而50mg／kgbwMLF对肝脏XO活性的无明显影响（P>0．05），但能极显著降低模型小鼠血清尿酸含量（P<0．01）。
长期高尿酸血症导致肾损害和痛风，肾损害亦可致尿酸排泄障碍。
为进一步探讨桑叶黄酮对病理状态下的尿酸代谢及相关肾损伤的影响，本实验继续研究了MLF对腺嘌呤联合高糖饲料诱导的大鼠高尿酸血症、肾损伤的防治作用。
在腺嘌呤联合高糖饲料诱导的高尿酸病理状态下，分别给予200、100、50mg/kg*d_1的MLF，以别嘌醇为阳性对照药物。
结果显示：
MLF中、高剂量组在给药1w后，血清UA水平分别降低17．83％和21．17％；2w后降低21．09％和27．15％。
3w后MLF中剂量组血清尿酸接近于正常大鼠水平，XO活力比HC组显著降低25．01％。
200mg/kg*d_1MLF可使血清TG，FFA水平降低41．95％，42．05％，同时MLF可减小腺嘌呤造模引发的肝脏、心脏系数的异常。
降低高尿酸病理状态下肌酐和尿素氮含量，并通过电镜观察，MLF对腺嘌呤所引起肾脏损伤有一定的保护作用。
综合以上结果：
推断MLF具有明显的降尿酸活性，并对高尿酸病理状态下的肾脏损伤有一定的保护作用；MLF可能通过抑制XO和调节脂质紊乱来调节血清UA水平。
2、桑叶黄酮的提取纯化工艺研究
成分分析研究表明桑叶富含黄酮，为进一步利用桑叶资源，需研究其黄酮类化合物的提取、纯化方法。
大孔树脂物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长，现已广泛应用于天然产物的分离和富集。
大孔树脂的特性会影响黄酮分离的效果。
因此，本实验进一步分析桑叶总黄酮含量，优化桑叶总黄酮提取工艺，就大孔树脂纯化桑叶黄酮的工艺条件作研究。
（一）、桑叶黄酮类物质提取方法研究
1、材料、试剂和仪器
1．1材料：
桑叶（来源同前），芦丁标准品（上海试剂二厂），其它试剂均为国产
分析纯。
2、实验方法
2．1材料预处理：
用粉碎机粉碎，石油醚脱脂，常温挥干，备用。
2．2黄酮含量测定
标准曲线的制作
准确称取20mg芦丁标准品置50mL容量瓶加60％乙醇至刻度，摇匀。
量取25mL
置50mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，即得0．2mg／mL的芦丁标准液，精密量
取1．OmL，2．OmL，3．OmL，4．OmL，5．OmL，6．0mL此标准液于25mL容量瓶中以30％乙醇补足为6mL，摇匀，加5％亚硝酸钠1mL，放置6min后，加10％硝酸铝lmL，放置6min，再加4％氢氧化钠10mL，30％乙醇定容，摇匀，放置15min。
以不加样品作为空白，于505删波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到以芦丁计的总黄酮含量（x）与吸光度（y）之间的回归方程：
y：
1．8222x一0．0016，r=0．9977
2．3黄酮类化合物浸出率的计算
浸出率（％）=桑叶中提取的黄酮含量／桑叶的质量×100％
2．4．桑叶总黄酮提取工艺单因素试验
分别研究乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间等因素对提取桑叶总黄酮
含量的影响。
精确称取桑叶粉末2．Og，加50ml酒精，在相同的条件下提取，过
滤提取液，最后定容至50mL，并以浸提液中黄酮的吸光度为考察指标，在单因
素水平研究桑叶黄酮的提取方法。
2．5桑叶总黄酮提取工艺优化
在单因素试验的基础上，采用正交试验方法，优化桑叶总黄酮提取工艺。
选择乙醇浓度、料液比、时间和温度进行四因素三水平的正交试验，试验因素水平。
三、试验结论及桑叶黄酮的提取纯化工艺
通过单因素试验及正交试验，优化了桑叶总黄酮提取工艺。
本试验设计的提取温度、提取时间、提取次数、料液比四因素对总黄酮的提取效率都有显著影响。
各因素对提取效率的影响程度各异，影响桑叶总黄酮提取效率的各因素的主次顺
序为温度>提取次数>料液比>提取时间。
综合各种因素，确定桑叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度7096、提取温度80℃、料液比1：
2O、提取时间1．5h提取2次。
