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食品科学与工程论文

山东理工大学

毕业论文

题目：

动物组织中硝基呋喃代谢物残

留量的测定方法

学院：

专业：

食品科学与工程

学生姓名：

指导教师:

毕业论文时间：

二ОО八年二月二十五日～六月二十日共十七周

摘要

用高效液相色谱-串联质谱（LC—MS/MS）法同时测定动物组织及水产品中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代谢物。

盐酸水解动物组织及水产品中蛋白结合的代谢物，同时加入2-硝基苯甲醛（2-NBA），37℃过夜衍生化。

加入氢氧化钠，调节PH值至7。

0后，再加入正己烷去除蛋白。

后用乙酸乙酯提取,正己烷净化，分析物采用电喷雾电离正离子（ESI+）、多反应检测（MRM）模式检测，內标法定量。

在添加浓度0。

5~2μg/kg范围内，內标法回收率为89.5%~110。

3%;相对标准偏差（RSD）小于11.3%。

5-马啉代甲基—3-氨基—2—恶唑酮（5-methylmorpholino—3-amino—2-oxazolidinone，AMOZ）、3-氨基-2-恶唑酮（3—amino-2—oxazolidinone，AOZ）、氨基脲（semicarbazide,SEM）和1-氨基—乙内酰胺（1-amino—hydantoin，AHD）方法检出限为0。

5μg/kg。

关键词：

液相色谱-串联质谱，硝基呋喃类代谢物,内标法

第一章目录

摘要I

Abstract（英文摘要）Ⅱ

目录Ⅲ

第一章引言1

1。

1硝基呋喃类药物的性质和使用1

1.2硝基呋喃类药物的危害及其管理对策2

1.2.1硝基呋喃类药物的主要危害2

1.2。

2硝基呋喃类药物的管理对策3

1.3硝基呋喃类物质及其代谢物的样品处理方法4

1。

3.1样品的均质4

1。

3。

2提取和衍生化5

1。

3。

2。

1溶剂提取5

1。

3。

2.2水解和衍生化5

1。

3.3样品的净化6

1。

3。

3。

1液液萃取（LLP）6

1。

3.3。

2基体固相分散技术（MSPD）6

1。

3.3。

3固相萃取技术（SPE）7

1.3。

3.4在线透析和微量富集技术7

1。

4硝基呋喃类物质及其代谢物的检测方法8

1.4。

1色谱分析方法8

1.4。

1.1高效液相色谱法（HPLC）8

1.4.1。

2联用技术分析法10

1.4。

2分光光度法12

1。

4.3免疫分析法（IA）13

1。

4。

4总结14

第二章实验方法17

2。

1原理17

2。

2仪器和设备17

2。

3试剂与溶液18

2。

3。

1主要试剂18

2.3.2主要溶液的配制18

2。

3。

3标准物质和标准溶液19

2。

4实验方法20

2。

4.1试样制备与保存20

2.4.2分析步骤20

2。

4。

2.1洗样20

2.4。

2。

2水解20

2。

4.2.3提取和净化20

2.4.2.4仪器参数与设定21

2.4.2。

5液相色谱-串联质谱测定22

2.4.2.6定性方法22

2.4.2。

7定量方法23

第三章结果计算及讨论24

3。

1结果计算24

3.2总离子流图和保留时间24

3.3样品衍生条件的优化25

3.4净化条件的选择26

3.5质谱条件的优化26

3。

6检测限、测定低限、回收率和精密度29

3。

6。

1回收率统计29

3。

6.2重复性统计33

3.7內标法定量38

3.8标准曲线图谱及线性范围39

3。

8。

1标准曲线图谱39

3.8.2线性范围41

3.9质量控制及注意事项41

3。

9.1质量控制41

3。

9。

2注意事项42

结论44

参考文献45

致谢及声明48

第一章引言

1。

1硝基呋喃类药物的性质和使用

硝基呋喃类药物（Nitrofurans）是人工合成的具有5—硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用，在低浓度下对上述病原体有抑制作用,高浓度则有杀灭作用,其抗菌作用机理是干扰细菌体内的氧化还原酶系统,使细菌代谢紊乱[1]。

硝基呋喃类抗生素主要包括呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃它酮（Furaltadone）、呋喃西林（Nitrofurazone）、呋喃妥因（Nitrofurantoin）等，见图1-1,呋喃类物质均为性质稳定的黄色粉末，无味或味微苦。

