科学仪器学离心机备考复习Word文件下载.docx

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颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。

S=（1/ω2X）·

（dx/dt）=（1/ω2dt）·

（dx/X）

积分得：

S=2.303·

（logX2-logX1）/ω2（t2-t1）

若ω用2πn/60表示，则S=2.1×

102log（X2/X1）/n2（t2-t1）式中X1为离心前粒子离旋转轴的距离；

X2为离心后粒子离旋转轴的距离。

S实际上时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。

6.1.4沉降速度（sedimentationvelocity）沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。

dx/dt=[2r2（ρp-ρm）/9η]·

ω2X=[d2（ρp-ρm）/18η]·

ω2X式中r为球形粒子半径，d为球形粒子直径；

η为流体介质的粘度；

ρp为粒子的密度；

ρm为介质的密度。

从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；

离心力场增大，粒子的沉降速度也增加，将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表示式也可表示为：

S=（1/ω2X）·

（dx/dt）=d2（ρp-ρm）/18η

从该式中可看出，

（1）当ρp>

ρm，则S>

O，粒子顺着离心方向沉降。

（2）当ρp=ρm，则S=0，粒子到达某一位置后达到平衡。

（3）当ρp<

ρm，则S<

O，粒子逆着离心方向上浮。

6.1.5沉降时间（sedimentationtime，Ts）在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。

如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。

根据沉降系数（S）式可得：

（dx/dt）dt=（1/ω2S）·

t2-t1=（1/ω2S）·

ln（X2/X1）

式中X2为离心转轴中心至离心管底内壁的距离；

X1为离心转轴至样品溶液弯月面之间的距离，那么样品粒子完全沉降到底管内壁的时间（t2-t1）用Ts表示则上式可改为：

TS=（1/Sω2）·

ln（XMAX/XMIN）

式中Ts以小时为单位，S以Svedberg为单位。

6.1.6K系数（kfactor）K系数是用来描述在一个转子中，将粒子沉降下来的效率。

也就是溶液恢复成澄清程度的一个指数，所以也叫“cleaningfactor”。

原则上，K系数愈小的，愈容易，也愈快将粒子沉降。

K=2.53×

1011ln（Rmax/Rmin）/（rpm）2

其中Rmax为转子最大半径；

Rmin为转子最小半径。

由其公式可知，K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关。

所以K系数是一个变数。

当转速改变，或者离心管的溶液量不同，即粒子沉降的路径改变时，K系数就改变了。

通常，离心机的转子说明书中提供的K系数，都是根据最大路径及在最大转速下所计算出来的数值。

如果已知粒子的沉降系数，再利用当时条件下的K系数，就可以估计离心分离的时间。

例如要离心一个沉降系数为80S的Polysome，采用的转子的K系数是323，那么预计沉降到管底所需的离心时间是T=k／S=4h，利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合，对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间来得快些。

6.2离心机分类

离心机分为二大类，即制备性和分析性离心机。

6.2.1制备性离心机

制备性离心机又可分为三类：

1、普通离心机最大转速6000rpm左右，最大相对离心力近6000×

g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。

这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。

2、高速冷冻离心机最大转速为20000～25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000×

g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0～40C，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示，通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器（如核蛋白体）或单个分子。

3、超速离心机转速可达50000～80000rpm，相对离心力最大可达510000×

g，最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等，离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。

超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。

6.2.2分析性超速离心

与制备性超速离心不同的是：

分析性超速离心主要是为了研究生物大分子的沉降特性和结构，而不是专门收集某一特定组份。

因此它使用了特殊的转子和检测手段，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程，见图34。

1．测定生物大分子的相对分子量测定相对分子量主要有三种方法，沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。

其中应用最广的是沉降速度，超速离心在高速中进行，这个速度使得任意分布的粒子通过溶剂从旋转的中心辐射地向外移动，在清除了粒子的那部分溶剂和尚含有沉降物的那部分溶剂之间形成一个明显的界面，该界面随时间的移动而移动，这就是粒子沉降速度的一个指标，然后用照相记录，即可求出粒子的沉降系数。

（dx/dt）

分子或粒子的相对分子量则可从Svedberg方程式来确定：

M=RTS/[D（1-υρ）]

