军曹鱼对维生素C的最适需要量.docx
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军曹鱼对维生素C的最适需要量
军曹鱼对饲料维生素C需要量的研究
摘要
为确定军曹鱼对饲料维生素C的最适需要量进行为10周的生长实验。
在基础饲料中添加维生素C多聚磷酸酯（LAPP），获得六种含有不同水平抗坏血酸的精制饲料（2.70（对照组），8.47，28.33，80.58，240.79和733.24mg/kg）。
实验设置六个处理，每个处理设3个重复，每个重复放置初始体重为4.6±0.4g的军曹鱼25尾。
实验结果表明，除生长下降、死亡率增高、摄食降低等缺乏症以外，实验过程中未观察到其他明显的缺乏症。
当饲料中维生素C含量达到或超过80.58mg/kg时，军曹鱼生长最佳。
对照组军曹鱼的存活率、增重率和饲料转化率均显著低于其他饲料组。
随着饲料中维生素C水平的提高，军曹鱼的增重率、饲料转化率、肝脏和肌肉中的维生素C含量均显著升高并趋于平稳。
饲料中不同水平的维生素C对军曹鱼的体组成没有显著影响。
当分别以增重率、肝脏中维生素C含量和肌肉中维生素C的含量为评价指标时，军曹鱼对饲料中维生素C的最适需要量分别为44.74、53.94和103.72mg/kg。
关键词军曹鱼维生素C
1．引言
维生素C，或称L-抗坏血酸，在鱼类的生长过程中发挥重要作用（Al-Amoudi等,1992;Lin和Shiau,2005）。
维生素C参与原胶原蛋白合成（Sato等，1988），促进铁的吸收（Sandnes等，1990），保护吞噬细胞和周围的组织。
缺乏维生素C会导致鱼类生长不良，贫血，脊柱弯曲，和免疫力降低等缺乏症（Halver等,1969；Lim和Lovell，1978；Dabrowski等，1990；Al-Amoudi等,1992；Verlhac和Gabaudan，1994；Gouillou-Coustans等,1998）。
L-古酪糖酸内酯氧化酶是体内合成维生素C的关键酶（Wilson,1973;Fracalossi等,2001），而大多数硬骨鱼类体内由于缺乏这种酶而无法自身合成维生素C（Dabrowski等，1990；）。
因此，需要在鱼类饲料中添加外源性维生素C以满足其生长之需要。
一些鱼类饲料中维生素C的适宜添加量已经得到确认（NRC,1993）。
但是由于研究鱼的种类、规格、饲料配方和试验条件等的不同，所得出的需要量也各不相同。
军曹鱼（RachycentroncanadumLinnaeus），亦称海鲡，广泛分布于热带和亚热带水域（Ditty和Shaw，1992）。
具有个体大、生长快（养殖1年可达3-5kg）、肉厚质细等特点（Shiau,1999；Chen,2001）。
随着军曹鱼人工繁殖和大规模育苗技术的突破以及养殖技术的进展，军曹鱼已成为海水网箱养殖最有前景的一种鱼类（Liao等，2004）。
目前，针对军曹鱼的研究主要集中于其对蛋白、脂肪、氨基酸的需求和蛋白替代的研究（Chou等,2001；Craig等，2006；Wang等，2005；Lunger等，2006，2007a,b；Zhou等，2006，2007；Chou等，2004；）。
关于军曹鱼对维生素需求的研究报道很少，其对维生素C需要量的研究尚未见任何报道。
2.材料和方法
2.1．实验设计
以无维酪蛋白、明胶和鱼肉浓缩蛋白为蛋白源，鱼油和卵磷脂为脂肪源，糊精作为主要糖源配制出基础饲料（表1）。
基础饲料蛋白含量47%，脂肪14%，均满足军曹鱼正常生长之需要（Chou等,2001）。
维生素C单独添加到基础饲料中，添加梯度为0，10，30，90，270，810mg/kg饲料，从而构成六种实验饲料。
