吡喹酮透皮给药治疗日本血吸虫病研究.docx

吡喹酮透皮给药治疗日本血吸虫病研究.docx

《吡喹酮透皮给药治疗日本血吸虫病研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《吡喹酮透皮给药治疗日本血吸虫病研究.docx（59页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

吡喹酮透皮给药治疗日本血吸虫病研究

分类号

密级

华中农业大学硕士学位论文

吡喹酮透皮给药治疗日本血吸虫病研究

StudyonTreatmentofSchistosomiasisJapanum

withPraziquantelviaSkin

研究生:

段存争

指导教师:

郑新生教授

专业：

农药学

获得学位名称：

农学硕士

研究方向：

药物剂型

获得学位时间：

2008年6月

华中农业大学理学院

二○○六年六月

摘要3

Abstract4

Ⅰ前言5

1.1日本血吸虫病及防治现状5

1.1.1血吸虫病概述5

1.1.1.1血吸虫的生活史5

1.1.1.2血吸虫病发病机理及临床症状5

1.1.1.3我国血吸虫病现状6

1.1.2血吸虫病防治药物研究概况8

1.2透皮给药概述10

1.2.1透皮给药的发展史10

1.2.3透皮促进方法概述11

1.2.3.1化学促透方法11

1.2.3.2物理方法12

1.3吡喹酮治疗血吸虫病概述14

1.3.1吡喹酮概述14

14

1.3.2吡喹酮体内代谢14

1.3.3吡喹酮透皮给药研究进展15

1.4选题的目的和意义16

Ⅱ材料与方法17

2.1试验材料17

2.1.1主要试剂及实验动物17

2.1.2主要实验仪器18

2.2实验方法18

2.2.1吡喹酮在各溶剂中溶解度的测定18

2.2.1.1工作曲线的绘制18

2.2.1.2吡喹酮在不同溶剂中的溶解度测定19

2.2.2吡喹酮在水-油两相溶液间分配系数的测定19

2.2.2.1磷酸盐缓冲液的制备19

2.2.2.2正辛醇-磷酸盐两相饱和溶液的制备20

2.2.2.3吡喹酮在水-正辛醇两相溶液间分配系数测定20

2.2.3透皮给药药代动力学实验21

2.2.3.1给药及血样采集21

2.2.3.2家兔灌胃给药及血样采集21

2.2.3.3样品处理21

2.2.3.4色谱测定条件22

2.2.3.4相对标准曲线的制备22

2.2.4透皮给药治疗家兔血吸虫病实验22

2.2.4.1血吸虫感染及给药22

2.2.4.2血吸虫成虫检获22

2.2.4.3家兔肝脏病理切片的制作23

Ⅲ结果与讨论23

3.1吡喹酮在五种溶剂中的溶解度23

3.2吡喹酮在不同溶剂体系下的正辛醇-水体系分配系数26

3.3透皮剂透皮给药的药代动力学研究27

3.3.1色谱分离效果27

3.3.2标准曲线及检测限29

3.3.3回收率及精密度29

3.3.4透皮给药后家兔的血药浓度31

3.3.4.1单一溶剂透皮给药31

3.3.4.1混合溶剂透皮给药34

3.3.5透皮给药后治疗兔血吸虫病效果36

3.3.5.1透皮给药的杀虫效果36

3.3.5.2透皮给药治疗血吸虫病后家兔的肝脏病理变化38

Ⅳ结论45

Ⅴ参考文献47

Ⅵ致谢53

摘要

本课题制备了不同溶剂体系下的PZQ透皮制剂，运用紫外可见分光光度法、高效液相色谱法考察了不同溶剂体系中吡喹酮溶解度、正辛醇-水两相中的分配系数、透皮给药后PZQ的药代动力学性质，评价了吡喹酮透皮制剂透皮给药的生物利用度，筛选出了理化性质适合透皮给药的透皮制剂。

