第03章基因的转移和重组复习进程.docx

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第03章基因的转移和重组复习进程

第三章基因的转移和重组

自然界的基因转移和重组是基因变异和物种进化的基础，也在繁殖、病毒感染、基因表达以及癌基因激活等过程中起重要的作用。

人们正是对自然界基因转移和重组的认识，才发展起DNA重组技术。

第一节基因的转移

一、细菌的接合

（一）概念：

细菌细胞通过相互接触使遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。

在发现接合以前，人们就对细菌的杂交进行探索，但存在两大难题不易解决。

1.a＋b－×a－b＋杂交后得到的重组子频率很低，和基因回复突变的频率相接近。

难以确定a＋b＋是由于a＋b－或a－b＋亲本回复突变而产生，还是真正的重组产物。

2.现已知道细菌重组频率低于10－6，观察百万个菌落以上才可能出现一个重组菌落，对于当时用形态特征作为研究对象来说，工作量太大。

（二）实验证据

1、1946年，莱德伯格（Lederberg）和塔特姆（Tatum）的多重营养缺陷型菌杂交实验。

2、1950年,戴维（Davis,B.D.）U型管实验

（三）遗传物质的单向转移

1953年，海斯（Hayes，W）在重复莱德伯格和塔特姆的杂交实验之前，先用高剂量的链霉素处理A菌株，结果A菌株受处理后杂交结果不受影响，而B菌株受处理后却完全阻止了重组的发生。

这意味两个菌株在杂交过程中的作用是不同的，可能不是交互的过程。

因为链霉素可以阻止细胞分裂，继而杀死细胞，但它还可以让杂交持续一个短时间，A菌株在杂交后被杀死，但并不影响杂交结果，表明它是一种供体，像雄性动物一样，交配后被杀死不影响后代。

而B菌株像是一种受体，和雌性动物一样，受孕后被杀死的话，就不会产生后代。

海斯的结论认为细菌在接合过程中,两个亲本在杂交中所起作用不同,有供体和受体之分,相当于”雄性”和”雌性”

（四）F因子的发现

海斯将放入冰箱一年之久的一个菌种A（strs）和B（strs）进行杂交，A菌株是推测的雄性，B菌株是推测的雌性，结果和预期不同，不能产生重组子。

他将A菌种进行诱变，使其由strs变成strr，以便试着和另一品系A（strs）杂交，结果是可育的，说明原来的雄性A菌株放在冰箱内一年变成了雌性，即从供体变成了受体。

以上实验完成不久，莱德博格和她的妻子也发现了这一现象。

他们对此的一致解释是，所谓的供体或雄性是细菌的细胞内有一种致育因子（fertilityfactor，F），F＋表示，而雌性品系缺乏这种F因子，以F－表示。

原先的F＋品系（A）放置冰箱一年后丢失的F因子，变成了F－，作为F－的A品系不能和另一F－的B品系杂交，所以不育。

丢失F因子的A菌株经诱变后其基因型由strs变为strr，但仍为F－，作为F－的A菌株可与另一品系的F＋的A（strs）杂交，经strr选择培养基筛选出的重组子仍是F＋（strr），获得的重组子和F－的（strs）杂交仍然可育，这样便发现了F因子。