经高效液相色谱（HPLC）分析，六种饲料中维生素C实际含量为2.70，8.47，28.33，80.58，240.79和733.24mg/kg饲料。
所有原料经粉碎后过60目筛。
将所有原料用鱼油混匀，然后加水制成团状，挤条后鼓风阴干12小时。
干燥后破碎，制成规格为2.5×5.0mm的饲料颗粒，保存于-20℃环境中。
2.2．实验过程
本实验所选用的实验对象为当年孵化的同一批规格一致的军曹鱼幼鱼，养殖实验在流水养殖系统中进行，流速为2L/min。
实验开始前先用基础饲料进行驯化，为期2周。
驯化期间饱食投喂，每天投喂两次（8:
00,17:
00）。
实验开始前，将实验鱼禁食24小时，用1:
10000的丁香酚麻醉后称重。
挑选体重相近的军曹鱼（4.6±0.4g）随机放置于18个300升的水族箱中，每桶放置军曹鱼25尾，每个处理设置三个重复。
每天投喂两次（8:
00,17:
00）,饱食投喂，实验为期10周。
实验期间水温变化范围：
28.5-32℃，盐度变化范围：
24-26‰，溶氧含量：
≥7mg/L。
2.3．样品收集
实验结束时，将鱼禁食24小时，然后确认每个桶中鱼的数量并将所有的实验鱼逐条称重。
每个桶随机取5条鱼保存于-20℃中，用于鱼体组分测定。
每个桶中随机取5条鱼解剖取其肝脏和背部相同部位的肌肉，然后将所取肝脏和肌肉分装后保存于-70℃中至使用。
2.4．样品分析测定方法
2.4.1．军曹鱼体成分
测定方法参照AOAC（1995）：
鱼体蛋白含量采用凯氏自动定氮仪测定，鱼体脂肪含量采用索氏抽提仪测定，鱼体灰分含量采用马福炉灼烧24小时后测定，鱼体水分含量采用鼓风烘箱105℃烘干24小时后测定。
2.4.2．饲料、肝脏和肌肉中维生素C的含量
饲料和组织中维生素C的测定参照艾庆辉等（2004）的方法进行。
称取肝脏或肌肉约2g放到50ml离心管中,加入9倍体积预冷的5%偏磷酸溶液，在冰浴状态下匀浆2min，然后离心6min（2739×g）。
对于饲料样品，将饲料粉碎后称取3-5g，放入250ml三角瓶中，加入100ml蒸馏水和25ml氯仿后机械震荡25min。
取上清液30ml移至塑料离心管中，在4℃条件下离心5min（2739×g）。
取1ml上清液加入0.2M醋酸缓冲液（pH=4.8，含DTT0.2%），再加入5mg酸性磷酸酶混匀。
37℃水浴加热2小时后在4℃条件下离心6min（2739×g）。
上清液用0.22um的滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。
仪器为Agilent1100型HPLC仪，ZobarC18反相色谱柱，4.6×250nm。
流动相为0.05MKH2PO4（用磷酸将pH值调至3.0），流速为0.6ml/min，检测波长为254nm，柱温30℃，进样量为20uL。
适量的抗坏血酸（SigminaChemicalsCo.）溶解在超纯水中作为标准样品。
2.5.数据计算和统计方法
存活率＝[（Ni－Nt）/100]×100%
增重率（WG）=（Wt-Wi）/Wi×100%
饲料转化率（FER）＝WWG/Ip
摄食率（FR）=Ip/[（Wt+Wi）/2]/D/N
Wt表示最终体重均值（g）；Wi表示初始体重均值（g）。
Ni表示初始鱼的数目；Nt表示最终鱼的数目；WWG表示湿重增加；Ip表示总饲料摄入量；D表示实验天数；N表示每个桶中实验鱼的数量。
采用SPSS13.0forWindows对所得数据进行方差分析，若差异达到显著，则进行Tukey多重比较，显著水平为P<0.05。
结果表示为平均值±标准误（mean±S.E.M）。
根据WG或FER数据，通过折线模型（broken-linemodel，Robbins等，1979）确定军曹鱼对维生素C的最适需求量。
