香菇多糖的小肠吸收学士学位论文.docx

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香菇多糖的小肠吸收学士学位论文

学士学位论文

香菇多糖的小肠吸收

学位论文原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。

作者签名：

日期：

年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权　　　　大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

涉密论文按学校规定处理。

作者签名：

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导师签名：

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摘要

目的：

本文以香菇多糖为模型药，初步预测香菇多糖的小肠吸收特征。

为香菇多糖的剂型设计提供理论基础，并为研究其他多糖类药物提供参考。

方法：

实验对所购买的香菇多糖粗品采用Sevage法去蛋白，双氧水脱色；采用蒽酮-硫酸法测定香菇多糖含量；采用大鼠外翻肠囊法，考察了吸收部位﹑给药时间、给药浓度对香菇多糖小肠吸收的影响。

结果：

实验过程采用蒽酮-硫酸法测定香菇多糖含量，这些方法线性范围良好，回收率较高，方法准确可行；不同肠段部位（十二指肠﹑空肠﹑回肠）间药物吸收无显著差异（p>0.05），单位时间吸收的药量随浓度的增加趋于增加，吸收无饱和现象，给药浓度越低药物的吸收率越大。

结论：

推测香菇多糖是顺浓度梯度转运的，属于被动转运，但香菇多糖不是通过单纯扩散透过小肠上皮。

关键词：

香菇多糖；外翻肠囊法；蒽酮-硫酸法；吸收机制

Abstract

Objective:

thispaperisaboutthestudyoflentinan,preliminarypredictiontheintestinalabsorptioncharacteristicsofmushroompolysaccharides.Thedesignforthelentinanformulations,andprovidesthetheoreticalfoundationfortheresearchofotherpolysaccharidesprovidereferences.Methods:

Sevagemethodfordeproteinizationprocedure,andH2O2methodfordecolorizationprocedure;Theexperimentuseanthrone-sulfuricacidmethodfordeterminationofanthraquinonecontentoflentinan;Inthispaper,Rateveredgutsacsystemofdifferentintestinalsection（jejunum,ileumandduodenum）wasusedforthestudyonabsorptioncharacteristicsandtheabsorptionmechanismofLNT.Results:

Thelinearity,therevoveryandtheaccuracyofthemethodwereallgoodfortheanthrone-sulfuricacidmethod.ThedatashowedthatLNTabsorptionratewasthesameforallsectionsoftheintestine（p>0.05）.Theabsorptionrateshowalinearrelationshipwiththeincrementofdoseorconcentration.theloweroftheconcentrationofdrug,theincreaseroftheabsorptionrate.Thereisnosignificantphenomenonofsaturation.Conclusion:

thatisthelentinanconcentrationgradienttransfer,belongtopassivetransport,butnotbysimplediffusionmushroompolysaccharidesbyintestinalepithelium.

Keywords：

Lentinanpolysaccharide（LNT）,evertedgutsac,anthrone-sulfuricacidcolorimetry,absorptionmechanism

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文献综述

香菇（LentinulaedodesPegle或LentinulaedodesSing），又名香覃、冬菇，是世界上著名的实用真菌之一。

它不仅素以色、香、味俱佳而著称，而且营养丰富，能医治多种疾病。

我国自古以来就把香菇说成是一种“肌里玉洁，芳香韵味，上至皇帝，下至百姓，无人不喜”的素食，有“素中之荤”、“菇中之王”、“蔬菜之魁”等多种美称，是食用菌家族中的宠儿。

中医认为，香菇味甘、性平，具有补气健脾、和胃益肾、滋味助食之功效[9]。

香菇多糖系从担子菌纲伞菌科真菌香菇子实体中提取分离纯化获得的均一组分的多糖。

多糖以甘露糖为主，含少量的葡萄糖、微量的岩藻糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等，肽链由天冬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸等18种氨基酸组成。