呋喃西林难溶于水（1:

4200），微溶于乙醇（1：

590），呋喃唑酮几乎不溶于水和乙醇;呋喃妥因几乎不溶于水，微溶于乙醇。

图1—1四种硝基呋喃代谢物结构式

这类抗生素因其具有抑菌性和杀菌性而广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗，部分品种具有促生长的作用，可用作饲料添加剂。

呋喃类药物内服后，吸收较少，吸收的部分在体内迅速被破坏,血药浓度低，不易达到有效浓度，不宜用于全身感染的治疗.其中呋喃唑酮内服后难吸收,肠中浓度高而血中浓度低，故适用于各种肠道感染的治疗，呋喃唑酮可用于治疗小儿菌痢、伤寒、消化性溃疡等疾病，呋喃唑酮的复方缓释制剂是卫生部批准的抗HP（HP是胃溃疡的主要致病菌）感染的药物。

呋喃唑酮用于防治水生动物疾病,如用1μg/kg~2μg/kg防治观赏鱼蛀鳍烂尾病和罗非鱼溃烂病.呋喃唑酮用于罗氏沼虾、鳗鲡、对虾和河蟹等水生动物养殖环境的消毒药物.呋喃唑酮用于防治畜禽肠道感染,如兔球虫病、猪痢疾、禽白痢、火鸡黑头病等[2］。

呋喃妥因内服吸收较快，体内消除快，此药由尿的排出量大，故主要用于治疗尿道感染;而呋喃西林在本类药物中毒性最大,主要用作局部或创伤的感染的外用消毒剂。

1.2硝基呋喃类药物的危害及其管理对策

1.2.1硝基呋喃类药物的主要危害

（1）对畜禽有毒性作用。

大剂量或长时间应用硝基呋喃类药物均能对畜禽产生毒性作用，其中呋喃西林的毒性最大，呋喃唑酮的毒性最小，为呋喃西林的1/10左右。

在硝基呋喃类药物中,以呋喃西林对家禽的毒性作用最常见，尤其是雏鸭和雏鸡,以220mg/kg混饲喂雏鸭或以400mg/kg混饲喂雏鸡,连续用药10天以上，出现呆滞、羽毛蓬松、厌食或兴奋、惊厥症状，最后死亡。

兽医临床上经常出现有关猪、鸭、羊、鸽子等呋喃唑酮中毒的事件报道。

（2）具有致癌致畸致突变。

呋喃它酮为强致癌性药物，呋喃唑酮具中等强度致癌性。

通过对小白鼠和大白鼠的毒性研究表明,呋喃唑酮可以诱发乳腺癌和支气管癌，并且有剂量反应关系；高剂量饲喂食用鱼和观赏鱼，可诱导鱼的肝脏发生肿瘤；繁殖毒性结果表明,呋喃唑酮能减少精子的数量和胚胎的成活率。

硝基呋喃类化合物是直接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细菌的突变。

（3）代谢产物对人体危害严重。

硝基呋喃类药物在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态,结合态可长期保持稳定，从而延缓药物在体内的消除速度。

用呋喃唑酮对种鸡进行处理以后，代谢物残留将按种鸡-种蛋-雏鸡—成鸡的生物链条传递。

普通的食品加工方法（如烧烤、微波加工、烹调等）难以使蛋白结合态呋喃唑酮残留物大量降解。

这些代谢物可以在弱酸性条件下从蛋白质中释放出来，因此,当人类吃了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品，这些代谢物就可以在人类胃液的酸性条件下从蛋白质中释放出来被人体吸收而对人类健康造成危害。

动物肝脏为主要的药物代谢器官,蛋白质结合态的残留药物主要累积在肝脏。

1。

2.2硝基呋喃类药物的管理对策

由于硝基呋喃类药物残留危害严重，美国、日本和欧盟等国家和地区纷纷采取措施，严加监管。

欧盟（EU）从1997年开始将所有的硝基呋喃类抗生素全部列为违禁药物。

1990年7月欧盟颁布2377/90/EEC条例，将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为A类禁用药物，规定其在动物源性食品中的残留检测限为1。

0μg/kg［3］.由于对呋喃唑酮蛋白结合态残留物的安全性产生怀疑，自1995年起欧盟全面规定禁止使用呋喃类抗菌物质，在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出。