并通过设计治疗家兔血吸虫病疗效实验，检验了了所制备的透皮剂治疗血吸虫病时的减虫率、减卵率。

通过做组织切片考察了感染了血吸虫病家兔治疗前后的肝组织病理变化。

结果表明吡喹酮在乙二醇苯醚中溶解度最大，37℃其溶解度可达490mg·mL-1。

吡喹酮在乙二醇苯醚和乙醇组成的混合溶剂中溶解度随混合溶剂中乙醇的含量变化呈抛物线型变化，混合溶剂中甲醇含量为50%时期溶解度最大为429mg·mL-1。

通过这些研究解决了吡喹酮透皮及注射难以找到合适溶剂的问题。

通过对透皮剂在正辛醇-水两相中分配系数和透皮之吸收间的关系发现，理想的透皮制剂应该具有适中的油水分配系数。

PZQ的乙二醇苯醚溶液因具有相对最佳的油水分配系数使得其在透皮给药后取得相对于口服给药168%的生物利用度。

取得较高生物利用度的同时并未带来明显的皮肤发炎红肿等毒副作用。

因而吡喹酮的乙二醇苯醚溶液具有广阔的应用前景。

吡喹酮乙二醇苯醚溶液的透皮治疗血吸虫病时减虫率达100%，减卵率达93.51%。

对肝组织病理变化的考察结果也表明吡喹酮透皮治疗后的家兔肝脏中的肉芽肿得直径、面积均远远少于空白对照组。

表明了吡喹酮不仅对血吸虫虫体有完全的杀灭作用对血吸虫感染引起的肝肉芽肿也有明显的抑制作用。

关键词：

透皮；溶解度；分配系数；吡喹酮；日本血吸虫病；；肝肉芽肿；

Abstract

Inthepaper,varioustransdermalagentswerepreparedindifferentsolvents.ThesolubilitiesofPZQintransdermalagents,n-octanol/waterpartitioncoefficientofPZQandthepharmacokineticpropertyweredeterminedbyUV-VisspectrophotometerandHPLC.Andtheoptimumtransdermalagentswerescreenedoutbyevaluationofthebioavailabilityafteradministrationviaskin.Theworm-reductionrateandegg-reductionandtheratewereinvestigated.Thepathologicalchangesoflivertissuewerestudiedbyinspectionofthetissuesection.

TheresultsshowedthatthesolubilityofPZQinethyleneglycolmonophenylether（EGPE）wasbiggest.Itwas490mg·mL-1in37℃.AndthechangeofsolubilityofPZQinthemixtureofethanolandEGPEwiththechangeofcontentofethanolwasparabola.Itobtainedmaximumvalueof429mg·mL-1whenthevolumepercentageofethanolwas50%.SotheproblemthatitishardtofindoutanexcellentsolventtodissolvePZQwhenPZQisusedfortransdermaladministrationorinjectionadministraioninitcanbeeasilysolvedthroughthefundamentalresearch.

Throughtheinvestigatedtherelationbetweenn-octanol/waterpartitioncoefficientofPZQandtransdermalabsorption,itwasfoundoutthatanidealtransdermalagentshouldhaveanoptimumn-octanol/waterpartitioncoefficient.Withanoptimumpartitioncoefficient,thePZQEGPEsolutionobtainedgoodtransdermalabsorptionthatcanbeshowedbythe168%higherthanthatofbioavailabilityviaoral.Becauseofhigherbioavailabilityandwithoutobvioussideeffectsuchasred,swelling,pruritusonlocalskinafteradministrationviaskin,itcanbebelievedthatthePZQEGPEsolutionhaveabroadprospectsintransdermaldeliveryofPZQ.

WhenPZQEGPEsolutionwasusedfortreatmentofSchistosomiasisjapanumviaskin,100%ofworm-reductionratewasobtained,andtheegg-reductionratewas93.51%.Theinvestigationforlivertissuepathologicchangesshowedthatthediameterandtheareaofhepaticgranulomafromtreatedgroupwasmuchsmallerthanthatofblankgroup.ThefactshowedthatPZQhadnotonlyfullykillingeffectonSchistosomiasisjapanumbodybutalsonotableinhibitoryeffectonhepaticgranuloma.