模型方程为Y=L-U（R-XLR）,其中Y是用于估计需要量的指标，R、L为折点坐标（R，L），R为要计算的需要量，XLR是小于R的自变量（X）值，U是直线的斜率；当X>R时，定义（R-XLR）=0。
3．实验结果
3.1饲料中维生素C水平对军曹鱼生长的影响
未添加维生素C的饲料组发现有生长不良、死亡率升高、活力下降和摄食降低等缺乏症。
未发现有军曹鱼出现脊柱弯曲或鳍下出血等其他维生素C缺乏症。
添加维生素C的饲料组未观察到有缺乏症出现。
经过10周的生长实验，军曹鱼的存活率在46.67%-92.00%之间（表2）。
对照组军曹鱼的存活率（46.67%）明显低于其它各处理组（分别为62.67%、88.00%、92.00%、89.33%和92.00%）。
饲料中维生素C含量为8.47mg/kg饲料组军曹鱼的存活率显著低于饲料中维生素C水平≥28.33mg/kg饲料组，而且后三个饲料组之间存活率差异不显著。
对照组军曹鱼的摄食率最低，显著低于维生素C含量大于或者等于28.33mg/kg的饲料组。
维生素C含量为2.7mg/kg饲料组军曹鱼的增重率（136.09%）明显低于其他各饲料组。
随着饲料中维生素C水平的不断升高，军曹鱼的增重率得到明显改善，当饲料中维生素C含量由8.47mg/kg升高至28.33mg/kg时，军曹鱼的增重率也由220.80%显著提高至359.17%。
当饲料中维生素C的水平达到80.58mg/kg饲料时，军曹鱼增重率明显提高至494.54%，此后随着饲料中维生素C含量继续的增加，军曹鱼的增重率不再发生显著变化（494.54%-510.22%）。
各饲料组的饲料转化率（FER）与增重率存在相同的变化趋势。
根据饲料维生素C水平与军曹鱼增重率的关系，经折线模型拟合后得：
Y=499.34-8.26（44.74-X）（R2=0.969）（图1）
以增重率为评价指标，军曹鱼对饲料维生素C的最适需要量为44.739mg/kg。
3.2.饲料中维生素C的水平对军曹鱼体组成和组织中维生素C含量的影响
经过10周的生长实验，饲料中不同的维生素C水平对鱼体的蛋白、脂肪、水分和灰分含量没有显著影响。
粗蛋白含量在18.3-20.7%之间，粗脂肪含量在9.2-10.0%之间，灰分含量在2.7%-3.1%之间，水分含量在67.7%和68.8%之间。
肝脏和肌肉中维生素C含量与饲料中维生素C的水平的变化成正相关关系。
肝脏中维生素C的含量要远远高于肌肉中维生素C的含量。
对照组军曹鱼肝脏维生素C含量显著低于添加维生素C的饲料组。
随着饲料维生素水平的提高，军曹鱼肝脏维生素C含量显著升高。
当饲料中维生素C水平达到或超过53.94mg/kg时，肝脏中维生素C含量保持在一个较高且稳定的状态（110.30-111.51ug/g肝脏）。
肌肉维生素C含量与肝脏存在相似的变化趋势，当饲料维生素C含量达到或高于103.72mg/kg时，军曹鱼肌肉中维生素C的含量达到最高水平（31.45-31.55ug/g肝脏），显著高于维生素C含量低于103.72mg/kg的饲料组（1.33-24.08ug/g肝脏）。
根据肝脏中维生素C含量与饲料中维生素C水平的关系，经折线模型拟合后得：
Y=110.88-1.98（53.94-X）（R2=0.991）（图2）
以肝脏中维生素C的含量为评价指标，军曹鱼对饲料中维生素C的最适需要量为53.94mg/kg饲料（图2）。
根据肌肉中维生素C含量与饲料中维生素C水平的关系，经折线模型拟合后得：
Y=31.50-0.26（103.72-X）（R2=0.938）（图3）
以肌肉中维生素C的含量为评价指标时，军曹鱼对饲料中维生素C的最适需要量为103.72mg/kg饲料（图3）。
4．讨论
经过10周的生长实验，对照组军曹鱼出现生长不良、摄食下降和死亡率高等缺乏症。
