整理生物化学.docx
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整理生物化学
2006年生物化学
1.举5例说明绿色荧光蛋白在生物化学研究中的应用
1活细胞内基因表达与蛋白质-蛋白质相互作用的光学成像与可视化（基于GFP的荧光共振能量转移，信号传导过程）
2小动物体内恶性肿瘤生长过程及药物作用效果的实时光学成像检查，（荧光探针，找出与已知蛋白的配体分子及药物。
3制备融合抗体，具有免疫原性和发射荧光两种特性。
4构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子
5研究活体细胞的蛋白变他过程，细胞器动力学和内膜运输（动态跟踪，微管的变化，定位在细胞器）
6.GFP基因在生物防治中的应用，评价杀虫剂的毒力。
7GFP的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。
8.在微生物学中的应用（与宿主的相互作用，生物膜。
基因表达，生物降解，定位等）
2.请说明真核生物中逆转座子的结构特征和生物学意义
通过DNA转录为RNA后，再经逆转录称为cDNA并插入到基因组的新位点上的移动因子。
3.某一蛋白样品在SDS-PAGE上经靠马斯亮蓝染色呈现单一的条带。
是否可以认为此蛋白样品只包含一种蛋白？
如何进一步鉴定这个蛋白的纯度
不能认为是单一蛋白，SDS-PAGE上仅仅代表的是分子大小一直的条带，可以进行双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis）。
它是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，
蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法：
等电点沉淀法，盐析法，有机溶剂沉淀法，
样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。
常用的纯化方法有：
凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。
有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
4.简述免疫共沉淀的原理及应用
定义：
用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。
这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。
原理：
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
应用：
1.信号转导，确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法
2.肿瘤异质性（肿瘤细胞在生长过程中，经过许多代分裂繁殖产生的子细胞，呈现不同的基因改变或其他大分子的改变）的蛋白质分子机制
5.转基因食品渐渐地被摆上餐桌，请根据你的生化知识谈一谈你对转基因食品安全性的认识
实质等同原则。
6.请详细说明真核生物基因表达在不同水平上的调节机制
7.中国科学家2005年在生命科学研究领域获得了大丰收，在CELL、Science、Nature上发表了多篇原创性文章。
请说出其中两篇的主要内容和主要作者或主要作者单位。
2007年生物化学
一、名词解释
1.AlternativeSplicing
2.Nonsensemediateddecay
3.RNAediting
4.mircoRNA
5.smallinterferingRNA（siRNA）
二、简述真核生物中分泌型蛋白的转运途径级主要的生理功能
三、请说明真核生物中转座子的两大类型、各自的转座方式及生物学意义
转座元件是基因组中可移动的DNA分子，分为反转录转座子和DNA转座子两类，
Dna转座子是一段能直接在基因组上移动的DNA序列,它的转座利用切除/修复机制，不会引起宿主基因组的增大。
反转录转座子不同于dna转座子,是以DNA-RNA-DNA的途径来实现转座,在整合酶的作用下新生成的DNA状态的反转录转座子整合到宿主基因组中.这样,反转录转座子在宿主基因组中的拷贝数得到不断积累,从而使基因组增大.根据是否具有编码反转录酶的能力,反转录转座子又分为长末端重复序列（LTR）反转录转座子和非LTR反转录转座子两个亚类,
而DNA转座子分为自主元件、非自主元件和微型反向重复转座元件（MITE）三种类型，都具有两个末端反向重复序列。
生物学意义：
目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类—反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势，因此它的发现和利用又为转座子标签的应用提供了更广阔的前景。
