红霉素生产工艺.docx

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红霉素生产工艺

毕业论文

题目：

浅谈红霉素发酵工艺

系部：

生物工程系

专业：

生物技术及应用

班级：

姓名：

学号：

指导教师：

2012年4月10日

摘要····································································5

1前言·································································6

1.1简述·················································6

1.2物化性状·················································6

1.3作用机理·················································6

1.4红霉素发酵的研究意义··············································6

1.5红霉素研究现状·················································7

1.6现阶段的研究方向·················································7

2红霉素发酵工艺流程及操作要点········································7

2.1发酵工艺流程·················································7

2.1.1一级发酵工艺·················································7

2.1.2二级发酵工艺·················································8

2.1.3三级发酵工艺·················································8

2.2红霉素发酵操作要点·················································9

2.2.1红霉素发酵营养组分·················································9

2.2.1.1碳源营养·················································9

2.2.1.2氮源营养·················································10

2.2.2红霉素发酵操作注意事项········································11

2.2.2.1红霉素发酵PH控制················································11

2.2.2.2红霉素发酵豆油的控制·······································11

2.2.2.3红霉素发酵温度的控制·······································12

2.2.2.4红霉素发酵溶氧的控制·······································12

2.2.2.5红霉素发酵空气的控制·······································12

2.2.2.6发酵液质量控制················································13

2.2.3有效成分测定标准················································13

3结论································································13

参考文献·······························································14

谢辞··································································15

摘要

红霉素是20世纪50年代开始生产的大环内酯类抗生素，他的抗菌谱与青霉素G相似，只要用于抗革兰氏阳性菌所致的感染，对青霉素耐药菌和某些病原体如军团菌、螺杆菌、支原体、衣原体、放线菌、非结核分枝杆菌、立克次体及某些厌氧菌感染有效。

红霉素还具有改善机体免疫系统的作用，对不断增加的许多致病微生物也有良好的抗菌活性。

随着对红霉素的研究开发深入开展，一些高效、长效、生物利用度好、各具特色的新红霉素半合成衍生物具有很大的市场潜力。

本次研究对红霉素的发酵条件进行了简要的探讨，其中红霉素的发酵单位达XXX，相当于目前国内红霉素的生产有了一定的突破和进展，对红霉素的工艺研究具有一定了理论指导意义及重大的经济价值。

关键字：

红霉素；发酵工艺参数；探讨

1前言

1.1简述

红霉素是由红霉素链霉菌（Streptomyceserythreus）所产生的大环内酯（macrolide）系的代表性的抗菌素。

可以抑制细菌蛋白质的合成，系抑菌剂，其中主要对革兰氏阳性菌、立克次氏体等具有抗菌活性，是治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物。

随着红霉素衍生物药物的不断涌现，对红霉素的认识提升到了新的层面，如何提高红霉素发酵单位成为近来研究开发的热点。

现阶段，我国红霉素年产量与国际水平相差较大美国亚培公司年产量达2000t，我国仅200t（马培齐.医药经济信息》,203:

15.），国外的发酵单位也高达8000-12000u/ml（马培齐.《医药经济信息》,203:

15.）。

1.2物化性状

红霉素分子式C37H67NO13，分子量733.93，　熔点138-140℃，为白色或类白色的结晶或粉末；无臭，味苦；微有引湿性，易溶于乙醇和丙酮，微溶于水，是-种碱性抗生素。