欧盟（EU）N0807/2001法规中，规定使用HPLC方法检测呋喃唑酮，检测限量2ng/kg～4ng/kg。

2004年美国FDA公布了禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。

我国农业部文件农牧发[2002］号也规定动物源性食品中呋喃唑酮的检出限为不得检出。

美国21CFR530.41规定：

食源性动物禁止使用呋喃唑酮和呋喃妥因.韩国2002年版《食品公典》规定猪肉中不得检出呋喃唑酮。

欧盟EEC2377/90规定动物源性食品中不得检出硝基呋喃（包括呋喃唑酮）.2002年4月，我国农业部第193号公告（食品动物禁用的兽药及其它化合物清单）将硝基呋喃类药物列为禁止使用的药物。

我国目前使用行业标准SN0530－1996出口肉品中呋喃唑酮残留量检验方法:

液相色谱法，检测限量0。

1μg/kg[4—5］。

2003年开始，我国将硝基呋喃纳入残留监控计划中.但是硝基呋喃类药物残留超标事件时有发生,严重危及动物源性食品安全和出口，因此,必须进一步强化对硝基呋喃类药物的管理.

（1）加强培训与宣传，提高安全用药意识。

要广泛宣传畜禽健康养殖知识、国家安全用药的有关法律法规和药物残留对人类健康的危害性，让广大养殖者了解使用禁用药后产生的危害及法律后果，提高养殖者的法律意识和安全用药的自觉性。

（2）加强兽药生产经营管理。

严格按照兽药管理条例、兽药生产质量管理规范GMP和兽药经营管理规范GSP的要求规范生产经营行为，加大对生产、经营企业的监督管理，严厉查处生产、经营禁用药的行为.

（3）加强饲料生产管理.加强对饲料生产企业的监控,严禁使用农业部规定以外的兽药作为饲料添加剂。

饲料生产企业要加强对生产原料的管理，做到原料来源清楚，记录明确；要加强对原料检测，重点加强对鱼粉原料的检测;要防止含有硝基呋喃类药物的饲料原料投入生产，防止在生产过程中污染违禁药物。

（4）加强畜禽养殖的管理。

养殖过程是兽药残留监控的关键环节，养殖者是动物源性食品安全的主体,其安全用药与否直接关系到食品安全。

养殖场应当建立养殖档案,载明饲料、饲料添加剂等投入品和兽药的来源、名称、使用对象、时间和用量等有关情况,禁止使用硝基呋喃等违禁药物。

（5）加强兽药残留监控.加大投入，尽快建设完善我国动物源性食品的兽药残留监控体系，形成国家、省、市、县完整的兽药残留检测网络梯级结构;加快我国兽药残留监控检测方法的研究步伐，发展简单快速准确灵敏的分析技术；加强对生产、加工和流通环节的监管，加大对养殖场、加工厂和农贸市场等畜禽及产品的抽样检测力度.

1。

3硝基呋喃类物质及其代谢物的样品处理方法

样品的处理通常包括均质、提取、净化、衍生化等步骤,以达到释放残留物特别是蛋白结合残留物、去除干扰基质、浓缩目标分析物的目的。

1.3。

1样品的均质

取样时，通常仅取可食部分，并注意具有代表性。

对于虾类样品的处理，先粉碎均匀，再冷冻储存,但对其他肌肉组织、肾脏和肝脏等样品，需要先冷冻，后选择有代表性部分切成薄片,再进一步粉碎。

尽量避免将整个样品一次均相，引起酶的活性增加，从而造成分析物的损失。

粉碎后的样品，用水、氯化钠溶液或盐酸溶液混合均相；奶类和蜂蜜等样品的处理，可直接用水或盐酸溶液混合均匀。

1。

3.2提取和衍生化

1.3。

2。

1溶剂提取

在样品的提取步骤，要求能够将动物性食品中的硝基呋喃残留物释放至溶液中，一般使用水和酸化的有机溶剂，以达到去除大部分蛋白质和萃取残留物的目的。

在样品的提取和去蛋白过程中，有机溶剂也能从内源性大分子中萃取非共价键结合的残留物。

常用的有机溶剂包括乙腈、乙酸乙脂、二氯甲烷等.除此之外，三氯乙酸、甲醇/乙醇/二乙醚、Mcllvaine缓冲溶液/甲醇、偏磷酸/甲醇、柠檬酸/磷酸氢二钠、氯仿/乙酸乙脂/二甲基亚砜都有应用的报道.