（不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签（transposontagging）），此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子捕捉载体，效率比T-DNA标签高
四、简述免疫共沉淀及酵母双杂交实验的原理及个自己的优缺点
免疫共沉淀优点
（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；
（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；
（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
免疫共沉淀缺点
（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；
（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
酵母双杂优点：
⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
酵母缺点：
。
⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
五、用大肠杆菌表达带有GST标签的X蛋白，通过免疫家兔获得针对该融合蛋白的多克隆抗体血清，请你设计实验纯化X蛋白特异性抗体（与GST无免疫交叉反映）
过去有用盐析法纯化的，有用辛酸-硫酸铵沉淀的方式纯化的，也有用冷酒精沉淀的方式纯化的，也有后来的离子交换层析，抗原亲和层析得到的抗体效率高、产量高、产品纯、操作简单。
步骤如下：
1、介质的制备
2、抗原与填料的连接（X蛋白+gstBEADS）
3、连接效果的评估
4、多余位点的封闭
5、抗血清与beads的结合
6、非特异性结合的抗体的洗涤
纯度鉴定：
SDS-PAGE
六、你的课题设计到研究某个蛋白的生物学功能，在你开始具体试验之前，利用网络资源，你需要获得该蛋白的哪些相关信息？
通过这些信息，可预测该蛋白的结构与功能。
蛋白质的氨基酸序列、结构、和其他蛋白的同源序列和同源区域、表达情况
DNA序列数据库有GenBank（美国），
一.蛋白功能预测：
根据序列预测功能，序列相似性，保守域，和亚结构，
blastp
序列特征：
疏水性----跨膜螺旋，前导序列
二.结构预测：
二级结构：
PHD程序
三级结果：
蛋白质自动建模服务器，用于同源性建模，
2008年生物化学
一、名词解释
表观遗传学：
：
：
是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。
表观遗传学涉及到DNA甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码RNA调控等内容，，，，，表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基因组印记（genomicimpriting），母体效应（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNAediting）等。
组蛋白密码组蛋白密码信息存在于转录后组蛋白修饰等过程中。
组蛋白氨基末端的多样化修饰扩充了遗传密码的信息库。
组蛋白密码可被一系列特定的蛋白质所识别,将其翻译成一种特定的染色质状态以实现对特定基因的调节
1.chromatinremodelingDNA复制、转录、修复、重组引起耗能的在染色质水平发生位置和结构的变化
染色质重塑属于表观遗传学的范畴.
细胞分化中的染色质结构，
细胞有丝分裂中的染色质结构
DNA复制程序性与染色质结构关系
DNA甲基化、miRNA/siRNA引起的染色质重塑
主要参与基因转录的调控.并与细胞凋亡、DNA损伤修复、细胞增殖分化、维持基因组稳定性等方面相关.
调控染色质重塑的途径或者机制主要有组蛋白修饰、组蛋白突变体的替代。
ATP酶依赖的染色质重塑复合体、DNA甲基化、非编码RNA调控等.
2.glyconeogenesis由简单的非糖前体（乳酸、甘油、生糖氨基酸等）转变为糖（葡萄糖或糖原）的过程。
3.affinitychromatography利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术
如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。
4.ortholog直系同源不同物种中由同一个祖先基因特化而来的对应基因.具有相近甚至相同的功能,由相似的途径调控,在不同的物种中扮演相似甚至相同的角色,因此在基因组序列的注释中,是最可靠的选择.orthologs的生物信息预测方法主要有两类:
系统发生方法和序列比对方法.