运用静态吸附与解吸实验对对5种吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，发现树脂的极性、比表面积和平均孔径的大小直接影响树脂吸附容量和解吸率。
结果表明，考察的几个大孔树脂中，HPD826型大孔树脂表现出最好的吸附性能与良好的解吸效果。
因此选用HPD826型大孔树脂对桑叶总黄酮进行纯化。
通过单因素实验、正交实验以及方差分析确定了桑叶总黄酮分离富集的最佳操作条件。
研究结果表明，最佳工艺条件为：
上样体积为1．5BV，上样速率控制在2Bv／h左右。
上样结束后，再用3Bv，60％的乙醇，以1BV／h的速率洗脱。
由本实验室制备流程是：
桑叶—->干燥—>粉碎—>石油醚脱脂—>乙醇提取—>过滤—>浓液离心—>石油醚萃取—>下层水溶液上柱纯化—>水洗—>乙醇洗脱—>收集洗脱液—>低温干干燥。
通过以上流程得到精制的桑叶黄酮，其纯度为55．41％。
本文主要就桑叶的活性成分、桑叶黄酮的提取纯化工艺研究、桑叶黄酮对正常小鼠尿酸代谢的影响和对高尿酸模型尿酸代谢的影响四个方面进行研究，现将主要成果总结如下：
l在成分分析方面，桑叶中含量较多的天然产物为多酚、黄酮和多糖，进一步采用唧LC法测定，桑叶含有较多芦丁，杨梅素，槲皮素，山奈素等黄酮类物质。
2通过桑叶黄酮的提取纯化工艺研究，综合各种因素，确定桑叶总黄酮的最佳提取纯化工艺，得到精制的桑叶黄酮。
3桑叶黄酮对正常小鼠的实验表明，MLF对正常状态下的小鼠无影响。
4桑叶黄酮对氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠的实验表明，MLF对于XO活性具有抑制作用，对高尿酸血症有一定的改善效应。
桑叶黄酮有效降低腺嘌呤诱导高尿酸血症大鼠的血尿酸水平，缓解高尿酸对肾脏的损伤，其可能的作用机理为：
一方面，本研究提示MLF组对肝脏XO有明显抑制作用，提示XO是MLF在体内的药物靶点之一。
另一方面MLF能影响磷酸戊糖途径，使uA生成减少，模型动物血清TG，UA水平均显著降低。
6.1.3桑叶1-脱氧野尻霉素提取分离方法研究
研究了从桑叶中提取分离1-脱氧野尻霉素（DNJ）,探讨了提取剂、提取方法、料液比、提取次数、时间等因素对提取率的影响。
实验表明:
提取的最佳条件为以65%的乙醇为提取剂,按料液比1∶8和1∶4超声强化细胞破碎20min（功率1800W）,732H阳离子树脂分离,0.25mol/L的氨水洗脱（洗脱速度1～2mL/min）,提取率为95.8%,得率为124.54mg/100g,纯度为92.3%以上。
本方法具有工艺流程简单、快速、提取率高的优点,适合于工业生产。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
桑叶,购于药材市场（经检测DNJ含量为130mg/100g）;732H阳离子交换树脂,钠型;食用乙醇（95%）;硫酸、盐酸、氨水、正丁醇、碘化钾等均为分析纯。
FZ102微型植物试样粉碎机;JY98-Ⅱ超声波细胞粉碎机;RE-52旋转蒸发器;752紫外可见光栅分光光度计。
1.2 工艺流程
图1 工艺流程图
Fig.1 Diagramofcraft
1.3 操作方法
将桑叶粉碎过40目筛,称取100g于1000mL烧杯中,加65%乙醇800mL浸泡30min,放入超声波细胞破碎机中处理20min,过滤,收集滤液,残渣加入400mL65%乙醇重复处理一次,过滤,弃去残渣,合并两次滤液,将滤液用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积,进行离心分离。
收集上清液并通过内装阳离子交换树脂的交换柱,用蒸馏水冲洗至流出液无色为止。
用0.25mol/L的氨水洗脱（洗脱速度1～2mL/min）,收集洗脱液。
将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩,用浓缩液一倍体积的正丁醇萃取3次,弃去水层合并正丁醇相,回收正丁醇,真空干燥即得成品。
1.4 提取率计算
提取率的定义为:
a=m1m×100%
（1）
式中 a———DNJ提取率,%;
m1———提取液中DNJ的含量,mg/100g;
m———样品中DNJ的含量,mg/100g。
2 结果与讨论
