后基因组时代最理想的测序方法。

进入21世纪后，以Roche454、IlluminaSolexa和ABISOLiD为代表的第二代测序技术诞生了，并迅速掀起了你追我赶的技术比拼高潮。

2010年，Illunima和ABI先后发布新款测序仪，改进了原有机型，测序通量不断提升，测序成本不断降低，现在已经进入了数千美元测一个人全基因组的时代。

第二代测序技术进展

1.Roche454测序技术

454公司可谓第二代测序技术的奠基者。

2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统--GenomeSequencer20System。

这一技术的建立开创了边合成边测序（sequencingbysynthesis）的先河，被nature杂志以里程碑事件报道。

之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。

一年后，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统--GenomeSequencerFLXSystem（GSFLX）。

2008年10月，Roche454在不改变机器的情况下，推出了全新的测序试剂--GSFLXTitanium，全面提升了测序的准确性、读长和测序通量。

目前，Roche454GSFLXTitanium每次运行能产生100万条序列，平均读长能达到400nt，且第400个碱基的准确率能达到99%。

一次运行所需时间为10小时，能获得4-6亿个碱基的序列信息。

2.IlluminaSolexa测序技术

Illumina公司的第二代测序仪最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术"DNA簇"和"可逆性末端终结（reversibleterminator）"，实现自动化样本制备和大规模并行测序。

Illumina公司于2007年初花费6亿美金巨资收购了Solexa。

2010年初，Illumina将其第二代测序仪GenomeAnalyzerIIx升级到HiSeq2000。

HiSeq2000含有两张Flowcell，可同时运行或者只运行其中一张。

读长为100nt，同时支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。

每次运行最多可产生200GB的数据量（读长为2x100nt）。

Solexa测序技术路线：

3.ABISOLiD测序技术

过去20年，美国应用生物系统公司（ABI）在一代测序方面一直占据着垄断地位。

第二代测序技术出现以来，ABI公司不甘落后，迅速赶上，于2007年底推出了SOLiD第二代测序平台。

2010年末又发布了最新产品--SOLiD5500xl测序平台。

从SOLiD到如今的SOLiD5500xl，短短三年时间，连升五级，发展速度惊人。

SOLiD全称为SupportedOligoLigationDetetion，它的独特之处在于它以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应为基础，而没有采用传统的边合成边测序技术。

连接反应没有DNA聚合酶合成过程中常有的错配问题，而SOLiD特有的"双色球编码技术"又提供了一个纠错机制，这样设计上的优势使得SOLiD在系统准确性上大大领先于其它平台。

目前最新款SOLiD5500xl含有两张微流体芯片（microfluidicFlowChip），每张芯片含有6条相互独立的运行通道（runlane）。

每条lane都能运行相对独立的测序反应，这样的设计使得SOLiD5500xl测序平台极具灵活性。

最大测序读长为75nt，同样支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。

单次运行能得到的最大数据量为300Gb（使用最新设计的nanobeads）。

测序的系统准确性能达到99.99%。

SOLiD测序技术路线：

第二代测序技术的应用

技术推进科学研究的发展。

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。

比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序（denovosequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。

在转录组水平上进行全转录组测序（wholetranscriptomeresequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（smallRNAsequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。

在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（TargetedResequencing）。

这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。

目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen，应用最多的是人全外显子组捕获测序。

科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。

目前，外显子组测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。

内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion综合征中的致病突变，Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。

他们使用AgilentSureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序，平均覆盖度为43倍，读长为50nt，每个个体产生了2.7-3GB可作图的序列数据。

他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因，最终将候选基因缩小至1个。

而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以上疾病进行研究，包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病，以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。

前不久刚刚结束的Science杂志年度十大科学突破评选中，外显子组测序名列其中。

以上我们盘点了2010年第二代测序技术的最新进展和相关应用。

但是除了第二代测序之外，还有另外一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中，只是还没有正式发布。

所以目前科学界所说的高通量测序还指的是第二代测序。

第三代测序技术简介

第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。

另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。

为了克服这样的缺点，业界发展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。

简介如下：

1.Helicos公司

Helicos公司的Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly（A），用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。

用小片段与表面带有寡聚Poly（T）的平板杂交。

然后，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。

将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱，检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。

用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。

经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。

Heliscope的读取长度约为30-35nt，每个循环的数据产出量为21-28Gb。

2.PacificBiosciences公司

PacificBiosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。

SMRT芯片是一种带有很多ZMW（zero-modewaveguides）孔的厚度为100nm的金属片。

将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。

与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。

当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。

此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间（毫秒级）与它进入和离开的时间（微秒级）相比会很长，所以信号强度会很大。

其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。

在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物（fluoropolymer）切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。

3.OxfordNanoporeTechnologies公司

OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序的技术。

他们设计了一种以α-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。

用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。

总结与展望

三代测序技术的原理各有特点，适用范围也不近相同。

第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而且难以胜任微量DNA样品的测序工作。

第二代测序技术中，454序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。

Solexa较454具有通量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。

Solexa双末端测序（paired-endsequencing）可以为基因组进一步拼接提供定位信息，但是随着反应轮数增加，序列长度和质量均有所下降，而且在阅读AT区时有明显错误倾向。

SOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量，适合转录本研究以及比较基因组学特别是SNP检测等，但是测序的片段短限制了该技术在基因组拼接中的广泛应用。

第三代测序技术目前正在研发阶段，尚未正式投入使用。

在实际应用中，多种测序平台的结合可以得到更好的效果。

比如由于各种测序技术的错误分布并不相同,我们可以采用两种测序方法相互印证,可以解决单一测序方法无法验证SNP正确性的弊端。

2010年是高通量测序技术日渐成熟的一年，虽然尚未诞生具有革命性的测序仪，但是测序仪的性能不断改进，其同样意义重大。

2006年底，美国X大奖基金会设立了基因组ArchonX大奖，奖金高达1000万美元。

这项大奖将颁给第一个能在10天之内，用不到100万美元的费用，完成100个人类基因组测序的民间团队。

照现在的发展趋势来看，基因组ArchonX大奖很快就会颁发出去了。

虽然测序技术越来越成熟，成本也越来越低，但是大量的数据存储和分析是紧接着的又一个挑战；而且，现在我们所能解释的生物学现象和机制还很有限，即使获得了基因组信息，如何去解释和应用它，仍是个长远的问题。

这些问题都需要大家一起努力，共同探讨，拓展高通量测序的应用领域。

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