5.retrotransposon通过RNA中间物进行转座的可移动基因元件。
6.competitiveinhibition一种最常见的酶活性的抑制作用，抑制剂与底物竞争，从而阻止底物与酶的结合。
其动力学特点是：
酶促反应的表观米氏常数增大、最大速度不变。
可以通过增加底物浓度来解除这种抑制。
7.非竞争性抑制：
抑制剂与酶分子在底物结合位点以外的部位结合，不影响酶与底物的结合。
因此，只影响酶催化反应的最大反应速度（变小），不影响米氏常数
8.反竞争性抑制剂：
对酶活性的一种抑制作用，由于所加入的抑制剂能与酶-底物复合物结合，而不与游离酶结合，所以其特征是最大反应速度比未加抑制剂时反应的最大速度低
二、请列出6中常见的非编码RNA的名称，简述其功能
三、简述蛋白质免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀的实验原理，比较他们在网络调控研究中的应用
染色质免疫沉淀技术（chromatinimmunoprecipitationassay,CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。
它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
（CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。
）
四、举5例说明绿色荧光蛋白在生物化学研究中的应用
五、请纤细说明真核生物基因表达从转录起始到翻译后水平上的调节戒指
六、分别以核蛋白、线粒体蛋白、膜蛋白和分泌蛋白为例，说明蛋白质合成后，如何被运到靶细胞器执行其功能。
核蛋白：
带有和定位信号的蛋白与核输入受体结合并停口在核孔通道，核孔复合体。
线粒体蛋白：
翻译后运输，多肽链结合蛋白去折叠，ATP,质子梯度帮助去折叠和跨膜。
线粒体定向肽，与膜识别。
膜蛋白：
内质网上合成后，SRP，SRP受体，内质网蛋白质转运子协同运输，有一个起始、终止穿膜信号，都是输水氨基酸残基
分泌蛋白：
内质网上合成后，修饰，形成被膜包裹的小泡，经高尔基体运至细胞膜，经过胞吐作用释放到膜外。
1%的重组率为一个遗传距离单位
2006年遗传学
1.染色体与连锁群之间的关系。
对于某物种来讲，为什么在遗传研究的早期，连锁群的数目少于或多余该物种染色体的数目
2.基因不连锁，其实在一条染色体上，多于。
因为当可标记的基因较少时，其连锁群可能比染色体数目多。
随着可标记基因数目的增加，一些可标记基因会与几个群上的标记连锁，而把它们连成一群。
例如A基因与B基因连锁，B基因与C基因连锁，那么A基因与C基因连锁，A、B、C基因就应合并为一个连锁群。
当可标记基因足够多时，标记连锁群的数目与染色体数目日趋接近，直至相等。
不是单倍体，少于染色体数目。
积累的资料不多。
发掘出的基因认识少，还不足以把全部连锁群绘制出来
3.什么是复等位基因？
请举一实例加以说明
同源染色体的某个相同座位上的等位基因超过2个以上时，就称作复等位基因。
人类ABO血型基因座位是在9号染色体长臂的末端，在这个座位上的等位基因，就人类来说，有A、B、O三个基因，因此人类的ABO血型是由3个复等位基因决定的。
但就一个具体人类来说,决定ABO血型的一对等位基因，是A、B、O三个基因中的两个，即AA、BB、OO、AO、BO、AB。
4.试述同源染色体练会的遗传学意义。
如果同源染色体联会出现异常，会产生怎么样的遗传学效应
同源联会是为了进行减数分裂，在四分体时期有可能会发生同源染色体上的非姐妹染色单体交叉互换，因此发生了基因重组，为生物提供了更多种类的基因型；；；；；同源染色体能均等的分离到两个子细胞中，为的是保证在次级性母细胞没有同源的出现，保证了每个配子都是单倍体，为精卵结合后得到二倍体或多倍体做了保障
联会异常可能会发生染色体数目变异，导致得到异常的配子，因此在受精后会得到多倍体，无籽西瓜。
在遗传学历史上，确认DNA为遗传物质的主要实验证据来源于FredGriffith（1928），OswaldAvery（1944）以及AlfredHershey和MarthaChase（1952）等人的研究。
请分别简述三项研究的主要内容和结论