Keywords:

transdermaldelivery,solubility,partitioncoefficient;praziquantel,Schistosomiasisjapanum,hepaticgranuloma

Ⅰ前言

1.1日本血吸虫病及防治现状

1.1.1血吸虫病概述

血吸虫病是由于人或牛、羊等哺乳动物感染了血吸虫所引起的一种传染病。

该病可造成病人肠炎、肝硬化,并导致腹泻、消瘦、贫血与营养障碍等疾患,劳动力丧失,甚至死亡。

慢性期以肝脾肿大为主,腹水肚大如鼓,俗称“大肚子病”。

世界上共有5种重要人体寄生血吸虫,在我国流行的是日本血吸虫病。

由于日本血吸虫病在生态学和生物学方面明显有别于其它血吸虫病,传播环节多,流行因素复杂是人体血吸虫病中对健康危害最严重的血吸虫病,也是防治难度最大的血吸虫病。

1.1.1.1血吸虫的生活史

日本血吸虫寄生在人或宿主动物的血管内。

成熟的雌雄血吸虫合抱交配并在终宿主的肠系膜下层小静脉末梢产卵，雌虫每天可产卵2000~3000个。

这些虫卵在肠壁血管内发育成熟，卵内所含毛蚴释放毒素，破坏肠壁组织，形成溃疡，虫卵沿肠壁损坏组织进人肠腔，随宿主粪便排出体外。

排出体外的虫卵一旦遇到有水的环境，就在水中很快孵出毛蚴，碰到中间宿主—钉螺，即进入其体内继续发育，形成内含子胞蚴的母胞蚴，子胞蚴发育生成数万条尾蚴，尾蚴在水域中接触到终宿主—人和家畜或易感动物，即侵入其体内，经血液循环，最后在终宿主肠系膜静脉发育为成虫，侵害终宿主。