1。

3.2。

2水解和衍生化

对于硝基呋喃代谢物的测定，鉴于其残留物主要以蛋白结合物形态存在，只有在适当的酸性条件下经水解过程，才能释放出游离代谢产物，而且因残留物的浓度一般非常低，需要采用衍生化手段提高灵敏度,故样品的处理需要水解和衍生化.通常水解选用稀盐酸，浓度为0.1mol/L。

对衍生化试剂的选择,许多研究者对此进行了大量的探索，芳香醛类如2—硝基苯甲醛（2-NBA）、吡啶—3—羰基甲醛、2，4—二硝基苯甲醛、2—羟基-5-硝基苯甲醛和2-氯苯甲醛，均能与硝基呋喃游离代谢产物的自由氨基团反应,形成具有较好特性的芳香亚胺类衍生物。

2-NBA是采用最多的衍生化试剂，该类衍生物在色谱柱上有较好的保留，在质谱仪上有特征的离子碎片，灵敏度高。

以呋喃唑酮为例，肌肉组织在酸性条件下被水解，产生游离代谢产物AOZ与2-NBA发生衍生化反应，生成性质稳定的衍生物，该衍生物有紫外吸收，并可储存于—18℃冰箱内数周不变。

同样地，呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因的蛋白结合代谢物，经酸水解，产生游离代谢产物SEM、AMOZ和AHD.

SEM、AOZ、AHD和AMOZ的相对分子质量分别为75。

1、102.1、115.1、201。

1,在此质量范围内，MS噪音大，加上分析物较低的离子化效率和无特征的碎片行为,MS检测灵敏度很低，给定量特别是定性带来困难。

通过采用2-NBA进行衍生化,使得上述代谢物的衍生物NPSEM、NPAOZ、NPAHD、NPAMOZ相对分子质量分别达到208.2、248。

2、235.2、334.3，在适当的碰撞电压下均产生不少于两个特性离子的碎片峰，MS检测灵敏度提高,更适合于质谱的定性和定量。

值得注意的是，许多细胞大分子也含有可反应的氨基，需加入远远过量的2—NBA来确保由蛋白结合残留释放出的自由代谢产物全部衍生化。

1。

3.3样品的净化

通常，得到的水提取液或有机提取液中，目标分析物浓度较低，还含有许多共萃取基质，如果这些物质在最终的溶液中存在，不仅会干扰检测,也会增加背景噪声，无法测定痕量浓度的目标分析物。

样品净化的目的就是为了减少萃取中的共萃取基质，浓缩目标分析物。

常用的净化技术包括传统的液液萃取（LLP）、固相萃取（SPE）、基体固相分散技术（MSPD）、在线透析和微量富集技术。

在实际分析中，结合多种净化和浓缩技术来减少检测的背景噪声，以达到定量分析微量残留物的应用也很常见.

1。

3。

3.1液液萃取（LLP）

液液萃取是最经典、常用的净化手段，可以用有机溶剂将待测物从溶液中萃取出来，或者将干扰物质从有机相或水相萃取物中除去。

实验证明，在酸性条件下，乙酸乙脂、二氯甲烷对溶液中的硝基呋喃残留物萃取效果好，也有加入氯化钠以进一步提高二氯甲烷萃取效率的报道.为了达到更好的净化效果,正己烷常被用于对样品萃取液的进一步脱脂。

液液萃取的优点是成本低，不需要特殊的实验设备，其缺点是在萃取过程中有时产生乳化现象，且有机溶剂消耗量大.

1。

3.3.2基体固相分散技术（MSPD）

基体固相分散技术是将硅藻土或非极性的C18衍生硅胶等作为吸附剂,加入到样品中,混合均匀,或者样品与吸附剂一同研磨，然后把搅拌均匀的物质填充到层析柱中，用溶剂淋洗，达到净化的目的，该技术可以克服液液萃取过程中产生乳化的问题。

K。

Yoshida［6]等和L。

H.MVroomen［7]等报道了硅藻土的应用，A.R.Long［8]等利用非极性的C18衍生硅胶等作为吸附剂,成功地净化了奶中的呋喃唑酮。

1.3。

3.3固相萃取技术（SPE）

固相萃取技术是一种色谱净化技术。

将含待测物的溶液通过吸附层，使待测物保留在吸附层，经洗脱除去杂质，再选用合适的溶剂洗脱并收集目标分析物.用固相萃取柱可以从共萃取物中净化和浓缩硝基呋喃萃取物。

有学者报道用非极性吸附剂如反相C18或者XAD-2可获得高的回收率，然而在许多情况下，非极性吸附剂在从萃取物中除去干扰物的净化过程并不理想，一些极性吸附剂例如硅胶、氧化铝或者氨丙基材料也常常被采用，以达到更好的萃取净化效果。