肺炎球菌转化实验S致死菌+R菌同时注射小鼠体内，感染致死。
发现了遗传转化现象。
OswaldAveryS细胞内部物质分别、不是蛋白、多糖、脂肪。
核糖核酸酶转化活力消失，促使肺炎球菌转化因子是DNA。
噬菌体侵染实验：
35S和32P分别标记蛋白质和DNA。
细胞内部放射性的DNA….，噬菌体残余物还在含有放射性的蛋白质：
证明了遗传物质的化学本质就是DNA
5.激素X发现与80年钱，但对其信号转到了解甚少。
最近的研究表明一个质膜定位的蛋白XR1可能是激素X的受体，其中最关键的证据是XR1蛋白在体外形成二聚体后可能结合激素X，且其结合常熟接近激素X在体内的生理浓度。
但是，遗传学研究的结果却不能支持生物化学研究结果。
第一，在已分离鉴定的与激素X相关的近200个不同突变体中，至今没有发现XR1基因携带任何突变（即所有这些突变体重，XR1基因均为正常）；第二，通过基因敲除技术完全确实XR1基因功能后，激素X的信号转到完全正常。
今年初发表的一项研究似乎为解决这个难题带来一线希望：
如果过表达XR1基因，则细胞/有机体表现出对激素X超敏感。
此外，如果过表达一个点突变的XR1基因（该点突变是将一个高度保守的丝氨酸变成丙氨酸）则导致细胞/有机体对激素X不敏感。
请解释上述结果，你相信XR1蛋白是激素X的受体吗？
为什么？
6.举例简述RNA编辑的主要凡是及生物学意义。
锥虫线粒体中，gRNA指导下的U的插入与删除：
位点特异性脱氨作用：
1.载脂蛋白BC-U，
2.A-I，脑谷氨酸受体亚基mRNA，
生物学意义：
1.消除移码突变等基因突变造成的危害2.基因产物多样性3.生物发育和进化，基因调控的方式4.与学习和记忆有关
2007年遗传学
一、一个学生用转基因技术研究一个基因的功能。
该学生共得到30个独立的转基因主席，其中29个主席的表型与预测的功能基本吻合。
但其中一个主席的情况很特殊，在连续三代自交后代中无法获得任何纯合的转基因主席。
此外，转基因杂合体（其基因型已准确的确认）的自交后代中，仅出现杂合体和野生型（即不含有转基因的个体）两个群体，比例大致为2：
1，但没有纯合体后代。
请解释该株系表型的遗传学基础，并通过实验验证你的解释。
纯合致死；插入到了管家基因处，使得该处基因无法正确表达，严重影响了细胞的正常生理过程和代谢。
若是杂合体，另一条染色体还会表达。
二、一个学生用某一材料的基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆了一个基因。
DNA测序分析后发现其中一个碱基与数据库中公布的基因组序列不复合。
1.解释这种差异的可能原因：
PCR过程中，酶的高保真效果低，导致错配。
2.发现的碱基差异一定会造成蛋白序列改变吗？
若有，是哪几种？
不一定。
若有，错义突变。
。
。
3.为减少克隆过程中认为造成的突变，PCR扩增应该注意什么？
三、RNA干涩是一种快速、有效的研究基因功能的方法，但缺点是有时会导致非特意效应，即影响了其他基因的功能，因而产生非特意性的表型。
若过表达基因A序列片段构建的RNAi导致了一定的表型，如何证明所观察到的表型是由于此RNAi特异性地影响了其靶基因的表达所引起？
举出至少两种实验方案，验证你的解释。
抗性筛选
PCR检测引物课设计在载体上的序列
半定量PCR检测目的基因表达产物是不是比野生型明显降低，且转基因株系中有差异。
Northernblot如果转化成功了，那么目的基因mRNA被降低至RNAblot检测不到的水平
四、一种人类遗传病，在家族中每代都有人患病，且男女无差别。
1.请解释其遗传方式：
常染色体上的显性遗传，基因座基因突变
2.请推测其可能的分子机制：
由等位基因突变，合成与另一等位基因功能拮抗的酶，这一酶没有活性，代谢异常。
3.导致这种疾病的突变为什么能在人群中保留下来：
基因突变是可遗传的，且是非致死突变
五、有两个膜蛋白A和B，其下游的一个靶基因是T。
当配体L存在时，T能激活表达。
如果敲出A（即功能缺失性突变a），T表现为组成性表达（即没有L存在时T也可被激活）：
如果敲除B或者同事敲出A和B，无论L是否存在，T均不能被激活。
1.根据上述结果，推测A和B之间的关系，以及L和A、B之间的关系。
2.设计实验证明你的推测/模型
A抑制B的活性