从尾蚴经皮肤感染至交配产卵最短需23~35天，一般为30天左右。

成虫一般在宿主体内生存2~5年即死亡，有的成虫在病人体内可存活30年以上。

能损伤宿主机体及器官机能，造成严重危害（韩果方，2004）。

1.1.1.2血吸虫病发病机理及临床症状

急性血吸虫病是一种免疫复合物病或血清病。

当童虫发育为成熟成虫并大量产卵时，虫卵释放出来的大量虫卵可溶性抗原，刺激宿主迅速产生抗体，在抗原过剩的情况下，形成可溶性抗原抗体复合物造成血管损害而致病。

尾蚴穿透皮肤时引起皮炎，皮炎仅发生于曾感染过尾蚴的人和动物。

童虫在体内移行时，对所经过的器官，主要是肝脏，引起血管炎，毛细血管栓塞、破裂，出现局部细胞浸润和点状出血。

血吸虫感染可导致整体免疫功能的下降，从而加剧伴发疾病的发展或并发感染。

在虫卵周围出现细胞浸润，形成虫卵肉芽肿。

肉芽肿可影响宿主的肝肠组织，造成肝硬化与肠壁纤维化。

人和动物对血吸虫无先天免疫力，可能具有保护性免疫力。

宿主经过初次感染产生抗感染抵抗力之后，在一定程度上能破坏重复感染的虫体，但不能杀伤初次感染的成虫或阻止其产卵。

血吸虫病的基本病变是由虫卵沉着组织中所引起的虫卵结节。

虫卵结节分急性和慢性两种。

急性的虫卵结节会逐渐演化为慢性虫卵结节。

最后结节发生纤维化。

病变部位主要在结肠及肝脏，较多见的异位损害则在肺及脑。

活组织检查时发现虫卵多排列成堆，以结肠，尤其是直肠、降结肠和乙状结肠为最显著。

在肝表面和切面可见粟粒或绿豆大结节，肝窦充血，肝窦间隙扩大，窦内充满浆液；肝细胞可有变性，小灶性坏死与褐色素杭着。

脾脏呈进行性肿大，并伴有脾功能亢进现象。

在胃及肠系膜以及淋巴结、胰、胆囊等偶有虫卵沉积。

肺部可有大量虫卵沉积和发生出血性肺炎。

脑部病变多见于顶叶皮层部位，脑组织有肉芽肿和水肿（薛云等，2004）。

一般家畜如黄牛、奶牛和犊牛症状比较明显。

初期病畜呈现食欲减退，精神不佳，行动迟缓，继而出现腹泻、下痢，粪便中出现血液和粘液，体温升高到40℃以上，四肢张开，举尾拱背，用力努责，有里急后重现象。

病畜随后出现贫血、消瘦，全身虚脱，站立困难，最后衰竭而死亡。

部分患牛表现为消化不良，发育迟缓，消瘦，变为侏儒牛;母牛则会出现流产和不孕现象。

轻度感染者症状不明显，经过一段时间可自然转归。

其他大部分动物感染血吸虫病时，基本状况是食欲不振，消化不良，发热，腹泻，下痢，粪中带血及粘膜，消瘦，贫血，水肿，肝硬化，腹水等。

剖检时，在病畜肝脏表面或切面可见到粟粒至高梁米大小的灰黄色虫卵结节，肝脏呈现肿大、萎缩、硬化。

严重时，病变肠段可见到虫卵沉积，肠受侵害部位，以直肠最为严重。

在肠系膜及大网膜中可发现虫卵结节，以及合抱状态的成虫，虫卵结节有时在其他器官也能见到（薛云等，2004）。

1.1.1.3我国血吸虫病现状

日本血吸虫病在我国分布于长江流域及其以南的12个省（市、区）的427个县,经过50余年的有效防治,至2002年,已有广东、上海、福建、广西、浙江5省（市、区）阻断了血吸虫病的传播;在427个流行县中,已有253个县阻断了血吸虫病的传播,64个县控制了传播;在疫区范围大幅度压缩的同时,疫情和病情显著减轻。

全国血吸虫病人数由解放初期的1160万降至现在的82万左右,钉螺面积由148亿m2降至2002年的35.2亿m2,有力地保护了人民的健康,推动了经济的发展[2]。

近年来,由于生物、自然和社会经济等因素相互影响,变化较大,加上血吸虫病传播环节复杂、传染源众多,长江流域特大洪水频发、全球气候变暖,流行区人流物流急剧增加,流行因素依然存在。

市场经济体制转型对人们思想观念及行为带来巨大冲击,增加了血吸虫病防治工作的难度。

血吸虫病疫情在局部地区出现回升。

主要表现在：

①、病人数居高不下,部分地区出现急性血吸虫病成批暴发。

据全国统计,近5年全国慢性血吸虫病人推算数一直维持在80万左右,大部分重流行区的人畜血吸虫感染率在3.00%～5.00%,但局部地区人畜血吸虫感染率可高达68.00%以上,重疫区新发晚期血吸虫病例时有出现。

2003年全国急感病人报告数1114例,较2002年同期913例上升22.02%。

2003年全国有30余起急性血吸虫病局部暴发,急感者中51.00%为学龄儿童（肖东楼等，2004；陈贤义，2003）。

②、钉螺扩散严重,人畜感染危险性增加。

近5年内全国钉螺面积呈持续上升。

2003年全国钉螺面积较2002年增加了26800hm2,主要增加的地区在湖北等省的江湖洲滩地区。

2003年全国新发现钉螺面积达4246.24hm2,全国21个纵向监测点中,19个点发现感染性钉螺,并扩散至人群集居的垸内区,加大了人畜感染血吸虫的危险性。

21个纵向监测点,近年内分别有30.00%的点人群感染率、70.00%的点耕牛感染率和35.00%的点钉螺感染率呈上升趋势（肖东楼等，2004；陈贤义，2003；赵根明等，2004）。

