pro的测定技巧分为两大类.docx
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pro的测定技巧分为两大类
蛋口质的测定方法分为两大类：
一类是利用蛋口质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋口质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋口质含量。
但是食品种类很多，食品中蛋口质含量乂不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋口质的测定通常利用经典的割氏定氮法是山样品消化成较盐蒸憎，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，山样品中含氮量计算出蛋口质的含量。
山于食品中蛋口质含量不同乂分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。
一凯氏定氮法
这种方法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2S04来分解试样，来定疑谷物中的蛋白质，他只知用H2S04分解试样，而不能阐明H2S04分解有机氮化合物生成氨的反应历程,所以只使用H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由Gunning加入改进，他改进的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400C,提高了不到67°C所以速度也就加快了，凯氏左氮法至今仍在使用。
我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮虽:
，然后乘以蛋白质核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶咻和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。
1凯氏常量上氮法：
不论常虽、半微呈以及微量定氮法它们的原理都是一样的，首先第一个步骤是消化：
（1）消化：
样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。
并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为C02和H20蒸汽逸出，而蛋白质则分解氮，则与硫酸结合成硫酸镂，留在酸性溶液中。
（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾,可提髙反应温度，一般纯硫酸加热沸点330°C,而添加硫酸钾后，温度可达400°C,加速了整个反应过程。
此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提髙沸点。
英理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸岀而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。
加速了有机的分解。
但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太髙，生成的硫酸氢钱也会分解，放出氨而造成损失。
为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。
但为了防止污染通常使用硫酸铜。
所以有机物全部消化后，岀现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。
（1）蒸馆：
样液中的硫酸钱在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸岀。
（2）吸收与滴左：
蒸餾过程中放岀的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴左过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算岀总氮量。
半微量或微量左氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴立，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。
1.操作步骤:
准确称取样品中0.50-2.OOgf于500ml凯氏瓶中一加10g无水K2S04-加0.5gCuS04-加20mlH2SO4-在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后,将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中一继续消化30分钟一至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却一加200ml水一连接蒸餾装置一用硼酸作吸收液一在K氏瓶中加波动珠数粒和80ml50%Na0H-立即接好左氮球一加热一至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗一用0.INHC1滴定。
N（V2-V1）0.014
W
计算：
总氮捲%=（N（V2-V1）X0.014）/WX100
0.014--一氮的亳克当量数
蛋白质玄二总氮％XK
乳制品K二6・38（N=15.7%）
小麦粉K二5・79（N=17.6%）
动物胶K二5.6（N=18.0%）
冰蛋K=6.7（N=14.8%）
K-换称等数
各种试剂的作用：
浓H2S04：
A:
脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为S02,本身则变为C02
B：
氧化
C：
蛋白质与浓H2S04生成NH3t,C02,S02,H20t
D：
NH3与H2S04生成硫酸彼
（1）CuSO4的作用（催化剂）
CuS04为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全,
兰色为CuS04的颜色
（2）K2SO4的作用（提高沸点）
沸点由330°C提高到400°C加速了反应过程。
（3）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防I匕污染通常采用硫酸铜
（4）50%Na0H的作用
下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素：
（I）K氏烧瓶和取样量
如果称lg以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml,SOO^lOOOml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。
（2）分解剂
AH2S04和K2S04的添加量
有机无分解需要H2S04量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2S04多，为了提高分解温度，要大量添加K2S04,但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。
K2S04和H2S04的添加比例是：
lg样品K2SO4：
H2S04二7g：
12ml
这种比例在国内外都使用，是公认的
还有一种比例：
K2SO4：
H2S04二10：
20ml
B催化剂
用作催化剂的有Hg、HgO、Se,硒化合物，CuS04、Ti02,对Hg,HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，Ti02,的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同，HgO消化麦子为38,Se与CuS04消化麦子55,Ti02消化麦子70,所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。
（3）热源的强度
消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2S04加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2S04损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。
（4）氨的蒸餾和吸收及滴立
蒸饰有两种：
1直接蒸餾（装置简便，准确性好）
2水蒸汽蒸懈
蒸馀加NaOH是50%加的量为H2S04量的4倍，硫酸量为12ml,则NaOH为12X4二48ml,而且一般髙于这个理论值，即加到50~55ml,如果NaOH戢加的不够就变成H2S,H2S是强酸，使颜色变红。
吸收液有：
1标准H2SO4用标准碱返滴定，甲醛红指示剂
2硼酸用HC1进行滴泄，混合指示剂
目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2S04,这样可省略了反滴定，H2S04是强酸，要求较严,而硼酸是弱酸，在滴泄时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%.