是发酵过程中产生的次级代谢产物，主要活性成分是红霉素A，杂质组分主要有红霉素B、红霉素C、红霉素D、红霉素E以及红霉素F等。

其中主要杂质为红霉素C。

1.3作用机理

主要对革兰氏阳性菌具有抗菌性。

LD50为200―400毫克/公斤，与细菌的聚核糖体结合而抑制肽链的延伸，从而抑制细菌蛋白质的合成。

1.4红霉素发酵的研究意义

红霉素属大环内酯类抗生素，具有广谱抗菌作用，其抗菌谱与青霉素相似，对革兰氏阳性菌尤其敏感。

临床主要用于扁桃体炎、猩红热、白喉、淋病肠道阿米巴病、皮肤软组织感染等的治疗。

上、下呼吸道感染也可选用红霉素。

需要特别指出的是，红霉素对于不能耐受青霉素的患者也适用。

红霉素除被收入《中国药典》外，还被收入美国、英国、日本等许多国家的药典中。

近年来，在竞争激烈的抗生素市场上，红霉素及其衍生物产量逐年增长，销售额不断上升，预计今后的市场仍有广阔的发展空间。

1.5红霉素研究现状

现阶段，我国红霉素年产量与国际水平相差较大美国亚培公司年产量达2000t，我国仅200t（马培齐.医药经济信息》,203:

15.），国外的发酵单位也高达8000-12000u/ml（马培齐.《医药经济信息》,203:

15.）。

1.6现阶段的研究方向

通过控制优化培养基及发酵过程中溶氧、PH、空气量、搅拌转速、罐压、补料等来提高红霉素A的含量，从而提高红霉素的产量。

2红霉素发酵工艺流程及操作要点

2.1发酵工艺流程

2.1.1一级发酵工艺

一级培养基配方：

打入软化水200L、豆饼粉8.75kg、玉米淀粉10.76kg、糊精9.30kg、玉米浆4.65kg、盐2.43kg、硫酸铵1.23kg、豆油4.25kg、消泡剂0.16kg，用液碱调PH至6.2（±0.1），加入CaCO33.45kg，再打软化水至400L。

初始条件：

温度34.0℃灌压0.05Mpa转速80rpm通气量0.8vvm溶氧100％

当溶氧低于40％时，采用转速和空气流量交替上升的方式来提高溶氧，转速每次提高10转。

转速

通气量

转速

通气量

转速

通气量

转速

通气量

80～120

0.9

120～160

1.0

160～200

1.1

200～240

1.2～1.5

移种标准：

当PH先上升（第一个高峰），再下降，再上升后当第三个高峰出现后（第四个高峰），向后推4～6小时开始移种，需要推迟移种时间时，温度可以降至32℃降速为0.5℃／h。

2.1.2二级发酵工艺

初始条件：

温度33.0℃灌压0.05Mpa转速70rpm通气量1.0vvm溶氧100％

当溶氧低于40％时，采用转速和空气流量交替上升的方式来提高溶氧，转速每次提高5转。

转速

通气量

转速

通气量

转速

通气量

转速

通气量

70～85

1.15

85～105

1.2

105～120

1.35

120～135

1.4～1.55

移种条件：

移种发酵罐时，条件是当PH先上升（第一个高峰），在下降，在上升后当高峰出现后（第二个高峰），向后推4～6小时开始移种，或第一个高峰向后推14个小时。

需要推迟移种时间时，温度可以降至33℃降速为0.5℃／h。

2.1.3三级发酵工艺

初始条件：

温度32.5℃灌压0.05Mpa转速50rpm通气量0.55vvm溶氧100％PH7.0左右。

发酵过程中溶氧的控制：

接种后，溶氧从100％开始下降，随着菌体的生长，溶氧低于45％时，采用转速和空气流量交替上升的方式来提高溶氧，转速每次提高5转，具体参照下表，表中条件从左至右，从上至下逐条使用，当表中条件用完后，溶氧仍低于45％时，（溶氧低于15％时）开始补水，补速1200L／h。