这些典型缺乏症在其他鱼类维生素C需要量的研究中也有相关报道。
如斑点叉尾鮰（Lim和Lovell，1978）、印度鲤（Cirrhinamrigala）（Mahajan和Agrawal，1980）、日本鹦嘴鱼幼鱼（Oplegnathusfasciatus）（Ishibashi等，1992）和杂交罗非鱼（Orechromisniloticus×O.aureus）（Shiau和Hsu，1999）。
在本研究中，未观察到脊柱侧凸和脊柱前弯症。
在本研究中，随着饲料中维生素C水平的不断升高，军曹鱼的生长状况得到了明显的改善，并且在饲料中维生素C水平达到44.74mg/kg时达到一个较为稳定的平台。
这说明军曹鱼为了满足正常的生长和维持正常的生理功能必须从外界摄取足够多的维生素C。
相似的结论也出现在对罗非鱼（Al-Amoudi等，1992）、鲤鱼（Gouillou-Coustans等，1998）、杂交罗非鱼（ShiauandHsu，1999）、鹦鹉鱼（Wang等，2003）和日本鲈鱼（Ai等，2004）等的研究中。
在本实验中，军曹鱼获得最大增重率时，饲料中维生素C的最少含量应该为44.74mg/kg饲料。
这一数值与石斑鱼（Lin和Shiau，2005）和鲤鱼（Gouillou-Coustans等，1998）对饲料维生素C的最适需要量（分别为45.3mg/kg和45mg/kg）比较接近。
这一需要量比某些鱼类要高，如斑点叉尾鮰达到最佳生长时所需要的饲料中维生素C的最低水平为15mg/kg饲料（Mustin和Lovell，1992），杂交条纹鲈为22mg/kg饲料（Sealey和Gatlin，1999），杂交罗非鱼为15.98mg/kg饲料（Shiau和Hsu，1999）。
然而在本实验中基于生长所得出的维生素C需要量低于罗非鱼（Oreochromisspilurus）（100–200mg/kg,Al-Amoudi等，1992）、鹦鹉鱼（118mg/kg,Wang等，2003）、日本鲈鱼（53.5mg/kg,Ai等，2004）。
这些差异的产生主要由于鱼的种类、规格、所添加维生素C的形式和实验条件的不同所致。
Dabrowski（1991）认为代谢率是调节维生素C需要量的主要因素。
既然不同鱼类之间存在较大的代谢差异，那么维生素需要量在不同鱼种之间也会存在较大的差异。
另一方面，维生素C的不同形式在鱼体内的利用也存在较大差异。
由于维生素C本身极易被氧化（Hilton等，1977；Lovell和Lim，1978；Soliman等，1987），所以在饲料中的添加形式往往是其比较稳定的磷酸盐或者硫酸盐。
本实验中所采用的维生素C的形式是LAPP。
在其他的研究中所采用的维生素C的形式有L-抗坏血酸，L-抗坏血酸硫酸酯，L-抗坏血酸-2-单磷酸钠和L-抗坏血酸-2-单磷酸镁（Al-Amoudi等，1992；Shiau和Hsu，1999；Wang等，2003），这也是产生差异的原因之一。
肝脏和肌肉中的维生素C含量经常被用作评价鱼类维生素C营养状态的指标（White等，1993；Gouillou-Coustans等，1998；Ai等，2004，2006）。
Dabrowski等（1990）认为维持组织中维生素C稳定状态所需要的维生素C即维生素C最适需要量。
在本研究中，军曹鱼肝脏和肌肉维生素C含量与饲料维生素C水平呈现显著的正相关关系。
对其他鱼类的研究也得到相似的结果（Lim和Lovell，1978；Sato等，1978；Dabrowski等，1990；Boonyaratpalin等，19991；Cho和Cowey，1993；Thompson等，1993；Shiau和Hsu，1999；Ai等，2004，2006）。