〈6〉实验注意事项
a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。
b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。
c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂2~3ml,促使氧化。
d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。
e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过髙时，要添加硫酸量。
f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有浪甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。
氨是否完全蒸馅岀来，PH试纸检査馅出液是否为碱性。
h.向蒸锚瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀无。
这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。
i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。
2K氏微量泄氮仪法
操作方法大同小异，半微量法消化后，疋容100ml,然后吸25ml蒸馅吸收液吸收。
N（V2-V1）0.014
w*1o/1oo
计算总
氮,%=（N（V2-V1）xo.014）/（WX10/100）X100
对于微疑定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸憾消化液也少，其它基本一样。
4K氏自动定氮法
原理与上而一样，仪器，采用K氏自动左氮仪：
英装置内具有自动加碱蒸馅装巻，自动吸收和滴怎装置以及自动数字显示装置，消化装宜：
由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。
二水扬酸比色法：
1原理：
样品中的蛋白质经H2SO4消化转化为钱盐溶液后，在一泄的酸度和
2ml
温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测左，求出样品含氮疑，计算蛋白质含量。
2
方法
（1）标准曲线的绘制
取6个25ml容疑瓶编号
0123
4
5
6
分别加空白酸液
稀释至总体体枳至15ml
5ml
15分
2.5ml
15
分别加水扬酸钠
37C水浴
钟
加入次氯酸钠
37C水浴
分钟
取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。
（2）样品处理：
准确称样0.20~l.00g-于K氏瓶中f加15mlH2S04和5g催化剂一电炉上加热到沸腾后一加
大
火力消化一直到出现暗绿色时一摇动瓶子一K氏瓶全部消化后一冷却一加水至250ml容量
（3）样品测泄：
准确吸取上述消化溶液10ml—于100ml容量瓶中一宦容一准确吸2ml-于25ml容量瓶中一
5ml磷酸缓冲液一以下操作与标准曲线绘制的步骤相同
并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。
（4）计算
CXF
含氮%二X100
WX1000X1000
C-一从标准曲线中査出测左样液的含氮量（Ug）
F-—样品溶液的稀释倍数
W样品重量（g）
蛋白质%=总氮%XK（K可为6.25,也可査）
3注意事项：
A当天消化液最好当天测左，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。
B当在PH和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度。
C这种方法测左结果基本与K氏法一致。
4试剂
（1）氯标液：
称经110°C干燥2h的硫酸钱0.4719g-于烧瓶中疋容10ml-此液lml相当于
1.Omg氮标液一使用时配制成lml相当于2.50Ug氮标液。
（2）空白酸液:
称0.50g蔗糖一加15mlH2S01和5g催化剂一与样品一样消化一泄容250ml-*使用时吸收此液10ml-加水至100ml为工作液备用。
（3）磷酸盐缓冲液:
称7.lg磷酸氢二钠一加38g磷酸三钠一加20g三九石酸钾钠一加400ml水
溶解一过滤一另称35gNaOH溶于100ml水中一冷至室温一缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中一加入水稀释至1000ml备用。
（4）水扬酸钠溶液：
称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁軌化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释
至500ml
（5）次氯酸钠溶液：
吸4ml安替富民液，用水稀释至100ml
5仪器
（1）分光光度计
（2）恒温水浴
三紫外分光光度法
1原理：
蛋白质及其降解产物的芳香环基，在紫外区内对某一波长具有一泄的光选择吸收，在280nm下，光吸收与蛋白质浓度（3"8mg/ml）成直线关系，因此，通过测左蛋白质溶液的吸光度，并参照事先用K氏立氮法分析的标准样品，从标准曲线查岀蛋白质的含量。
2试剂：
（1）0.lmol/1柠掾酸水溶液。
（2）8mol/l腺［（NH2）2CO］的2NN&0H溶液。
關的2N氢氧化钠液
（3）95%乙醇
（4）无水乙陋
3仪器
（1）751型的紫外分光光度计
（2）离心机
4操作方法
（1）标准曲线的绘制:
准确称取样品.2.OOg,置于50ml烧瓶中,加入0.lmol/1柠掾酸水溶液30ml,搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每秒钟3000^5000转的速度离心10分钟，分别吸出上淸夜0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0ml于6个10ml容量瓶钟，每个容量瓶，8mol/lU的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果离心再次离心），取透明液于比色皿中，在280nm下测左苴吸光度。
（做参比值）
以事先用K氏左氮法测左的样品中蛋白质的含呈:
微横坐标上而的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）样品测定
准确称取试样1.00g-于50ml饶杯中一加0.lmol/1柠檬酸溶液30ml-*搅拌10分钟一四层纱布过滤到离心管中一用8mol/LM的NaOH溶液泄容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查岀蛋白质的含量。
计算：
蛋白质二C/WX100
C一一从标准曲线上查得的蛋白质含量（mg）
W—一测左样品溶液相当于样品量（mg）
说明：
a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性蛋白质样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。
b.温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在20~30°C。
四双缩腺法-皮尼克法
1原理：
双缩服在碱性条件中，能与CuS04结合成红紫色的络合物。
蛋白质分子中含有肽链与双缩服结构相似，也呈此反应。
本法直接用于测泄像小麦粉等固体试样的蛋白质含虽:
。
但作为铜的稳泄剂，洒石酸钾钠比甘油好些。
小麦粉中的蛋白质能直接地一边抽岀一边进行泄量。
2试剂
（1）甘油作为稳定剂:
取1OmlIONKOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuS0450mlo
⑵洒石酸钠作稳左剂，吸10ml1ONKOH溶液和20725%洒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40mlo
配制以上两种溶液、试剂，必须澄淸，无氢氧化铜生成，否则重配。
3方法：
样品测定
标准曲线绘制
准确称0.6g样品一使用试剂
（1）
准确称0.5g样品一使用试剂
（2）
假如用试剂
（2）
（1）准确称样一0.5g-＞于80ml离心管一加lmlC!
C4-*混合一加50ml酒右-酸钾钠稳立剂一盖上盖子离心lOmin（4000转/分）一放巻1小时一吸混合液15ml—于20ml离心管中一离心到完全透明一取上淸夜5ml于一10ml容量瓶一加水左容一于550nm处测左吸光度，从标准曲线上査出蛋白质含童。
（2）标准曲线绘制
按样品测定方法，根据样品中蛋白质含虽:
，取离心澄淸样液
0.02.04.08.010.0ml于10ml容量瓶中一分別加水定容，按照样品测泄其吸光
度。
事先用K氏泄氮法测泄样品中蛋白质含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
4计算：
蛋白质%=C/WX100
C一一从标准曲线上查得得蛋白质含疑（mg）
W—一测左样液时相当于样品重量（mg）
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