F因子存在的细菌为F＋，F因子丧失的细菌为F－，F＋细胞分裂后仍为F＋,在这一点上F＋类似于染色体基因。

但F并不是染色体基因，因为染色体基因不那么容易消失，且染色体基因的转移频率不超过10－6，而F因子的转移频率很高。

所以F因子是染色体外的遗传结构，即质粒。

（五）F因子的特性

高频重组菌（highfrequencyrecombination，Hfr）：

从F+菌株中可以得到重组频率高于F+菌株1000倍的菌株,是由F因子通过同源重组整合到宿主染色体上形成的。

1.F＋和F－能杂交，Hfr和F－菌株能接合，F－和F－不能接合。

2.F＋和Hfr细胞表面有性菌毛，F－细胞表面没有性菌毛，性菌毛与细菌接合有关。

3.Hfr菌与F－菌接合后F－很少变为F＋，F＋与F－接合后，F－常变为F＋。

4.Hfr细菌经吖啶橙处理后，性质不变，F＋经吖啶橙处理后变为F－。

（六）F因子的遗传结构

F因子是一种质粒,为环状闭合双涟DNA，长度为94.5kb，是大肠杆菌基因组的2％，其中1/3的基因与接合有关。

F质粒可在细胞内游离，也可以整合到宿主染色体内。

整个基因组包括：

转移区、复制区、插入区

转移区

▪由23个基因组成，构成tra操纵子。

▪这些基因分别与性菌毛的形成，转移因子的转移，杂交对的配对，转移的起始有关。

▪转移的起始区为oriT，供体F质粒的转移从oriT开始。

复制区

▪复制区负责质粒的自我复制。

▪F质粒的自主复制区中包含复制的起点。

▪F质粒的复制是按θ型方式双向复制。

插入区

▪F质粒的插入区包含4个插入顺序：

2个IS3，1个IS2和1个Tn1000。

通过和宿主染色体上的IS同源重组或通过转座，F因子可以整合到宿主染色体不同位点上。

▪与质粒的整合、切除、分离有关。

二、细菌的转化

（一）概念：

细菌摄取外源DNA片段产生新的遗传性状的过程。

（二）转化发生条件

Ø建立了感受态的受体细胞

Ø外源DNA游离分子

感受态：

把细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态。

自然感受态：

是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制。

人工感受态：

通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。

（三）自然转化

1、概念：

将不经过特殊处理的细菌细胞从其环境中吸收DNA的过程称为自然转化。

2、过程：

①感受态的出现

细菌细胞在特定时期产生一种感受态因子，该因子与细胞膜上受体结合，引起某些感受态－特异蛋白质表达，其中一种是自溶素，它可以使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有和DNA结合的活性。

因此可以说细菌表面出现许多DNA结合位点就意味着细菌出现了感受态。

结合位点只能与双链接合，完整的DNA双链结构对转化是重要的。

②DNA的结合和进入

一般认为，革兰阳性菌和革兰阴性菌在转化过程中DNA结合和进入细胞的方式有些差异。

a革兰阳性菌DNA的结合和进入

肺炎链球菌为例：

细胞生长后期，细胞密度升高时，细胞分泌感受态因子，诱导感受态出现。

双链DNA结合到细胞表面特异受体上，核酸内切酶将吸附的DNA随机切成一些大片断。

核酸外切酶将双链中一个单链分解掉，另一个单链进入细胞。

b革兰阴性菌DNA的结合和进入

流感嗜血菌为例：

首先在感受态细胞的形成过程中，流感嗜血菌会形成一种能结合双链DNA的膜结构，叫做转化小体，该结构将双链DNA吸收后，能使DNA免受外源DNA酶的降解。

转化小体位于细胞膜表面，与细胞的内外膜融合。

DNA被吸收到转化小体后，双链被降解为单链，单链进入细胞。

③DNA的整合

单链DNA进入细胞后，不经复制便以单链的形式与受体DNA的同源部分配对（可以设想受体DNA由于处于复制、转录或其他原因而呈单链）。

供体DNA和受体DNA形成共价键，被交换下来的一小段受体单链DNA被核酸酶所分解。

总结：

转化因子与染色体的整合取决于几个因素

1.受体细胞的感受态。

2.受体与供体DNA的同源性。

3.受体细胞的限制系统，可决定转化因子在整合前是否被分解。

4.线状供体的DNA比环状质粒的DNA整合效率更高一些。

（四）人工转化：

1、Ca2＋诱导转化：

1）将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2＋使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；

2）此时加入DNA，Ca2＋又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；

3）经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。

本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期，实验操作必须在低温下进行。

2、PEG诱导转化：

在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。

此时，再加入含有待转化的DNA样品和PEG的等渗溶液，均匀混合。

通过离心除去聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。

这种方法不仅适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性细菌，也对酵母菌、霉菌甚至植物等真核细胞有效。

只是不同种属的生物细胞，其原生质体的制备与再生的方法不同。

3、电穿孔驱动转化：

电穿孔是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。

受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。

具体操作程序因转化细胞的种属而异。

。

虽然电穿孔法转化较大重组质粒（＞100Kb）的转化效率比小质粒（～3Kb）低一千倍，但这比Ca2＋诱导和PEG转化方法理想，因为这两种方法几乎不能转化大于100Kb的质粒DNA。

4、基因枪法

三、转导

（一）概念：

以噬菌体为媒介，将供体菌DNA片段转移到受体菌内，使受体菌获得新的遗传性状。

（二）转导现象的发现

1952年，Lederberg和他的学生把鼠伤寒沙门菌的一个突变菌株LT22（try－）和另一个突变菌株LT2（his－）混合培养物在基本培养基上培养，结果在107个细胞中得到大约100个重组菌。

