分子标记的实验原理及操作流程精Word文档格式.docx
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琼脂糖电泳试剂:
琼脂糖,无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料;
超纯水（18.2MΩ·
cm
2.其他实验需要物品
微量移液枪（一套及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。
四、实验流程
1、总DNA提取
使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA,通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。
一般来说,100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。
2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品
EcoR11ul
10×
Buffer2ul37℃65℃30min终止反应sample（总DNA5ul
ddH2O12ul
3、Mse1酶消化（20ul体系/样品
Mse12ul（1U/ul
Buffer2ul
sample（EcoR1酶切产物80℃30min终止反应ddH2O1ul
4、T4DNALigase（20ul体系/样品
T4DNALigase2ul（1U/ul
sample（双酶切产物10ul
Mse1Adaptor1ul2265℃10min终止反应EcoR1Adaptor1ul
ddH2O4ul
5、预扩增（20ul体系/样品
sample4ul
Primer（Mse1/EcoR11ul
AFLPCoreMix15ul
*AFLPCoreMix配方:
ddH2O13.8ul
MgCl21.6ul
dNTPs（2.5mM1.6ul
Taq酶（1U/ul1ul
预扩增程序:
94℃2min
94℃
56℃
72℃2min
60℃30min
6、选择性扩增（20ul体系/样品
sample4ul（预扩增产物稀释20倍Primer（Mse1-XXX/EcoR1-XXX1ul
选择性扩增程序:
94℃20s
66℃30s每循环降1℃,共10个循环72℃2min
56℃30s20个循环
7、产物电泳检测
上样液:
LoadingBuffer20ul
Sizestandard-6000.2ul
Sample3ul（稀释10倍
四、实验结果与分析
本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter公司CEQ8000遗传分析系统,运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验,扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离,采用激光激发荧光采集数据,灵敏度极高,电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0、1”矩阵,便于对结果进一步深入分析研究,整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成,最大程度避免了人工操作造成的误差,提高了数据的可靠性。
产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1,得到的数据（图2
用第三方软件再进一步统计分析。
图1AFLP分子指纹图谱
图2AFLP“0、1”矩阵图AFLP操作流程图:
酶切
Mse1酶切
优化数据分析
附录1:
常用的8对AFLP选择性扩增引物:
E-AGG:
5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3
E-ACG:
5-GACTGCGTACCAATTCACG-3
E-AAC:
5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3
E-ACA:
5-GACTGCGTACCAATTCACA-3
E-AGC:
5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3
E-ACT:
5-GACTGCGTACCAATTCACT-3
E-AAG:
5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3
Tel:
+8653280998002Fax:
+8653280998005网站:
地址:
山东省崂山区山东头路58号盛和大厦2-1706
E-ACC:
5-GACTGCGTACCAATTCACC-3
M-CAA:
5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3M-CAC:
5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3M-CAG:
5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3M-CTA:
5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3M-CAT:
5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3M-CTC:
5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3M-CTG:
5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3M-CTT:
5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3
附录2:
AFLP传统垂直板电泳（银染法检测介绍:
原理与方法同前,区别:
1.选择性扩增引物不带荧光标记;
2.电泳方法不同,采用测序胶垂直板电泳;
3.电泳结果采用银染法,比较直观,但条带的统计与分析全人工化,工作量大,银染法灵敏度比荧光标记法要低。
示例:
下图为玉米（maizeDNA的AFLP图谱。
PanelA:
AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingEcoR1primerE-AGGwitheightMse1primers:
M-CAA（1,M-CAC（2,M-CAG（3,M-CAT（4,M-CTA（5,M-CTC（6,M-CTG（7,andM-CTT（8.
PanelB:
AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingMse1primerM-CAGwitheightEcoR1primers:
E-AAC（a,E-AAG（b,E-ACA（c,E-ACT（d,E-ACC（e,E-ACG（f,E-AGC（g,andE-AGG（h.
地址:
二ISSR分子标记的实验原理及操作流程
ISSR（inter-simplesequencerepeat标记是一种类似RAPD,但利用包含重复序列并在3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。
其原理具体是,ISSR标记根据生物广泛存在SSR的特点,利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物,无需预先克隆和测序。
用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列,由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。
一、实验材料
不同来源的DNA（30-50ng/ul。
二、实验设备
PCR仪,PCR管或硅化的0.5mleppendorf管,电泳装置,凝胶成像仪。
三、试剂
1、ISSR引物:
购买成品或根据加拿大BritishColumbia大学设计的ISSR引物序列（见附录自己合成。
2、Taq酶
3、10xPCR缓冲液
4、MgCl2:
25mmol/L。
5、dNTP:
2.5mmol/L。
四、操作步骤:
1.在25ul反应体系中,加入模板DNA1ul（30-50ngISSR引物1ul（约5pmol10xPCRBuffer2.5ul
MgCl22ul
dNTP2ul
Taq酶1单位（U
加ddH2O至25ul
混匀稍离心,加一滴（约20ul矿物油。
2.在PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:
94℃1分钟,45℃-68℃40秒,72℃1-2分钟,共40轮循环。
3.循环结束后,72℃10分钟,4℃保存。
4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液（6x于1.6%或1.8%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V（电压低带型整齐,分辨率高。