中后期，溶氧逐步回升，当期高于50％，按照如下方法，将溶氧控制在45％，具体参照下表，表中条件从左至右逐条使用，转速每次降低5转，温度每次降低0.3℃。

罐压0.05温度32.5通气量1.0转速逐渐降低，每次降低5转。

转速

通气量

转速

通气量

转速

通气量

转速

50～60

0.6

60～70

0.65

70～80

0.7

80～90

通气量

转速

温度

通气量

罐压

补水

0.8

90～100

33

1.0

0.06

1200

三、发酵中PH控制

接种后PH先下降后上升，然后再次下降，当PH降至6.90以下时，开始用糖调节PH，PH自控维持在6.90。

一、发酵中补糖控制

当PH上升至7.25～7.45长时间没有下降时（2～2.5h），开始补糖，起始速度为200L／h，使PH缓慢降到6.8～7.0，当PH＜6.90时，停止补糖，当PH回升到＞6.90时，开始进行自控，将PH控制在6.90液糖浓度（30%）左右。

五、发酵中正丙醇的控制

发酵20h左右开始补正丙醇，开始正丙醇的残留量控制在0.5～1.5g／L,40-130h控制在1.5～2.5g／L正丙醇浓度（30%）左右。

正丙醇35周期后具体加量根据残留量来定。

周期（h）

20～35

36～54

54～放罐

正丙醇（L/h）

24～46

46～92

94～144

二、发酵中豆油的控制

发酵25h左右开始补豆油，在45～120h，豆油的补速按照表中的高限来补，其余时间当豆油的残留量为0时，补速提高10％具体参照下表。

周期（h）

25～35

36～132

132～放罐

豆油（L/h）

30～40

56～88

68～122

豆油在55周期后具体加量根据残留量来定。

六、放罐条件：

生物量在35%左右，粘度到（180cp）左右，镜检菌丝有自溶现象发生，周期在189h左右，效价9000ú/ml,溶氧一直上升而没有下降趋势。

2.2红霉素发酵操作要点

2.2.1红霉素发酵营养组分

2.2.1.1碳源营养

碳在细胞中的干物质中约占50%，所以微生物对碳的需求最大。

凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质，都称为碳源。

其作用一方面是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源，另一方面是提供菌体生长，产物分泌所需要的能量。

作为微生物营养的碳源物质种类很多，从简单的无机物（CO2、碳酸盐）到复杂的有机含碳化合物（糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等）都可作为碳源。