LNT的化学结构是一种以β-D-[1-3]葡萄糖残基为主链，侧链为[1-6]葡萄糖残基的葡聚糖。

平均分子量约为50万道尔顿[7]。

香菇多糖1969年在日本首先发现，自此，国内外学者对LNT作了许多深人的研究。

近年来，LNT的药理作用研究取得了很大进展。

尤其是香菇多糖是一种宿主免疫增强剂,具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。

传统香菇多糖的提取方法有水提醇沉法、稀碱浸提法、稀酸浸提法和酶法等，随着对香菇研究的不断深入,又出现超滤法、微波辅助浸提法以及超声波法等。

水提醇沉法为最经典的提取香菇多糖的方法，以工艺简单、易于推广等优点为人们所接受。

用水提醇沉法提取香菇多糖,正交实验确定了最佳提取工艺为:

温度：

85℃，时间:

5h，加水量：

15倍水量，除蛋白的最优工艺条件：

样液：

氯仿-正丁醇（体积比）=3，氯仿:

正丁醇（体积比）=5[13]。

香菇中的糖类主要由还原糖和香菇多糖组成，目前用的比较普遍的糖类分析方法是比色法，主要有3，5-二硝基水杨酸法﹑苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。

苯酚-硫酸法：

苯酚-硫酸试剂可与游离的寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起显色反应，己糖在490nm处（戊糖及糖醛酸在480nm）有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。

此方法简单、快速、灵敏，对每种糖仅需制作一条标准曲线，颜色持久，但有颜色的样品，易偏高，不理想。

.蒽酮-硫酸法：

糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于625nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。

本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定干扰[2]。

本研究拟采用蒽酮-硫酸法测定总糖的含量，蒽酮-硫酸法的原理是根据多糖在硫酸的作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛酸衍生物，糖醛酸衍生物与蒽酮在强酸性条件下受热缩合成绿色化合物，在适当波长下和一定浓度范围内，吸收度与糖浓度呈线性关系，从而可比色测定多糖含量[2]。

蒽酮

羟甲基糠醛

糠醛衍生物（绿色）

当前研究药物小肠吸收机制的方法有多种，主要分为在体法，离体法和细胞模型法，其中离体法中的外翻肠囊法具有操作简单，易于实现，受其它身体条件影响少等优点，因而被广泛的用于研究药物小肠吸收行为以及药物在吸收中的相互作用[4]。

本文以香菇多糖为研究对象，在对其进行提纯以及定量分析研究的基础上，采用大鼠外翻肠囊法考察吸收部位、药物浓度、吸收时间对香菇多糖小肠吸收的影响，研究香菇多糖的小肠吸收特点，初步探讨香菇多糖的小肠吸收机制。

随着现代社会生活节奏的加快以及人们工作压力的加大,使得人类免疫系统功能降低，各种疾病的发病率呈上升趋势。

其中，作为人类的最大杀手—癌症，也日益引起各国学者的广泛关注。

而香菇多糖具有抗肿瘤的作用，毒副作用小且安全有效。

这无疑将成为今后药物的一个研究方向。

前言

中药胃肠转运研究是中药现代化基本问题之一。

目前，中药有效成分的药代动力学研究已有报道，药品管理部门对新的中药有效成分也明确需要进行ADME研究，但更多的已经在临床上应用的中药有效成分或有效部位的ADME过程并不清楚，一些中药有效成分的吸收差、生物利用度低下的问题已经凸现，应用这些成分、部位制备的正在广泛使用的中药制剂缺乏生物药剂学基础。

从中药制剂中抽取出已经肯定药效作用的中药成分或部位进行胃肠吸收的过程和机制的研究，有预见性地针对吸收性质不良的中药成分或其制剂提出新的口服剂型方案，将对中药口服剂型的现代化发展和走向世界起到重要作用。

我国对多糖的研究始于上世纪70年代末，近年来发展迅速，1996年我国“糖生物学”列为国家重点课题。

研究对象涉及真菌类、地衣类、植物、动物等；研究范围包括多糖的分离纯化，结构分析、理化性质、药理学及治疗应用等，对其免疫增强作用机理的研究已经深入到分子、受体水平，研究方法涉及化学、生物学、医药学等诸多领域。