以肝脏和肌肉中维生素C的最大蓄积量为评价指标时，饲料中维生素C的适宜含量分别为53.94和103.72mg/kg，高于以增重率为评价指标时所得到的适宜需要量。
这与Gouillou-Coustans等（1998）和Ai等（2004）研究所得到的结论相似。
前者以鲤鱼为研究对象，发现维持鲤鱼最佳生长所需的饲料中维生素C的最适含量45mg/kg，但是当饲料中维生素C含量达到或高于270mg/kg时，组织中的维生素C蓄积量才达到最大。
后者认为当饲料中维生素C的水平分别达到或高于93.4mg/kg和207.2mg/kg时，鲈鱼的肝脏和肌肉中维生素C的蓄积量达到最大水平且明显高于满足生长时所需要的维生素C含量（53.5mg/kg）。
然而，Shiau和Hsu（1999）认为饲料中维生素C的增加不会使罗非鱼肝脏中维生素C含量达到比较稳定的状态。
这种差异主要是由于鱼的种类，试验饲料和维生素C的添加量不同所致。
Shiau和Hsu在罗非鱼饲料中添加维生素C的最大水平为120mg/kg，远远低于本实验中的最高水平添加量（733.24mg/kg）。
因此，很可能是由于饲料中维生素C的水平还不足以使罗非鱼肝脏内维生素C含量达到饱和状态。
本研究结果表明，军曹鱼维持正常生理状态所需要的维生素C要高于维持最佳生长所需要的维生素C。
在本研究中，军曹鱼肌肉维生素C达到最大蓄积量时饲料维生素C的水平（103.72mg/kg）高于肝脏（53.94mg/kg）。
这一结果表明维生素C在军曹鱼肝脏中的存留时间比在肌肉中长，与肝脏相比，军曹鱼的肌肉需要更多的维生素C以达到稳定的生理状态。
经过11周（10周养殖试验+1周驯化）的生长实验，对照组军曹鱼肝脏或者肌肉中的维生素C并没有完全消耗掉。
可能是对照组饲料本身含有一定量的维生素C或者是军曹鱼原本在组织中贮存了较多的维生素C。
当军曹鱼肝脏维生素C含量达到最高水平时饲料维生素C水平为53.94mg/kg，远低于肌肉维生素C含量达到最高水平时的饲料维生素水平103.72mg/kg。
这说明军曹鱼肝脏维生素C含量是比肌肉维生素C含量更为敏感的指标。
肝脏是动物维生素C代谢的主要器官（Gabor等，1997；Dabrowski等，1994）。
维生素C在动物肠道中被吸收后首先转运到肝脏，满足肝脏的贮存和代谢需求后，过量的维生素C再从肝脏转运到肌肉或者其他组织。
本研究中，军曹鱼肝脏维生素C含量远远高于肌肉维生素C含量，随着饲料维生素C水平的提高，肝脏维生素C的增长幅度远远大于肌肉。
这进一步说明肝脏是维生素C贮存和代谢的重要器官。
因此，肝脏维生素C含量是评价军曹鱼维生素C营养状态更为敏感和重要的指标。
总之，军曹鱼需要从外界摄取一定的维生素C用于正常生长。
饲料中缺乏维生素C会延缓军曹鱼的生长，而且饲料中过高的维生素C水平不会对军曹鱼的生长产生负面影响。
在本研究条件下，饲料中过量的维生素C不会继续再体内沉积。
分别以增重率、肝脏中维生素C含量和肌肉中维生素C含量为评价指标时，军曹鱼对饲料中维生素C的最适需要量分别为44.74mg/kg，53.94mg/kg和103.72mg/kg。
表1实验基础饲料配方及营养组成（%干物质）
Table1.Formulationandchemicalproximatecompositionofexperimentalbasaldiets（%drymatter）
原料（Ingredients）
含量（%）
无维酪蛋白（Casein，Vitamin-free）
36
明胶（Gelatin）
9
鱼肉蛋白浓缩物（Fishproteinconcentrate）
5
糊精（Dextrin）
25
微晶纤维素（Microcrystallinecellulose）
3.8
鱼油（Fishoil）
11