5.电泳结束,溴化乙锭染色20分钟。
6.用凝胶成像仪观察、拍照。
操作流程简图:
―――――――――――――――――――――――――――――――――
――――――
注:
样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等DNA提取可采用CTAB或SDS法
DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法
附录UBCPrimerSet#9（Microsatellite
引物名称
序列
引物名称序列
801ATATATATATATATATT851GTGTGTGTGTGTGTGTYG802ATATATATATATATATG852TCTCTCTCTCTCTCTCRA803ATATATATATATATATC853TCTCTCTCTCTCTCTCRT804TATATATATATATATAA854TCTCTCTCTCTCTCTCRG805TATATATATATATATAC855ACACACACACACACACYT806TATATATATATATATAG856ACACACACACACACACYA807AGAGAGAGAGAGAGAGT857ACACACACACACACACYG808AGAGAGAGAGAGAGAGC858TGTGTGTGTGTGTGTGRT809AGAGAGAGAGAGAGAGG859TGTGTGTGTGTGTGTGRC810GAGAGAGAGAGAGAGAT860TGTGTGTGTGTGTGTGRA811GAGAGAGAGAGAGAGAC861ACCACCACCACCACCACC812GAGAGAGAGAGAGAGAA862AGCAGCAGCAGCAGCAGC813CTCTCTCTCTCTCTCTT
863
AGTAGTAGTAGTAGTAGT
814CTCTCTCTCTCTCTCTA
864ATGATGATGATGATGATG
815CTCTCTCTCTCTCTCTG865CCGCCGCCGCCGCCGCCG816CACACACACACACACAT866CTCCTCCTCCTCCTCCTC817CACACACACACACACAA867GGCGGCGGCGGCGGCGGC818CACACACACACACACAG868GAAGAAGAAGAAGAAGAA819GTGTGTGTGTGTGTGTA869GTTGTTGTTGTTGTTGTT820GTGTGTGTGTGTGTGTC870TGCTGCTGCTGCTGCTGC821GTGTGTGTGTGTGTGTT871TATTATTATTATTATTAT822TCTCTCTCTCTCTCTCA872GATAGATAGATAGATA823TCTCTCTCTCTCTCTCC873GACAGACAGACAGACA824TCTCTCTCTCTCTCTCG874CCCTCCCTCCCTCCCT825ACACACACACACACACT875CTAGCTAGCTAGCTAG826ACACACACACACACACC876GATAGATAGACAGACA827ACACACACACACACACG877TGCATGCATGCATGCA828TGTGTGTGTGTGTGTGA878GGATGGATGGATGGAT829TGTGTGTGTGTGTGTGC879CTTCACTTCACTTCA830TGTGTGTGTGTGTGTGG880GGAGAGGAGAGGAGA831ATATATATATATATATYA881GGGTGGGGTGGGGTG832ATATATATATATATATYC882VBVATATATATATATAT833ATATATATATATATATYG883BVBTATATATATATATA834AGAGAGAGAGAGAGAGYT884HBHAGAGAGAGAGAGAG835AGAGAGAGAGAGAGAGYC885BHBGAGAGAGAGAGAGA836AGAGAGAGAGAGAGAGYA886VDVCTCTCTCTCTCTCT837TATATATATATATATART887DVDTCTCTCTCTCTCTC838TATATATATATATATARC888BDBCACACACACACACA839TATATATATATATATARG889DBDACACACACACACAC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT890VHVGTGTGTGTGTGTGT841GAGAGAGAGAGAGAGAYC
891
HVHTGTGTGTGTGTGTG
842GAGAGAGAGAGAGAGAYG
892
TAGATCTGATATCTGAATTCC
C
843CTCTCTCTCTCTCTCTRA893NNNNNNNNNNNNNNN844CTCTCTCTCTCTCTCTRC894TGGTAGCTCTTGATCANNNNN845CTCTCTCTCTCTCTCTRG
895
AGAGTTGGTAGCTCTTGATC846CACACACACACACACART896AGGTCGCGGCCGCNNNNNNAT
G
847CACACACACACACACARC897CCGACTCGAGNNNNNNATGTG
848CACACACACACACACARG898GATCAAGCTTNNNNNNATGTG
849GTGTGTGTGTGTGTGTYA899CATGGTGTTGGTCATTGTTCC
A
850GTGTGTGTGTGTGTGTYC
900
ACTTCCCCACAGGTTAACACA
三RAPD分子标记的实验原理及操作流程
RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,此技术建立于PCR基础之上,使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物,对基因组的DNA全部进行PCR扩增,以检测多态性。
由于整个基因组存在众多反向重复序列,因此须对每一随机引物单独进行PCR,单一引物与反向重复序列结合,使重复序列之间的区域得以扩增。
引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异,经琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。
1、RAPD引物:
购买成品或根据赛百盛（SBS公司设计的RAPD引物序列（2、Taq酶
1.在15ul反应体系中,加入模板DNA1ul（30-50ngRAPD引物1ul（约5pmol10xPCRBuffer1.5ulMgCl21ul
dNTP1ul
Taq酶0.5单位（U
加ddH2O至15ul
94℃1分钟,36℃1分钟,72℃1分钟,共40轮循环。
4.在15ulPCR产物中加2ul上样缓冲液（6x于1.6%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V。
样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等
DNA提取可采用CTAB或SDS法
青岛昊航科贸有限公司四SSR标记的实验原理及操作流程SSR简单序列重复标记（Simplesequencerepeat,简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。
由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记或SSLP标记。
虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。
优点：
（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；
（2）是共显性标记，呈孟德尔遗传；
（3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。
缺点：
开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高。
操作程序：
取叶片→磨样→提取DNA→PCR扩增→电泳检测→染色→读带标记1、DNA提取按照Doyle和Dickson（1987CTAB法（`Cetyltriethylammoniumbromide）并略加改进的程序进行，具体步骤如下：
①成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状，转入1.5ml离心管中，-20℃冰箱保存；
②加入600ul65℃的2×
CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30～60分钟；
③取出，冷却，上下摇匀后，加入600微升24:
1的氯仿异戊醇；
④12000转/分钟离心10分钟，取上清液于另一个1.5ml的离心管中；
⑤加异丙醇，12000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液；
⑥
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