近年来，国内对大量中草药多糖及糖缀合物如天门冬、黄芪、山药、枸杞、灵芝、香菇、云芝、大枣、芦荟、山茱萸、刺五加、紫菜、茶叶、螺旋藻、当归等进行了深入的化学结构分析和广泛的生物活性研究，相继报道了这些多糖及糖复合物具有抗肿瘤、抗病毒、双向调节血糖、免疫调节、降血脂等多方面的药理作用。

多糖因其独特的药理活性和低毒特征，在临床应用中已呈现出极大的潜力，成为中药研究的一个新的增长点。

多糖口服制剂的研究与应用受到了广泛的关注，但是关于多糖胃肠道吸收研究的报道由于受到多糖自身特点的影响还比较少，国内只有极少数的人做了关于

六味地黄多糖小肠吸收率的研究，关于多糖类药物小肠吸收机制和影响多糖类药物小肠吸收因素的研究还是空白。

本文以香菇多糖为模型药，采用大鼠外翻肠囊法，分别考察吸收时间、吸收部位、给药浓度对香菇多糖小肠吸收的影响，初步预测香菇多糖的小肠吸收特征。

为香菇多糖的剂型设计提供理论基础，并为研究其他多糖类药物提供参考。

材料与方法

一、实验材料

（一）仪器、设备

722N--可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；

数显恒温水浴锅HH-2（国华电气有限公司）；

低速离心机（上海手术器械厂）；

集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；

FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；

电热恒温鼓风干燥箱（巩义市英峪予华仪器厂）；

DT系列电子天平（常熟市意欣仪器仪表有限公司）；

天孚牌JYT—2架盘药物天平（常熟市金羊砝码仪器有限公司）；

磁力搅拌机（北京金紫光科技发展有限公司）；

冻干箱（YAMATO）。

（二）试剂、试药

香菇多糖粗品（浙江方格药业；批号090905）；

葡萄糖（分析纯）（天津市福晨化学试剂厂）；

硫酸（分析纯）（永飞化工厂）；

乙醇（分析纯）（天津市福晨化学试剂厂）；

正丁醇（分析纯）（天津市凯通化学试剂有限公司）；

三氯甲烷（分析纯）（天津市耀华化学试剂有限责任公司）；

蒽酮（分析纯）（北京金龙化学试剂有限公司）；

氯化钠（分析纯）（哈尔滨化工化学试剂厂）；

氢氧化钠（分析纯）（天津市福晨化学试剂厂）；

其余试剂均为分析纯。

（三）实验动物

Wister大鼠250-300g（齐齐哈尔医学院动物室）。

二、研究方法

（一）香菇多糖的纯化

1.Sevage法去蛋白

称取5g香菇多糖粗品，溶于50mL蒸馏水中，加入1/5体积（10mL）氯仿，1/25体积（2mL）正丁醇，磁力搅拌20min，4000rpm离心分离20min，取水相，重复上述步骤5次，得脱蛋白后的香菇多糖水溶液。

2.双氧水脱色

脱蛋白后的多糖溶液用4mon·L-1的NaOH调pH为9.0，水浴加热至50℃，加入多糖体积15%的30%H202,保持pH8～9，4h后终止反应，冷却至室温，加入3倍体积的无水乙醇，4000rpm·min-1，离心24min，沉淀进行冷冻干燥。

（二）蒽酮-硫酸法

1.标准溶液的配制

精确称量在105℃干燥至恒重的无水葡萄糖50mg，置50mL容量瓶中定容摇匀，然后取5mL葡萄糖溶液置于50ml容量瓶中定容摇匀，得0.10mg·mL-1的葡萄糖标准液。

2.0.10%蒽酮试剂的配制

精密称取蒽酮0.050g，置50mL容量瓶中用80%硫酸定容，摇匀。

3.小肠缓冲液的配制

小肠缓冲液组成：

NaCl（8.0g·L-1），KCl（0.2g·L-1），CaCl2（0.2g·L-1），NaHCO3（1.0g·L-1），NaHPO3（0.05g·L-1），MgCl2（0.1g·L-1）。