根据碳素的来源不同，可将碳源物质分为无机碳源物质和有机碳源物质两类。

发酵中使用的碳源物质通常是各种有机碳源物质。

葡萄糖（液糖）：

红霉素采用流加液糖方式，其作用在于调节发酵液的pH，另一方面作为碳源之一。

多糖工业发酵用的多糖：

有糊精、淀粉及其水解液。

玉米淀粉及其水解液是抗生素、氨基酸、核苷酸、酶制剂等发酵中常用的碳源。

玉米淀粉：

糊精英文名称：

dextrin;amylin定义：

淀粉经酶法或化学方法水解得到的降解产物，为数个至数十个葡萄糖单位的寡糖和聚糖的混合物。

包括有麦芽糖糊精、极限糊精等。

糊精通常分为三类：

白糊精、黄糊精和英国胶或称“不列颠胶”。

它们之间的差异在于对淀粉的预处理方法及热处理条件不同。

脂类（豆油）：

霉菌和放线菌可利用油脂做碳源。

在发酵过程中，加入油脂有消泡和补充碳源的双重作用。

在红霉素的生产当中，豆油是原料之一，其作用一方面是消泡，另一方面可以被链霉菌利用作为碳源，提供合成红霉素的前体。

有机酸、醇：

正丙醇：

正丙醇是原料之一，作为合成红霉素的前体，其也可被链霉菌菌利用作为碳源。

2.2.1.2氮源营养

氮元素是微生物细胞蛋白和核酸的主要成分，对微生物的生长发育有特别重要的意义。

因此我们可以将氮源分为无机氮源和有机氮源两种，两者在发酵中都有应用。

（1）无机氮源

常见的无机氮源主要包括氨水、铵盐等。

无机氮源的利用速度一般比有机氮源快，因此无机氮源又被称作速效氮源。

某些无机氮源由于微生物分解和选择性吸收的原因，其利用会逐渐造成环境pH的改变。

例如：

在红霉素生产中，在基础料中加入硫酸铵的方式补充无机氮源，在部分文献中也采用间接流加硫酸铵的方式来补充无机氮源。

无机氮源虽然价格便宜、利用迅速，但是并非所有的微生物都能利用这类简单的氮源。

（2）有机氮源

有机氮源是另一大类发酵氮源，主要是各种成分复杂的工农业下脚料，种类非常多，如玉米浆、各种豆粉、玉米粉、实验室常用的牛肉膏、蛋白胨等等。

总的来说，微生物在有机氮源培养基上生长要比无机氮源培养基上旺盛，这主要是由于有机氮源的成分一般比较复杂，营养也较无机氮源丰富。

有机氮源中除含有一定比例的蛋白质、多肽及游离氨基酸以外，还含有少量的糖类、脂类以及各种无机盐、维生素、碱基等。

由于微生物可以直接从培养基中获得这些营养成分,所以微生物在有机氮源上的生长一般较好，更有一些微生物必须依赖有机氮源提供的营养才能生长。

黄豆饼粉是发酵工业最常用的有机氮源。

根据油脂含量可将其分为三种，全脂黄豆粉（含油脂18%以上），低脂黄豆粉（含油脂9%以下），脱脂黄豆粉含油脂2%以下）蛋白胨、酵母粉等使工业上常用的有机氮源。

2.2.2红霉素发酵操作注意事项

2.2.2.1红霉素发酵PH控制

对pH的要求视不同菌种而异，一般为6.4-6.8，红霉素发酵的最适PH值一般认为在6.95左右，有时也可以略高或略低一些，但应尽量避免pH值超过7.0，因为红霉素在碱性条件下不稳定，容易加速其水解。

在缓冲能力较弱的培养基中，pH值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。

过高的流加速率会造成酸性中间产物的积累，以至于pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。

加糖量的控制是根据残糖量及发酵中的pH值确定，最好是根据CER、OUR、RQ及KLA来控制，一般在残糖量降至0.6%左右，pH值上升时开始加糖。

2.2.2.2红霉素发酵豆油的控制

发酵过程中产生大量泡沫，可以用天然油脂如豆油，玉米油或用化学合成消泡剂“泡敌”来消泡，应当控制其用量并要少量多次加入，避免出现DO低谷，尤其在发酵前期不易多用，否则会影响菌体的呼吸代谢即体现在DO上.在好氧性发酵中泡沫的存在可以增加气液接触面积，增加氧的KLA。

但当发酵旺盛时也会因产生大量泡沫而引起逃液，给发酵造成困难，带来不利因素，防碍了氧气的溶解，造成代谢异常；增加污染杂菌的机会，导致产物的损失；而且在发酵过程中泡沫的消长规律为：

初期易产生泡沫，但一般易碎，中期产生泡沫较少，后期大量产生泡沫，且不易破碎。

因而在发酵生产中（提高罐压，降低通气量短时间间歇性停止搅拌都可减少泡沫的影响）加入适量的玉米油，控制在一定范围。

采用少量多次的加入。

发酵期间应尽量不加油类消沫剂以免菌体代谢能力下降。

（机械消泡的优点为不引入外界物质，不增加培养液的复杂程度，不影响产物的提取；缺点则为不能从根本上消除泡沫稳定的因素，仅适用于泡沫产生较少较易破碎时.

2.2.2.3红霉素发酵温度的控制

前期32.5℃，后期28.5℃，以减少后期发酵液中红霉素的降解破坏。

红霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别，但一般认为应在32.5℃左右，温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消耗，降低葡萄糖至红霉素的转化率。

对菌丝生长和红霉素合成来说，最适温度不是一样的，一般前者略高于后者，故有的发酵过程在红霉素生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间，到达生产阶段后使适当降低温度，以利于红霉素的合成。

2.2.2.4红霉素发酵溶氧的控制

溶氧控制一般不低于45%，通风比一般1:

0.8vvm搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。

 对于好氧的红霉素发酵来说，溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。

当溶氧浓度降到45%饱和度以下时，红霉素产率急剧下降，低于5%饱和度时，则造成不可逆的损害。

溶氧浓度过高，说明菌丝生长不良或加糖率过低，造成呼吸强度下降，同样影响生产能力的发挥。

溶氧浓度是CER和OUR的一个动态平衡点，使RQ控制在0.9左右，而氧消耗与碳能源消耗成正比，故溶氧浓度也可作为葡萄糖流加控制的一个参考指标。

2.2.2.5红霉素发酵空气的控制

发酵车间使用的无菌空气，是经过空气压缩机吸入大气中的空气，压缩，冷却，除虑后达到无菌空气级别，才能被发酵车间使用。

我们知道，被吸入的空气是非常不洁净的，仅以0.5um的尘埃就多达180000-260000粒儿，要把这样级别的空气净化到无菌级别（0.5um＝3.5粒儿），这几十万数量级的差异，要多级除虑。

我们高效膜过滤系统采用三级除虑的设备流程，目的就是保护高效膜滤芯，延长各级滤芯使用寿命，以便更合理的达到无菌空气净化要求。

无菌空气三级除虑的要求分别是：

初效过滤要求将1-10um的尘埃除虑，拦截率100%，中效过滤要求将1um的尘埃除虑100%，高效过滤要求将0.3um的尘埃除虑100%。

2.2.2.6发酵液质量控制

生产上按规定时间从发酵罐中取样，用显微镜观察菌丝形态变化，来控制发酵，生产上惯称镜检，根据镜检中菌丝形态变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度，通过追加唐或补加前体等各种措施来延长发酵时间，以获得最多红霉素。

当菌丝中空泡扩大，增多及延伸，并发现个别自溶细胞，这表示菌丝趋向衰老，红霉素分泌逐渐停止，菌丝形态上即将进入自溶期。

2.2.3有效成分测定标准

产量十亿=效价*体积/1000

发酵指数=产量十亿*10/有效体积*发酵周期

生产指数=发酵指数*收率

3结果讨论

尽管基因水平和细胞水平的代谢流研究已有大量的报道，但是在发酵罐实际操作中，有雨发酵过程中酶学研究的困难及其数据采集及处理的苦难，优化过程中的细胞代谢流的变化很少有研究，因而发酵工艺优化的基本思路仍然会是培养基的最优配方和最佳的温度、DO、PH等的静态调控，而本质上的过程优化往往需要通过动态优化以达到目的。

所以我们只有通过多种在线的数据及其曲线，根据他们的线性关系来将生理调控的工艺参数和生物合成过程中的代谢流分布相联系，从而在代谢的水平上指导发酵过程，实现实时的动态优化才有可能在本质上提高发酵得率，从而大幅度提高发酵生产水平。

参考文献

［1］、陈钧鸣,徐玲娣.抗生素工业分析[M].北京:

中国医药科技出版社,

［2］、王文梅.红霉素的结构修饰[J].中国医药工业杂志.1993（07）1991:

267）

［3］、孙曼霁,周廷冲主编.中国药物研究与发展[M].科学出版社,1996

［4］、安登魁主编.药物分析[M].济南出版社,1992

谢辞

在指导老师的细心指导下，我顺利的完成了毕业论文，虽然在这期间经历了许多的波折，可是每次在面临困难时，指导老师都会教育我让我坚持并且给我了很大的帮助，帮我完成了我的文章，当然在这期间学校也给了我很大的帮助，给我提供了大量的资料让我的论文可以完美地进行下去。

虽然不能说我的论文很优秀，但在指导老师和学校的支持下我认真地完成了，我没有辜负老师和学校的期望，我想在以后的学习生活中我也不会辜负老师与学校的期望，不会给学校抹黑。

衷心的祝愿我校可以红红火火，越走越远。

同时也祝愿我的指导老师可以天天工作顺利，笑口常开。