2.1 提取剂的选择
称取粉碎过40目筛的样品100g三份,放入三个1000mL烧瓶中,分别加入蒸馏水、0.25%的稀硫酸、65%乙醇800mL,在相同的条件下回流提取,过滤,定容至1000mL容量瓶中。
采用分光光度法测定DNJ的含量,结果见表1。
表1 不同提取剂与提取率的关系
Table1 Relationbetweenextractionrateandvarietyofsolvents
提取剂提取剂方法提取时间/h提取次数温度/℃料液比/（g·mL-1）DNJ提取量/[mg·（100g）-1提取率/%
蒸馏水回流提取21801∶878.2660.2
0.25%的稀硫酸回流提取21801∶8106.9982.3
65%的乙醇回流提取21801∶8103.2279.2
由表1可知,0.25%的稀硫酸提取率最高,65%乙醇次之,蒸馏水最差。
因为DNJ属于生物碱类化合物,易溶解于酸性介质,形成可溶性盐。
从实验结果来看65%乙醇与0.25%的稀硫酸对DNJ的提取率相差不大,而稀硫酸提取液过滤及浓缩相对困难,故本方法采用65%乙醇作为提取剂。
2.2 提取方法的选择
取样品100g两份,一份加65%的乙醇800mL于1000mL烧杯中,放入超声波细胞破碎机中提取,另一份放入1000mL烧瓶中,加入相同浓度和相同体积的乙醇,在80℃下进行回流提取,
图2 不同提取方法与提取率的关系
Fig.2 Relationbetweenextractionrateand
differentextractionmethods
由图2可知,20min时,超声强化细胞破碎提取法的提取率为92.7%,2h时热回流法的提取率为79.2%。
超声强化细胞破碎法提取与常规热回流相比,DNJ提取率高13.5%,时间仅为1/6。
这是因为当桑叶在溶剂中受到超声作用后,超声产生的空化效应,使溶剂随超声产生的空化泡的崩溃,很快渗透到桑叶内部细胞中,并使细胞内的DNJ快速渗透、溶解并转入溶剂,使细胞内外出现浓度差,促使DNJ从高浓度溶液向低浓度溶液中扩散,大大加速了提取过程。
同时伴随着空化泡崩溃瞬间释放出来的能量,使桑叶中的细胞壁破裂,溶剂直接进入细胞内部,使细胞中的DNJ在超声作用下直接转入溶剂中,通过溶剂将细胞中的DNJ在很短时间内全部提
取出来。
与传统提取法相比,增加了物质内部化学成分的提取率。
而热回流法随着时间的延长,提取率开始增高后有所下降,是部分DNJ遭到破坏所致。
2.3 提取时间的选择
将样品100g,加入65%的乙醇800mL于1000mL烧杯中,放入超声波细胞破碎机中提取,测定不同时间的提取率,超声强化细胞破碎提与提取率的关系见图3。
图3 超声强化细胞破碎提取时间与提取率的关系
Fig.3 Relationbetweenextractionrateandultrasonictime
由图3可知,提取率随超声波提取时间的增加而增大,20min时,随着时间的增加,提取率趋于平缓。
本实验选取20min作为提取时间。
2.4 乙醇浓度的选择
取样品100g四份,分别加入50%,60%,65%和70%四种不同浓度的乙醇800mL于1000mL烧杯中,在相同条件下进行超声强化细胞破碎提取一次,测定DNJ含量,结果见表2。
表2 不同乙醇浓度与提取率的关系
Table2 Relationbetweenextractionrateand
differentconcentrationofethanol
溶剂提取方法超声时间/min提取次数DNJ提取量/[mg·（100g）-1]提取率/%
50%乙醇超声破碎提取20180.8662.2
60%乙醇超声破碎提取20190.2269.4
65%乙醇超声破碎提取201120.5192.7
70%乙醇超声破碎提取201116.6489.5
由表2可知,65%乙醇提取效果最好。
2.5 料液比及提取次数的选择
取样品100g四份,加入65%乙醇,按料液比（摩尔比）1∶4,1∶6,1∶8,1∶10进行超声强化细胞破碎提取两次,每次20min,结果见表3。
表3 不同料液比与提取率的关系
Table3 Relationbetweenextractionrateand
differentmaterialliquidratio
料液比/（g·mL-1）提取次数DNJ提取量/[mg·（100g）-1]提取率/%