无机盐混合物（Mineralmix）1
4.5
维生素混合物（VitaminmixvitaminCfree）2
2
卵磷脂（Lecithin）
3
诱食剂（Attractant）3
0.7
主要成分（Proximateanalysis）
粗蛋白（Crudeprotein）
47.3
粗脂肪（Crudelipid）
14
1无机盐混合物（g/100g混合物）：
氟化钠，20mg;碘化钾，8mg;氯化钴（1%），500mg;硫酸铜，100mg;硫酸亚铁，800mg;硫酸锌，500mg;硫酸锰，600mg;硫酸镁，12,000mg;磷酸二氢钙，80,000mg;氯化钠，1,000mg;沸石粉，4,472mg.
1Mineralpremix（mg/100gmix）:
NaF,20mg;KI,8mg;CoCl2·6H2O（1%）,500mg;CuSO4·5H2O,100mg;FeSO4·H2O,800mg;ZnSO4·H2O,500mg;MnSO4·H2O,600mg;MgSO4·7H2O,12,000mg;Ca（H2PO4）2·H2O,80,000mg;NaCl,1,000mg;Zoelite,4,472mg.
2维生素混合物（mg/kg饲料）：
硫胺素，25mg;核黄素，60mg;盐酸吡哆醇，20mg;维生素B12，0.1mg;维生素K3，10mg;肌醇，800mg;泛酸，60mg;叶酸，20mg;烟酸，200mg;生物素，1.20mg;维生素A,32mg;维生素D,5mg;维生素E,120mg;氯化胆碱，2000mg;乙氧基喹啉，150mg;糊精，12625mg.
2Vitaminpremix（mg/kgdiet）:
thiamin,25mg;robiflavin,60mg;pyridoxine-HCl,20mg;VitaminB12,0.1mg;VitaminK3,10mg;inositol,800mg;pantothenicacid,60mg;folicacid,20mg;niacinacid,200mg;biotin,1.20mg;retinolacetate,32mg;cholecalciferol,5mg;alpha-tocopherol,120mg;cholinechloride,2000mg;ethoxyquin,150mg;dextrin,12625mg.
3诱食剂（g/7g混合物）：
牛磺酸，1g;盐酸甜菜碱，3g;甘氨酸，3g.
3Attractant（g/7gmix）:
taurine,1g;betain-HCl,3g;glycine,3g.
表2饲料中不同的维生素C水平对军曹鱼存活率、增重率、饲料转化率和摄食率的影响（平均值±标准误,n=3）1,2
Table2Effectofdietaryascorbicacidlevelsonsurvival,weightgain,feedefficiencyratio（FER）andfeedingrate（FR）ofcobia（Rachycentroncanadum）fedexperimentalfeedsfor10weeks（mean±S.E.M.,n=3）1,2
饲料编号
DietNo.
维生素C
Ascorbicacid
（mg/kg）
初始体重
Initialweight
（g）
存活率
Surival
（%）
增重率
Weightgain
（%）
饲料转化率
FER
（%）
摄食率
FR
（%/day）
Diet1
2.70
4.6±0.4
46.67±1.33c
136.09±14.34d
23.55±3.42d
2.14±0.07c
Diet2
8.47
4
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