为进一步验证伤寒沙门菌是否通过细胞接合而产生重组体又进行了U形管实验，在接种LT22的一端出现重组菌。

说明沙门菌的重组不是通过细胞接合，而是通过某些可滤因子。

通过一系列实验发现可滤因子具有一些特性

•不因DNA酶处理而失活。

•因加热失活，抗P22血清处理也失活。

•和从溶源性LT22菌株获得的噬菌体（P22）具有相同的大小和质量。

•把P22的LT2和LT22菌株混合培养，在基本培养基上出现重组菌。

结论：

基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的

（三）局限性转导：

以噬菌体为媒介，只能使供体的一个或少数几个基因转移到受体的转导作用。

λ噬菌体为例：

λ噬菌体感染宿主菌后，它的染色体由线状变为环状。

这一环状DNA分子以它的附着位点attP和细菌染色体DNA同源位点attB作用，通过一次交换整合到宿主染色体中。

通过相反的过程λ噬菌体可以脱离宿主染色体而成为游离的噬菌体，这一过程称为切离。

如果切离的位置有偏差则成为带有宿主染色体的噬菌体，成为转导噬菌体。

转导噬菌体在带有宿主细胞一部分染色体的同时必然失去自己的一部分染色体。

（四）普遍性转导：

宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA一部分而被带入受体菌。

四、转染：

噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞、或外源DNA导入真核细胞的过程称为转染。

五、转座：

大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。

这些可在DNA分子间进行转移的DNA片段，称为转座因子（或）可移动因子。

由可移动因子介导的基因移位或重排称为转座。

（一）原核生物的转座子

1、插入序列（insertionsequence,IS）

组成：

•反向重复序列（IR）：

位于两侧,在IS的切割和DNA链的转移中起作用。

•转座酶编码基因：

位于中间，产物引起转座，负责识别切割转座子的两端及在靶部位造成切口。

•正向重复序列：

位于反向重复序列外侧，为插入序列所特有。

2、转座子（transposon,Tn）：

是较复杂的转座因子，除含转座酶基因外还含有抗性或其他基因。

分为两类：

•复合转座子：

通常两端为顺向或反向重复的插入序列作为两臂，中间为标记基因。

•复杂转座子：

两端不带插入序列，但有反向重复序列。

中央是转座酶基因和抗药性基因。

3、Mu噬菌体

Mu噬菌体遗传图：

线状双链分子，游离Mu噬菌体DNA的两端连接一段宿主DNA，左端约长100bp，右端约长1500bp。

这两段宿主DNA序列在不同Mu噬菌体DNA上各不相同。

Mu噬菌体基因组有以下特征：

•基因A和B分别编码转座酶和转座辅助蛋白。

•C基因产物对转座酶基因的表达起阻遏作用。

•转座时需要Mu噬菌体的两个末端，即attL和attR。

•当Mu噬菌体DNA被包被在噬菌体头部时，DNA的左末端带有100bp的宿主DNA，右末端带有约长1500bp的宿主DNA。

•当Mu噬菌体浸染宿主时，其线形DNA进入细胞后，Mu噬菌体DNA通过剪-贴型的非复制方式，插入到宿主染色DNA的任意部位，成为原噬菌体。

原噬菌体两侧各有一个5bp重复。

原噬菌体：

在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主的染色体中（如λ噬菌体），也有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。

整合于细菌染色体或以质粒形式存在的温和噬菌体基因组称作原噬菌体。

溶源化的野生型噬菌体相当稳定，但Mu噬菌体的突变株，如温度敏感抑制型-MuCts，则可通过将温度提高到42℃而诱导其进入裂解循环。

这是因为该突变体中的阻遏基因C失活，则噬菌体基因组中的A蛋白和B蛋白大量表达，表达的A和B转座酶通过复制型转座机制使Mu插入到宿主染色体上50-100个新的位点。

同时，噬菌体的晚期基因开始表达，如编码噬菌体头部、尾部、裂解蛋白等，然后从噬菌体DNA左端约50-150bp处的宿主DNA进行切割，右末端也带有1-2kb的宿主DNA，进行包装。