A抑制T,是一种负调控因子B激活T蛋白
AB是异源二聚体，感受信号配体L，A、B胞内区的磷酸化，激活T
1.首先研究蛋白体外的互作情况
2.研究体外磷酸化水平实验：
BRI1能否可以点突变
2008年遗传学
一、填空题
DNA
正义编码链
C
C
T
A
反义模板链
G
G
A
T
G
A
mRNA
C
C
A
A
tRNA
G
G
U
U
G
C
A
二、有一种荧光物质可以标记Y染色体，在Y配子细胞中只显示一个两点。
请回答：
1.正常XY个体产生的胚子中，有一个荧光亮点的配子所占比例是多少：
1/2
2.如果在某些一场情况下，有配子被染出2个两点，从减数分裂考虑，是如何造成的？
在哪个步骤可以发生？
减数第二次分裂后期，姊妹染色单体没有分开，而是分配到一个细胞内。
3.如果XY个体吃药物D后，配子被染出2个两点的比例大大增加，你如何解释药物D在简述分裂中的作用抑制纺锤丝的形成或牵引、
4.减数分裂的哪一步对遗传多样性贡献最大，为什么？
这种现象在Y染色体发生吗？
为什么？
减数分裂前体，同源染色体联会，配对。
会，XY也属于同源染色体，配对，发生重组
三、突变X是1个40Kb的缺失，纯合突变导致表型A
1.如果40kb的确实包干多少个基因，如何见鉴定A表型是有哪个基因缺失引起的？
举出3种方法。
过表达某个基因，就表型来看，是否产生恢复表现型；southernblot；westernblot；PCR
2.如果突变破坏的基因不能编码蛋白，那会是编码什么？
并说明这种基因的作用方式。
RNA，调控基因表达，可能编码启动子序列
四、植物激素甲能诱导基因T的表达，T被认为是甲信号途径的标记基因。
激素甲最重要的生理功能是抑制植物主根的身长，据此生理效应，某研究生筛选获得了一组对激素甲不敏感的突变体m1，m2和m3.其中m1是通过化学诱变剂诱变获得的，而m2和m3是通过T-DNA插入获得的。
该研究生首先证明m1和m2实际代表甲信号途径的同一个位点，而m3代表甲信号途径的另外一个位点。
该研究生接下来成功克隆了m1和m2所代表的基因命名为A以及m3所代表的基因命名为B。
根据生物信息学，A编码一个F-box蛋白，而B可能编码某类著名的转录因子家族的一个成员。
回答以下问题：
1.怎么样证明m1和m2代表同一个位点而m3代表另一个位点
互补实验验证，向MI导入过表达m2，对激素敏感，向M2导入过表达m1对激素敏感；导入1或2都不能使3…….或者M1M3杂交再自交，不是3:
1则不一位点的突变。
2.该研究生可能怎样克隆A基因和B基因？
怎样证明他克隆到的基因是正确的？
图位克隆。
基因沉默载体构建传野生型
3.请设计实验阐明A和B在甲信号途径中的上下游关系。
使T失活，看AB是否各自的表达量下降，杂交得双突变体
4.假如存在这样一种情况，在突变体m1中A基因的表达水平虽然下降，但其序列在DNA序列水平上并没有发生变化，你如何解释？
调控序列变化
5.作为转录因子应该具备哪些条件？
请设计实验证明B作为转录因子直接调控T的表达。
DNA结合结构域、调控结构域。
足迹法
6.你认为B基因的表达可能存在那些水平的调控？
请分别简述其机制
7.请设计实验对A基因（蛋白）的功能进行系统研究。
网上预测，是否是激酶，如果是，磷酸化形式。
过表达沉默突变体构建转入拟南芥启动子功能分析
8.为了更深入的认识激素甲作用的分子机理，导师希望鉴定与A相关的，在甲信号途径中起重要作用的新原件，请设计两套技术路线开展研究。
酵母双杂交实验，筛选可能存在的互作元件。
基因芯片技术
有条件的话可以建立RNAi库。
mRNA差异显示技术（mRNAdifferetialdisplay）是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。
差异显示获得的只是某个基因的片段，而不是直接获得全长cDNA克隆
传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）是根据绝大多数真核细胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）结构，因此可用含ol
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