③、新疫区不断增加,部分已控制地区疫情严重回升。

1990年代中,湖南省6个非流行县（区）（株州3个区、长沙2个区、桃源县）新发现钉螺和当地感染病人,长沙桔子洲头16个洲滩均有钉螺,并发生急感;已阻断传播地区如上海、浙江、福建等省（市）也发现大面积钉螺。

另据各省疫情监测统计,近5年有38个已达到血吸虫病传播控制和传播阻断标准的县（市、区）疫情出现了明显回升。

④、血吸虫病正在向城市蔓延。

继1990年代初湖北武汉、江苏南京、安徽芜湖等城市发生急性血吸虫病暴发流行后,近5年来,在湖南长沙、株洲、常德,江苏镇江、扬州,安徽安庆、铜陵等中小城市相继发现了感染性钉螺和新发病人。

而上海、广州、杭州等地均发现外地输入性急性、慢性血吸虫病人,输入性病例在近3年呈上升趋势。

1.1.2血吸虫病防治药物研究概况

自1918年,采用吐酒石治疗血吸虫病以来,以后近半个世纪一直沿用锑剂治疗血吸虫病。

经过50年的努力,先后发展了硫杂蒽酮类化合物、奥沙尼喹、尼立达唑、硝基呋喃类化合物、六氯对二甲苯、敌百虫、硝硫氰胺和吡噻硫酮等。

奥沙尼喹为四氢喹啉衍生物,是目前用于治疗曼氏血吸虫病的主要药物,但只对雄性曼氏血吸虫成虫及各期童虫有效,且对埃及血吸虫病和日本血吸虫病无效（Day，1992）。

尼立达唑是第一个研制出来可供口服的抗血吸虫药物,对埃及血吸虫病疗效好,治愈率可达90%以上,但副作用较多,可导致幻觉,肝损害,少数患者可出现局部或全身抽搐及精神失常,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6PD）缺乏者可出现溶血（Redman，1996）。

六氯对二甲苯是第一个用于治疗血吸虫病的非锑药物,它也有明显的副作用,且疗程长,使用不够方便,疗效不够理想。

其后研制开发的敌百虫和硝硫氰胺,在家畜血防上发挥了很大的作用。

敌百虫是一种有机磷,是胆碱酯酶抑制剂,可抑制埃及、曼氏和日本血吸虫肌肉的乙酰胆碱酯酶活性,但仅对埃及血吸虫有杀灭作用。

而硝硫氰胺由于药源问题而没有继续使用。

建国初期,锑剂曾在我国广泛用于治疗血吸虫病,取得了较好的效果。

但因锑剂需静脉注射,疗程长,毒性大,可引起阿-斯综合征等致命的严重反应,而渐为非锑剂口服药物所取代。

1958年我国首创了第一个可供口服治疗日本血吸虫病的非锑剂新药呋喃丙—F3006（血吸虫病防治手册，1990）。

以后陆续合成药物有血防-846、硝硫氰胺等。

呋喃丙胺具有兼杀童虫和成虫的作用,对急性血吸虫病有退热作用,对慢性血吸虫病亦有一定疗效,但单独使用疗效欠佳。

血防-846,在20世纪60年代中期至70年代初期也曾广泛使用,因其引起精神延迟反应较多,且疗效较差而被弃用。

1975年,我国合成口服药物硝硫氰胺,在部分地区曾广泛使用,治疗了大批病人,疗效较好,但有一定比例黄疸发生等副作用,渐被淘汰（邵葆若，1988）。

20世纪70年代初,Subert报道广谱抗蠕虫新药吡喹酮对5种人体血吸虫具有较好的疗效。

吡喹酮（Praziquantel）为杂环吡喹——异喹啉衍生物,1972年由德国怡默克和拜耳药厂研制成功,我国于1977年试制成功,1978年开始临床试用（王在华，2000）。