式中M：

该分子不含水的相对分子量；

R：

气体常数；

T：

绝对温度；

S：

分子的沉降系数；

υ：

分子的微分比容（当一克溶质加到一个大体积的溶液中所占有的体积）；

ρ：

溶剂的密度。

2．生物大分子的纯度估计分析性超速离心已广泛地应用于研究DNA制剂、病毒和蛋白质的纯度。

用沉降速度的技术来分析沉降界面是测定制剂均质性的最常用方法之一，出现单一清晰的界面一般认为是均质的，如有杂质则在主峰的一侧或二侧出现小峰。

3．分析生物大分子中的构象变化分析性超速离心已成功地用于检测大分子构象的变化，例如DNA可能以单股或双股出现，其中每一股在本质上可能是线性的，也可能是环状的，如果遇到某种因素（温度或有机溶剂）DNA分子可能发生一些构象上的变化，这些变化也许可逆、也许不可逆，这些构象上的变化可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。

图33分析型超速离心机

6.3离心机转头

1、角式转头：

角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。

它是由一块完整的金属制成的，其上有4～12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20～40度之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。

这种转头的优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。

图34角式转头分离效果

2、水平式转头：

这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶（离心套管）构成。

当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心，其优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。

其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长，水平式转头离心效果见下图。

3、垂直转头：

其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢，垂直转头离心效果见下图。

图35三种类型离心机转头及离心管

6.4离心管：

离心管主要用塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。

塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。

缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。

不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。

但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。

塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。

管盖有三种作用：

①防止样品外泄。

用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。

②防止样品挥发。

③支持离心管，防止离心管变形。

6.5离心分离方法

6.5.1差速离心法

利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。

操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。

差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份

图36差速离心法分离已破碎的细胞各组份

6.5.2速率区带离心法速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。

离心后在近旋转轴处（X1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（X2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρp>

ρm。

这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。

梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。

由于ρp>

ρm可知S>

0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。

如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部，离心时间不足，样品还没有分离。

由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。

常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

6.5.3等密度离心法

等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。

当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρp<

ρm时粒子上浮；

在弯顶处ρp>

ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρp=ρm时，dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

一般在物质的大小相近，而密度差异较大时应用此法。

常用的梯度液是CsCl。

6.6梯度溶液的制备

1.梯度材料的选择原则作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：

（1）与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。

（2）可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。

（3）不会对离心设备发生腐蚀作用。

（4）容易纯化，价格便宜或容易回收。

（5）浓度便于测定，如具有折光率。

（6）对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。

这些条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。

下面介绍几种基本上符合上述原则的梯度材料：

（1）糖类：

蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。

（2）无机盐类：

CsCl、RbCl、NaCl、KBr等。

（3）有机碘化物：

三碘苯甲酰、葡萄糖胺等。

（4）硅溶胶：

如Percoll。

（5）蛋白质：

如牛血清白蛋白。

（6）重水。

（7）非水溶性有机物：

如氟代碳等。

2.梯度材料的应用范围

（1）蔗糖：

水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。

（2）聚蔗糖：

商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。

主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

（3）氯化铯：

是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。

由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较贵。

（4）卤化盐类：

KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。

NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

（5）Percoll：

是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，它对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。

它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。

3．密度梯度超速离心方法

将二个不同浓度的梯度液分装于梯度混合器中，右侧为高浓度梯度液，左侧为低浓度梯度液，打开二室间的控制阀，右室在磁力搅拌器搅动下，打开梯度加液阀，缓缓的将梯度液沿管壁加入离心管中，此时由于右室液平面下降，而左室的液体不断的补充，使离心管中的液体从高浓度向低浓度产生线性梯度。

密度梯度离心管制备后，将需分离的样品小心的加在离心管的上方，然后装到水平式转头上开始离心，离心过程中，样品中的成份根据其密度不同而在相应的梯度液中沉降下来，产生清晰的分离条带，离心完成后取出离心管，可用以下几种方法收集不同区带的样品组份：

（1）用注射器和滴管由离心管上部吸出。

（2）有针刺穿离心管底部滴出。

（3）用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。

（4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集，见图37。

6.7离心操作的注意事项：

高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。

1.使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。

2.装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。

每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。

3.若要在低于室温的温度下离心时。

转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

4.离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。

5.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。

每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。

图37密度梯度超速离心方法

实验二十二序列超速离心分离血浆脂蛋白

【目的与要求】

了解超速离心分离技术的原理，掌握制备性分离血浆脂蛋白的方法。

【原理】

基本原理见第六章6.1、6.2节。

本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过序列超速离心大量制备各种血浆脂蛋白，经透析脱盐、PEG20000浓缩后保存备用。