SPE柱有多种，如PhenomenexSDB—L反相聚合的苯乙烯-二乙烯基苯柱，基于共聚物憎水性和π—π共轭键的相互作用，该柱对硝基呋喃有很强的选择性保留，而大多数基质干扰物保留较弱，能保留、洗脱硝基呋喃的4种待测物，效果很好。

LiChrolutEN和SDB—L柱可以提供相似的结果，但保留特性有少许差别.其他可供选择的柱还有如WatersOasisHLBSPE、VarianBondElutENV/LMS、SupelcoSupelcleanEnvi-ChromP、JTBakerBakernondH2O—phobicDVB、ISTIsolute101等。

净化过程包括柱子活化、淋洗和洗脱。

SPE的特点包括稳定可靠,有更好的重现性和高的回收率，不会产生不溶现象，可消除乳化，减少溶剂的使用，可用于大范围内的不同基质.此外，还容易自动化，如自动化的SPE：

ASPEC，为满足不同样品萃取量的需求，有各种不同体积的柱子可供选择，包括碟式萃取片。

此外，高通量的96孔板,可满足处理大量样品的要求。

1。

3.3。

4在线透析和微量富集技术

M。

M.L.Aerts[9]等报道在线透析和微量富集技术应用于动物源性食品肉类、奶类和蛋类中硝基呋喃的分析。

方法用双相透析膜将待测物在线分离，然后用液相色谱柱（BondapakC18/Corasil，37～50μm，或者XAD-4，50~100μm）将4种硝基呋喃预富集,先将共萃取的基质淋洗至废液中，再将浓缩的分析物冲到分析柱上分离,用紫外检测器检测，可达到1~5μg/kg的检出限.

1。

4硝基呋喃类物质及其代谢物的检测方法

在国内外已经发表有关硝基呋喃类抗生素的残留检测方法的文献中,早期的文献报道大多数是检测原药化合物。

然而由于硝基呋喃类抗生素对光敏感，具有代谢快速的特点,在动物体内的半衰期不过数小时,通常不太可能检出原药的残留，例如呋喃唑酮在停药后12h内从组织中消失，而其代谢物3-氨基—2-恶唑烷酮（AOZ）在动物体内则以组织蛋白结合物的形式存在，在体内可残留数周，在停药后至少6周内AOZ在猪肌肉组织中继续存在[10］，因此当原药浓度降至检测限以下时，检测其代谢物浓度是可能的。

其他硝基呋喃类抗生素也有类似特性。

现在各研究机构已开始关注其代谢物的检出，国内外报道过用于检测硝基呋喃类抗生素及其代谢物残留的方法主要有色谱分析方法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等.

1.4.1色谱分析方法

高效液相色谱法（HPLC）在硝基呋喃类抗生素的检测中比较常见，HPLC法所用的检测器文献报道较多的有紫外检测器（UV，包括二极管阵列检测器DAD）和电化学检测器（ECD）。

近年来各种色谱联用技术分析法在硝基呋喃类抗生素的代谢物的检测中应用较多，发展迅速,主要是与质谱联用（包括串联质谱）。

1.4。

1.1高效液相色谱法（HPLC）

（1）液相色谱—紫外检测器（LC—UV）

在硝基呋喃类抗生素原药化合物的检测中高效液相色谱应用最多，而高效液相色谱最常用的检测器就是紫外检测器（UV，包括二极管阵列检测器DAD）。

通常用高效液相色谱结合紫外检测器测定硝基呋喃类药物代谢物时,因为呋喃结构的紫外光谱吸收不明显，导致灵敏度过低，不能满足出口产品检测硝基呋喃类代谢产物残留限量的要求[11］.经衍生化试剂衍生化后,产生强紫外吸收，其检测限可以达到1μg/kg，但是复杂的基质会导致测定困难和干扰.AngeliniN.M.等［12]利用LC-UV方法检测牛肌肉组织中四种硝基呋喃类药物的残留，方法的检测限是1mg/kg，定量限是2mg/kg,平均回收率76％。