1∶41110.7685.2
2119.7392.1
1∶61117.3990.3
2121.9493.8
1∶81120.5192.7
2126.4997.3
1∶101122.9894.6
2127.5398.1
由表3可知,随着料液比的增加,溶解出来的产物也增多。
当料液比为1∶8一次提取时,已有92.7%的DNJ被提取出来,两次为97.3%,但过多的乙醇会给后工序的乙醇回收造成负担。
故选用料液比为1∶8和1∶4各一次提取,这时的提取率为95.8%。
2.6 成品分离及纯度检测
取样品100g于1000mL烧杯中,按照上述实验得到的最佳提取条件进行超声强化细胞破碎提取,DNJ得率为124.54mg/100g。
将得到的DNJ提取液上内装阳离子交换树脂的交换柱,用蒸馏水洗至流出液无色为止。
用0.25mol/L的氨水洗脱（洗脱速度1～2mL/min）,收集洗脱液。
将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩,正丁醇萃取,回收正丁醇,真空干燥得到成品。
经检测纯度为93.2%。
3 结论
（1）上述实验证明,DNJ提取的最佳生产条件为:
65%乙醇作为提取剂,按料液比1∶8和1∶4各一次进行超声波提取20min。
提取液通过阳离子交换树脂,以0.25mol/L的氨水洗脱,流速控制在1～2mL/min,洗脱液经正丁醇萃取,浓缩、干燥后得到成品。
（2）DNJ提取率为95.8%,得率为124.54mg/100g,纯度可以达到93.2%。
（3）超声强化细胞破碎提取法具有快速、简便、提取温度低、提取率高的优点,不会使桑叶的有效成分破坏。
（4）本方法工艺流程简单、快速、提取率高,适合于工业生产,为桑叶的综合利用及糖尿病的预防和治疗药物的开发奠定了一定的基础。
6.1.4桑叶中1-脱氧野尻霉素的检测、提取及其生理活性研究
DNJ之所以被人们越来越重视，主要由于它具有治疗糖尿病、抑制肿瘤转移、抑制病毒、抗滤过性病原体、高纯度麦芽糖的酶合成、在大鼠体内的代谢、减肥和增加胰岛素敏感性等作用。
目前国际市场主要需要的桑叶提取物产品DNJ含量基本都在10％以上甚至有些要20％以上，而国内生产的桑叶提取物中DNJ的含量大都在5％以下，由此可以看出我国在这方面的发展空间还是比较大的。
其实在高纯度DNJ产品上同样有较大的发展空间，5mg纯度为95％DNJ标准品其市场售价可达1500元人民币,而纯度为99，99％同样重量的DNJ产品更能卖到3000元以上，故进行较高纯度桑叶中DNJ分离纯化研究具有相当的经济价值。
在干桑叶中的DNJ含量一般为0．1％左右，在桑根部位会略高一些为0．14％。
其实，DNJ不仅在桑树不同部位含量有差异，即使是相同部位比如桑叶，不同品种其中的含量差异也是很大的。
DNJ的提取：
1乙醇浸泡提取法，先用65％乙醇浸泡样品粉末20min，然后过虑取滤液，剩下的残渣再用的65％乙醇再重复处理一次所得滤液和前一次合并。
用旋转蒸发仪蒸发滤液，回收乙醇并将滤液浓缩到小体积。
离心后取上清液，并使其通过阳离子交换树脂。
先用蒸馏水冲洗直到流出液为无色，然后再用0．25mol／L的氨水洗脱（洗脱速度l～2ml／min），收集洗脱液。
用旋转蒸发仪浓缩洗脱液，再用洗脱液相同体积的正丁醇萃取3次。
取正丁醇相弃去水相，真空干燥就可得成品提取率为95．8％，得率为124．54rag／100g，纯度为92．3％以上。
2蒸馏水提取法，把桑叶粉碎后放进蒸馏水中进行回流加热，2．2．5小时间后过虑取水溶液然后再重复一次合并两次提取液，再利用阳离子交换柱（00lx7型）层析对DNJ进行了初步纯化，收集pH为9．4．10．5的洗脱液。
3微波辅助提取法，把一定量桑叶粉末加入无菌过滤水中其固液比例为1：
40（g／m1）。
在微波炉中加热1．5min，提取两次。
其中微波炉的功率为406W。
然后乘热洗涤残渣，浓缩，置于50mL容量瓶中，作为供试品溶液待用，最后得DNJ提取率为0．024％。
4超临界流体萃取法，超临界流体是物质在临界温度和临界压力以上的一种特殊状态，它既不是气体也不是液体而是具有二者双重优点的流体状态。
在超临界状态下，超临界流
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