（注NaHCO3与CaCl2和MgCl2要分别事先配成溶液，以防生成沉淀。

4.比色条件的选择　

本方法根据香菇多糖与蒽酮在酸性条件下发生显色反应的原理进行含量测

定。

考察蒽酮试剂浓度和沸水浴时间，反应以沸水浴15min，放置10min为宜，为了防止加入蒽酮试剂时硫酸放热提前发生显色反应，需在冰水浴中加入蒽酮试剂，最大吸收波长为625nm。

5.标准曲线的绘制

精密取标准液0.2，0.3，0.4，0.6，0.8mL，分别置于干燥试管中，各管补加小肠缓冲液至1.0mL，将试管置于冰水浴中各加入蒽酮试剂4.0mL，摇匀。

沸水浴15min，静置10min，以小肠缓冲液1.0mL加蒽酮试剂4.0mL为空白，于625nm处测定吸收值。

6.精密度测定

取标准葡萄糖溶液0.2﹑0.4﹑0.7mL，按上述方法分别加入小肠缓冲液0.8﹑0.6﹑0.3mL，然后在冰水浴中加入蒽酮试剂4.0mL，摇匀，沸水浴15min后冷却至室温，以空白管调零，连续测定五次吸光度，计算RSD。

7.稳定性考察

取标准品0.50mL，按上述方法显色后每间隔15min测定一次吸光度，在2小时内测定吸光度值，计算RSD。

8.回收率测定

精密称取葡萄糖对照品适量，稀释至0.7500﹑0.4500﹑0.2500mg·mL-1高中低三个不同浓度，分别取1.0mL于冰水浴中加加入4.0mL蒽酮试剂，沸水浴15min

后静置至室温，每个样品分别测定3次吸光度，计算回收率。

（三）小肠吸收实验

1.外翻肠囊的制作

参照文献方法[10]，选取健康大鼠，禁食24h（自由给水），用乌拉坦麻醉，立即打开腹腔，分离出小肠，放入小肠缓冲液中，用缓冲液冲洗小肠表面，并仔细清除浆膜层外面的脂肪组织。

剪取大约6～7cm的一段小肠，用圆头细玻璃棒将肠段翻转使粘膜层在外，浆膜层在内，洗净内容物，用手术线结扎肠段一端，另一端用手术线结扎在玻璃管上。

肠囊内注入约1.0ml空白小肠缓冲液，放入含有不同浓度香菇多糖小肠缓冲液的小试管中，通入空气，置于水浴锅中37℃保温。

在吸收开始后15min,0.5h,1h,1.5h,2h,用取样器取出小囊中的所有内液,然后加入1.0mL新鲜小肠缓冲液,继续实验。

样品取出后放入离心管中4000转·min-1离心5min，取上清液用蒽酮-硫酸法进行显色反应，测定样品在625nm处的吸光度。

根据吸光度计算香菇多糖含量，计算每个时间段香菇多糖的累积吸收量和吸收率。

2.吸收部位对香菇多糖吸收的影响

分别取十二指肠﹑空肠和回肠，其中十二指肠（duodenum）：

自幽门1cm处

开始；空肠（jejunum）：

离幽门15cm处开始；回肠（ileum）：

离盲肠20cm处开始，按照上述方法加入到浓度为0.03mg·mL-1，0.06mg·mL-1，0.30mg·mL-1，0.60mg·mL-1的香菇多糖小肠缓冲溶液中，在吸收开始后15min,0.5h,1h,1.5h,2h,用取样器取出小囊中的所有内液，然后加入1.0ml新鲜小肠缓冲液，继续实验。

样品取出后放入离心管中4000转·min-1离心5min，取上清液用蒽酮-硫酸法进行显色反应，测定样品在625nm处的吸光度，根据吸光度计算香菇多糖含量，计算每个时间段香菇多糖的累积吸收量和吸收率。

3.吸收时间和给药浓度对香菇多糖吸收的影响

用小肠缓冲液配制浓度为0.03，0.06，0.30，0.60mg·mL-1的香菇多糖溶液进行吸收实验，分别在15min,0.5h,1h,1.5h,2h取样，计算各个时间段的累积药物吸收量和吸收率，考察吸收时间和给药浓度对香菇多糖吸收的影响。