【操作步骤】

1．血浆制备：

取献血员全血400mL，EDTANa2抗凝，2000rpm离心15min，分离血浆。

根据血

浆体积，加入0.015%的苯甲基氟磺酰（PMSF），防止脂蛋白变性。

2．CM和VLDL分离：

血浆中加入适量的NaBr，调节密度至1.019g/ml，分置于离心管（38.5ml/管）中，加盖，用1.019g/ml密度液平衡，放入RP50T转头，在10℃下40，000rpm（145，000×

g）离心20小时。

CM和VLDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。

3．LDL分离：

下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.060g/ml，分置于离心管中，加盖，

用1.060g/ml密度液平衡，放入RP50T转头，在10℃下40，000rpm（145，000×

LDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。

4．Lp（a）和HDL分离：

下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.125g/ml，分置于离心

管中，加盖，用1.125g/ml密度液平衡，放入RP50T转头，在10℃下45，000rpm（185,000×

g）离心24小时。

Lp（a）、HDL和少量LDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。

5．HDL分离：

下层溶液中加入适量的NaBr，调节密度至1.21g/ml，分置于离心管中，加盖，

用1.21g/ml密度液平衡，放入RP50T转头，在10℃下45，000rpm（185，000×

HDL浮于离心管上层，用吸管小心吸取。

下层含有总量的50%的游离apoA-Ⅳ，可用于分离apoA-Ⅳ。

6．透析：

已分离好的各部分脂蛋白含有大量的NaBr，需要透析脱盐。

将各种脂蛋白溶液分别

装入透析袋中，对抗0.01mol/LPBS（pH7.4）溶液透析，每6小时更换1次透析液，共3次，第3次可透析过夜。

7．浓缩：

透析过夜的脂蛋白溶液连同透析袋一起放入盛有40%的PEG20000的烧杯中，浓缩至

适当体积。

注：

也可以透析和浓缩一步进行，即将分离后的脂蛋白溶液装入一端接有梨形瓶的透析袋中（此透析袋能抵抗1个以上大气压），透析袋浸入2000ml装有0.01mol/LPBS（pH7.4）透析液的量筒中，梨形瓶的另一端通入氮气，施加1个大气压（760mmHg）的氮气后将梨形瓶的一端扎死，为了使透析效率增加，透析过程使用磁力搅拌，并不断更换透析液。

当样品被浓缩至一定浓度（或体积）后停止透析，取出样品。

【试剂】

1．NaBr

2．密度液：

以NaBr与双蒸水配制，以比重计测定密度。

配制成1）1.019g/ml；

2）1.060g/ml；

3）1.125g/ml；

4）1.21g/ml四种密度液。

3．苯甲基氟磺酰（PMSF）

4．0.01mol/LPBS（pH7.4）

5．40%PEG20000

【材料】

1．比重计：

1.000-1.100g/ml和1.100-1.200g/ml比重计

2．离心管：

聚碳酸酯厚壁离心管，Hitach

3．角度转头：

RP50THitach

4．超速离心机：

HitachCP80MX

5.平衡天平

实验二十三密度梯度超速离心法分离血浆脂蛋白

了解超速离心分离技术的原理，掌握分析性分离血浆脂蛋白的方法。

本实验以KBr为密度介质制备不连续密度梯度溶液，利用各血浆脂蛋白颗粒密度不同，经过一次超速离心分离各血浆脂蛋白，经透析脱盐、PEG20000浓缩后保存备用。

1．按0.325gKBr/ml血浆的加样量加入固体KBr，溶解，以调节血浆密度至1.21g/ml。

2．吸取4.0ml血浆加入13.5ml容积的超速离心管底部。

不足4.0ml的血浆样品以密度液A补足至4.0ml。

3．取3.0ml密度液B，用吸管移液法沿离心管内壁（倾斜45°

）缓慢加入超速离心管，小心注意：

勿使两液面相混。

4．取3.0ml密度液C，同法加入超速离心管。

5．取2.5-3.0ml密度液D，同法加入超速离心管。

上盖，放入SW41转头。

6．10℃，41000rpm（286，000×

7．离心后，CM和VLDL位于离心管顶部；

LDL位于其下1.019g/ml与1.063g/ml两层的结合部；

HDL位于1.063g/ml与1.21g/ml两层的结合部。

8．用虹吸法或切割法小心取出各血浆脂蛋白，分别装入透析袋中，对抗0.01mol/LPBS（pH7.4）溶液透析过夜。

9．将透析过夜的脂蛋白溶液连同透析