吡喹酮不仅对日本血吸虫成虫有强杀灭作用,对3小时和21天童虫也有杀灭作用,且对埃及和曼氏血吸虫也均有很好杀灭效果。

在我国经10多年千万人次的治疗证明,吡喹酮治疗日本血吸虫病疗效高、毒性低、副作用轻、疗程短、投药方便、适应症范围广,确是目前理想的治疗各种人体血吸虫病药物。

目前,吡喹酮在临床已广泛使用。

多年来,不仅临床治疗血吸虫病,而且在血吸虫病预防,疫情控制等防治规划中起到了很大的作用。

单纯化疗,尤其是扩大化疗和全民化疗,能迅速大幅度地降低居民的感染率和感染度,与血吸虫病感染的相关肠道症状和肝脾肿大体征也能得到明显改善,并能延阻晚期血吸虫病的发生和发展（黄一心，2001）。

吡喹酮在临床上广泛使用多年,我国已使用4000多万人次以上,绝大多数患者耐受良好,药物反应轻微,短暂,尤其是晚期血吸虫病和部分患有其他夹杂症的病人,过去许多化疗药物禁忌症者,应用吡喹酮治疗均达到满意的临床效果（陈名刚，1999）。

实践证明,在抗洪抢险接触血吸虫疫水人群中,应用吡喹酮防治急性血吸虫病是有效的,副作用小、群众依从性高、经济效益也很好（黄一心，1998）。

近年来,通过大规模化疗,国内一些感染严重的日本血吸虫病流行地区已得到较好的控制。

根据血吸虫病防治的需要,周期性的群体化疗,已成为主要的防治手段,使吡喹酮在防治实践中发挥更大作用（肖树华，1995）。

吡喹酮不但主要用于血吸虫病治疗,在实际工作中应用于治疗肺吸虫病、华枝睾吸虫病、脑囊虫病、绦虫病等,都能明显改善临床症状,达到了较好的治疗效果。

由此可见,吡喹酮属于广谱抗蠕虫药,具有高效、低毒的抗虫特点。

被WHO指定为治疗吸虫、蠕虫等寄生虫病的首选药物（江艳，2001）。

目前,吡喹酮是我国普遍治疗血吸虫病的首选药物,已在疫区广泛使用。

青蒿素是中国科学家于1972年从传统中药青蒿中提取的一种药物,被广泛地用于治疗疟疾（http:

//www.who.int/tdr/grants/workplans/vaccine.Htm，2004）。

1992年,浙江寄生虫病研究所的李思温小组发现蒿甲醚可有效杀死日本血吸虫童虫,而起到预防血吸虫病的作用（Lietal.，1996）。

此后,一系列预防研究被实施,尤其是将其应用于参加1998年抗洪救灾的解放军战士和人民群众,取得了很好的预防效果。

由于青蒿素类药物具有用药剂量小,使用方便、群众乐于接受、无明显不良反应、服药依从性好等优点,不仅具有降低人群的血吸虫病感染和减轻感染度,而且还可防治急性血吸虫病（崔金凤等，2001）。

该药也被卫生部批准口服预防血吸虫病新药（吴玲娟等，1998）。

但是,美国海军医学研究所发现大剂量肌注青蒿素类药物对猴子有神经毒性,全世界数十篇文献相继报道了对狗、鼠等动物进行的试验获得类似的实验结果（Petras，1997；Smithetal.，2001）。

1997年,Miller等报道了首例人类因服用青蒿琥脂后产生的共济失调和语音含糊症（Miller，1997）。

1.2透皮给药概述

1.2.1透皮给药的发展史

透皮治疗系统（transdermaltherapeuticsystem,TTS）或称为透皮给药系统（transdermaldrugdeliverysystem,TDDS）,是指药物以一定的速率通过皮肤,经毛细血管吸收进入体循环而产生疗效的一类给药系统。

与传统的给药方式相比,TDDS具有避免肝脏首过效应及肠胃灭活、维持恒定的血药浓度或药理效应、提高生物利用度、降低药物不良反应、尽可能长地保持药物的持续释放、患者可以自主用药等特点（黄胜炎。

2003）。

在我国，中药经皮给药发挥局部或全身治疗作用也有着悠久的历史。

中药外治法历史悠久。

原始社会就有用树叶、草茎涂伤口，偶然治愈疾患并发现了药物的