结果与分析

一、香菇多糖的纯化

（一）Sevage法去蛋白

图1香菇多糖溶液图2香菇多糖去蛋白效果

（二）双氧水脱色

图3脱色后香菇多糖溶液

二、蒽酮-硫酸法

（一）标准曲线的制备

用吸收度（A）与浓度（C）进行线性回归,得回归方程如下:

图4蒽酮-硫酸法标准曲线

A=6.9491C-0.0171（r=0.9996），线性范围：

0.02～0.08mg·mL-1。

（二）精密度测定结果

表1蒽酮-硫酸法的精密度测定结果（n=5）

次数测得浓度（mg·mL-1）

低中高

10.02090.03830.0690

20.01850.03830.0679

30.01820.03800.0703

40.01840.03750.0699

50.02000.03740.0675

RSD（%）1.091.020.92

可见高中低三个浓度的精密度良好。

（三）稳定性考察结果

在2小时内吸光度值分别为：

0.331，0.330，0.330，0.329，0.332，0.331，0.330，0.332，RSD=0.04%。

两个小时内方法稳定性很好。

（四）回收率测定结果

表2回收率测定结果

NO对照品加入理论浓度实测浓度回收率（%）平均回收率（%）

（mg·mL-1）（mg·mL-1）

10.25000.2500100.00

20.25000.2500100.00100.12

30.25000.2509100.35

40.45000.447699.47

50.45000.449099.7799.58

60.45000.447799.49

70.75000.7619101.59

80.75000.7533100.44100.85

90.75000.7539100.51

本方法的平均回收率为100.01%，RSD=0.65%。

三、小肠吸收实验

（一）外翻肠囊的制作

图5肠段翻转后模型

图6小肠吸收装置示意图

（二）吸收部位对香菇多糖吸收的影响

表3香菇多糖在小肠不同部位的累积吸收量（n=3）

给药吸收各时间段的累积吸收量（mg）

浓度部位

（mg·mL-1）15306090120

十二指肠0.0446±0.02750.0702±0.02090.1002±0.00000.1125±0.00000.1248±0.0000

0.03空肠0.0857±0.00560.1373±0.02870.1767±0.05540.2066±0.07720.2232±0.0764

回肠0.1567±0.10370.2057±0.13330.2590±0.11770.2962±0.09360.3131±0.0962

十二指肠0.0720±0.03200.1016±0.02870.1293±0.01820.1509±0.02280.1685±0.0286

0.06空肠0.0790±0.06390.1520±0.09660.2031±0.10020.2313±0.09610.2572±0.0967

回肠0.1346±0.10130.1906±0.09120.2496±0.10920.2540±0.15210.2708±0.1536

十二指肠0.0497±0.03240.0937±0.02280.1292±0.00710.1571±0.02390.1797±0.0349

0.30空肠0.0732±0.03330.1318±0.03590.1904±0.06010.2324±0.08760.2613±0.1038

回肠0.1500±0.14280.2196±0.14070.2835±0.16260.3267±0.18020.3539±0.1889

十二指肠0.1118±0.05140.1918±0.05800.2364±0.06800.2701±0.06860.3066±0.0867

0.60空肠0.1066±0.05580.2013±0.05210.2438±0.08600.2784±0.07380.3188±0.0798

回肠0.1212±0.03620.2028±0.01040.2482±0.01580.2910±0.03380.3145±0.0363

图7给药浓度0.03mg·mL-1时不同部位香菇多糖的累积吸收量随时间的变化

通过用spss数据统计软件进行吸收时间为120分时各部位累积吸收量的配对t检验，结果是：

回肠药物吸收量对空肠药物吸收量，t=-1.059，P=0.401>0.05；空肠药物吸收量对十二指肠药物吸收量，t=-2.230，P=0.156〉0.05；回肠药物吸收量对十二指药物吸收量，t=-1.523，P=0.267〉0.05。

图8给药浓度0.06mg·mL-1时不同部位香菇多糖的累积吸收量随时间的变化

通过用spss数据统计软件进行吸收时间为120分时各部位累积吸收量的配对t检验，