我国农业部于2001年11月1日发布农牧发［2001]38号文件，发布了10种动物源食品中兽药残留检测方法，其中呋喃唑酮的检测方法就是高效液相色谱法（紫外检测器）。

这个标准方法适用于鸡的肌肉、肝脏、肾脏组织和鱼肉中呋喃唑酮残留量的检测，在鸡的肌肉组织、肝脏、肾脏、鱼肉组织中的检测限分别为10、50、50、25μg/kg，回收率分别为80%~110％、60％~130%、50%~140％、70％～120%。

本方法的批内变异系数CV≤10％，批间变异系数CV≤25％。

葛宝坤等[13］采用固相萃取（SPE）前处理净化技术,高效液相色谱（配有紫外检测器）法快速测定鸡肉、鱼、虾中呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮药物残留量，4种硝基呋喃类药物在鸡肉、鱼、虾样品中3个不同水平的添加回收率（n=7）为87％～102％；相对标准偏差（RSD）为2。

0％～7.8％;工作曲线的线性范围为5μg/kg~100μg/kg；呋喃它定、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮的检出限分别为5、2、3、2μg/kg。

于慧娟等［14]利用高效液相色谱法（配有紫外检测器）测定水产品中呋喃唑酮的残留量，其方法灵敏度高，检测限为1.0μg/kg.由此可见,高效液相色谱（紫外检测器）检测硝基呋喃类抗生素的方法已逐渐趋于成熟，灵敏度不断提高,检测限能满足国内外水产品中微量呋喃唑酮测定的要求。

（2）液相色谱-电化学检测器（LC-ECD）

电化学检测器（ECD）因其高灵敏性也在硝基呋喃类抗生素的检测中得到应用.OwenW。

Parks和LeonF.Kubena[15］利用LC-ECD（工作电极为玻碳电极,工作电位-0.8V，参比电极为Ag/AgCl电极）检测用含有呋喃唑酮的饲料喂养的鸡的肝脏和胸部肌肉组织中的呋喃唑酮的残留。

T.GaleanoDiaz等[16］利用HPLCECD（库仑法）来检测牛奶中的呋喃妥因、呋喃唑酮和呋喃它酮.样品经提取净化后，以MeCN0.1mol/L—1mol/LNaClO4（28∶72）和0.5％的冰醋酸为流动相，在Nova—PakC18柱上分离，CoulochemⅡ检测器检测（工作电极为多孔石墨电极，工作电位—600mV）.标准曲线的线性良好，线性范围在10~60ng/ml。

其中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因测定结果的相关系数r分别为0。

9948、0.9268、0。

9967（Height）和0.9930、0。

9970、0.9975（Area）。

相对标准偏差（n=11）分别为1。

3％、1。

6%、1.6%（Height）和2.1%、3。

6%、1.9％（Area），检测限分别为5、4、4ng/ml（Height）和6、4、4ng/ml（Area）。

在4、10、25ng/ml的添加回收率分别为（85±11）%~（97±9）%、（87±1）％～（97±6）％、（83±4）%～（98±9）％.Alawi—MA［17]利用改进的HPLC/ELCD高效液相色谱电化学检测器检测鸡组织和鸡蛋中的呋喃唑酮和盐酸呋喃它酮。

其回收率在80.0%～99.0%.呋喃唑酮的检测限为1ng/g，盐酸呋喃它酮的检测限为2ng/g.

1.4。

1。

2联用技术分析法

（1）液相色谱—质谱法（LC-MS）

色谱技术广泛应用于多组分混合物的分离和分析，特别适合有机化合物的定量分析，但定性较困难；质谱仪只能够对单一组分提供高灵敏度和特征的质谱图，但对复杂化合物分析无能为力。

将色谱和质谱技术进行联用，对混合物中微量或痕量组分的定性和定量分析具有重要意义［18］。

近些年来，高效液相色谱配合质谱技术（LC-MS）测定硝基呋喃类代谢物在动物组织中的残留越来越多被采用,与用紫外检测器的检测方法比较，质谱检测器技术具有定性、定量准确，抗干扰能力强，检测限低，测定快速等特点［17]。

对被测化合物的确认有很高的可信度,具有灵敏度高（比UV检测器高10倍以上）、选择性好、精密度高等优点,而且HPLC—MS有易于操作和自动化的特点.LC-MS法可以利用待测分子的结构来定性，可以排除酶