（二）转座机制

•非复制转座：

转座酶识别转座子末端反向重复序列，并在3’端切开，同时在靶部位交错切开单链，它的5端与转座子的3’端连接，形成中间体。

转座子从原来位置上切下来转入新的位置，两条链均被保留。

•复制转座：

转座酶识别转座子末端反向重复序列，并在3’端切开，同时在靶部位交错切开单链，它的5端与转座子的3’端连接，形成中间体。

在形成靶部位与转座子连接中间体后即进行复制。

通过复制使原来位置与靶部位各有一个转座子。

一条链是原有的，另一条链是新合成的。

•剪-贴型转座：

转座酶识别转座因子的两个末端，在转座因子的两个末端进行双链平端切割，完整的转座子从供体DNA中释放出来。

同时转座酶在受体的靶部位进行交错切割，转座子与靶部位的切口末端相连接。

（三）转座的遗传学效应

•引起插入突变或启动沉默基因。

•插入新的基因。

•原来位置保留转座因子。

•造成靶DNA缺失倒位。

•切离

•生物进化

第二节基因的遗传重组

一、同源重组

（一）概念：

又称一般重组，由两条同源区的DNA分子，通过配对，链的断裂和再连接，而产生片段交换的过程。

同源重组的分子模型分为三种：

（二）分类

1、Holliday双链侵入模型

•两个同源染色体DNA排列整齐。

•在DNA内切酶的作用下，两个同源的非姐妹染色单体DNA分子在相应位置同时切开。

•切开的单链交换重接，形成连接分子，称为Holliday中间体。

•通过分支移动产生异源双链。

•交叉结构旋转，产生Holliday中间体的异构体。

•Holliday中间体切开，形成两个双链重组体DNA。

2、单链侵入模型（Meselson－radding模型）

•两个同源染色体DNA排列整齐。

•在DNA内切酶的作用下，两个同源的DNA分子中的一个单链在随机的位置被切开。

•切开的单链末端侵入另一个双链DNA分子中，直到发现它的互补序列，并替代一条与它相同的链。

•DNA聚合酶将利用留下的一条链作为模板，填补侵入的链留下的缺口。

•被替代的链降解，它的残留末端与另一分子中新合成的链连接，形成连接分子，为Holliday中间体。

•产生Holliday中间体的异构体。

•Holliday中间体切开，形成两个双链重组体DNA。

3、双链断裂修复模型

•参与重组的一对DNA分子之一的两条链断裂。

•核酸外切酶进一步作用，将双链断裂处加工成带有3’末端单链突出的缺口。

•单链突出的3’末端侵入另一个同源染色体。

修复合成填补缺口，形成两个Holliday中间体，分支移动。

•

两个Holliday中间体拆分。

（三）同源重组的酶学机制

1、RecA蛋：

参与同源重组的酶至少有27种，包括重组酶，解旋酶，外切核酸酶等，其中以重组酶RecA最为重要。

RecA基因突变可以使同源重组频率降低到10-6以下。

•单链结合活性：

ssDNA结合力比dsDNA结合力强100倍。

平均一个RecA单体结合4个核苷酸，这种结合相当稳定,ATP的存在可促进结合。

•双链DNA结合活性：

pH6.0,必需有ATP存在。

•双链解旋作用：

由于RecA的结合，使双链DNA发生解链。

•ATP酶活性：

对ATP的水解可促进联会。

2、RecBCD酶：

由RecB、RecC、RecD三个亚基构成的功能单位。

•单链和双链外切酶活性

•解螺旋酶活性

•序列特异的单链内切酶活性

主要功能：

提供一个含游离3’端的单链区

3、Chi位点

•含有恒定的8bp序列5’GCTGGTGG3’

•存在于大肠杆菌的DNA序列中，5-10kb出现一次

•RecBCD酶在Chi位点右侧4-6个碱基切割

二、位点特异性重组

（一）概念：

是在特异性蛋白的催化下，对DNA的特定序列进行准确的切割和重新连接的现象，只需要小范围的同源性。

（二）λ噬菌体属于典型的位点特异性重组。

λ噬菌体侵染大肠杆菌后，可以进入裂解生长或进入溶源生长。

如果进入溶源生长，游离的λDNA整合到细菌染色体中；由溶源状态进入裂解生长阶段，则λDNA从细菌染色体上切离下来。

整合和切除均通过细菌染色体DNA和λDNA上特定位点之间的重组而实现，这些特定位点叫做附着点（attachmebtsite，att）

大肠杆菌DNA上的att位点为attB，位于bio和gal基因之间含有B、O、B’三个序列组分。

λ噬菌体DNA上的att位点叫做attP，由P、O和P’三个序列组成。

attB和attP只有15个序列完全一致。

整合过程需要λ噬菌体int基因的产物整合酶和细菌编码的整合宿主因子（IHF）参与。

整合酶是一种DNA结合蛋白质，对POP’序列有强烈亲和性，只能催化BOB’和POP’之间的重组。

整合酶识别并切att位点的核心区，产生共有7bp的粘末端后依靠attP和attB的交叉接合发生重组。

切离时除了需要整合酶和整合宿主因子参与外，还需要一种由λ噬菌体xis基因编码的切离酶和宿主编码的逆转刺激因子FIS参与。

霍锐编

问师西来意排