相分离技术分离纯化膜蛋白翻译精.docx

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相分离技术分离纯化膜蛋白翻译精

相分离技术分离纯化膜蛋白

摘要

相分离是用来纯化和浓缩洗涤剂溶膜蛋白的一种简单、高效且廉价的方法。

尽管如此，在膜蛋白科学中相分离并没有被广泛使用，并且只有相对较少的去污剂/膜蛋白的结合体具有随时可以使用的实验方案。

在这里，我们总结了影响用于膜蛋白研究的常见去污剂的相分离行为的理化参数。

并列举出了用这种方法以不同种类的去污剂纯化膜蛋白的成功例子。

在许多下游应用（如膜蛋白结晶或功能分析）中，去污剂的选择是至关重要的，我们讨论了对于一个给定的去污剂缓冲系统如何来给出新的相分离实验方案。

引言

去污剂用来从生物膜中提取膜蛋白和调整它们在水溶液中的溶解度，这是进一步进行蛋白质纯化的先决条件[1]。

膜蛋白的纯化一般来说较为繁琐[2]，因为把它们从自身的膜环境移入到去污剂缓冲区，只能部分地模拟类脂膜的理化性质。

因此，提取后许多膜蛋白不能保留其生物活性，或者只能部分地或者只能在非常特殊的缓冲溶液中保留活性。

提取后，可用用于可溶性蛋白质的相同的层析法进行膜蛋白的纯化，其区别在于去污剂必须一直在缓冲区。

去污剂不会干扰离子交换或金属螯合色谱，只是有时候会干扰亲和层析法。

尺寸排阻色谱法中，结合去污剂会增加膜蛋白的表观分子量。

相分离技术是一个功能强大的、可替代或补充色谱法的纯化实验方案。

它可直接应用于溶膜，从可溶性蛋白质和其它亲水性杂质中分离出膜蛋白。

这种粗纯化实验方案可用于膜蛋白组学或者作为色谱纯化的第一步[3,4]。

另外，相分离可用于纯化后期的同时浓缩和和进一步纯化步骤[5]。

使用相分离的步骤来纯化膜蛋白有许多好处。

该方法具有操作简单、不需要复杂的实验设备、易进行试验放大、可以和大多数色谱结合使用等优点。

其中特别对于脱除亲水化合物是非常有效的。

此外，膜蛋白可以同时纯化和浓缩，可与采用（NH4）2SO4或其它盐的可溶性蛋白的沉淀实验方案的效率相比拟。

这种方法可能有的缺点是，高浓度的去污剂不利于蛋白的稳定以及会干扰生物化学试验和其结合过程。

渗析或其他方法与去污剂吸收或凝胶过滤一样，可能需要从溶液中除去多余的去污剂。

本文中，我们描述了影响用于膜蛋白纯化的不同类别去污剂的相分离的理化参数。

并论述了成功的相分离技术的实验方案，以及如何调整实验方案用于新的去污剂缓冲体系。

去污剂的一般性质

去污剂是两亲性分子，通常由一个极性或电荷头基和憎水烃链组成。

在非常低的浓度下，这些分子可溶于水的单体。

当增大去污剂浓度超过所谓的临界胶束浓度（CMC），去污剂分子聚集形成一个非常窄尺寸分布，称为胶束。

胶束的大小取决于去污剂的类型；去污剂常用于膜生物化学，胆酸钠的聚集数（如，去污剂分子每胶束）的变化幅度为2到3，Triton®X-100的聚集数约为140。

此外，胶束的大小和临界胶束浓度（CMC）取决于离子强度和去污剂溶液的温度。

虽然离子去污剂的临界胶束浓度（CMC）随盐浓度的增加而降低，但受温度影响较小，非离子去污剂的临界胶束浓度（CMC）不受盐的影响，但随温度的上升而增长[7]。

其它影响胶束的大小和临界胶束浓度的因素是压力，pH值，以及杂质的存在[6]。

浊点和相分离

通过提高去污剂浓度，或者通过改变温度，又或者改变胶束去污剂水溶液的盐浓度来达到所谓的浊点。

胶束溶液会变混浊；胶束不能与水混合并形成较大的聚集体，从而区分于水相。

大多数但并非所有的去污剂都可分成富去污剂相，而反过来其仍然包含了大量的水。

依靠去污剂和缓冲体系，富去污剂相可以完全清澈或混浊并可以建立在贫去污剂相上方或下方。

这一过程被称为相分离，或者有时称为浊点萃取。

相分离是由于单相和两相体系的熵的差异产生，同时也具备温度依赖性。

结果类似于蛋白质沉淀因使用聚乙二醇（PEG）或（NH4）2SO4而没有足够的自由水可保持蛋白质充分水化，从而得到溶解。

同样，少量的水覆盖去污剂胶束聚集体的表面从而形成一个独立相，这种聚集体行为受温度，盐，和聚合物的影响。

相图

图1显示两个去污剂相水溶液简单的例子，展示了去污剂随温度和浓度增长的两个不同的相形态。

所有的去污剂都是低浓度的单体溶液。

单体去污

图1.（A）简化的下会溶边界的去污剂相图。

这种类型的去污剂通常

是非离子的。

所有聚乙二醇（PEG）为基础的去污剂都是这一类。

（B）

简化的上会溶边界的去污剂相图。

这是经常可以观察到的两性离子去污

剂和糖苷去污剂。

剂溶液与胶束溶液由CMC分开并依赖于其本身的温度。

高于此浓度，则去污剂由胶束构成一个特定的大小。

胶束溶液和相分离之间的界线在相图中叫做上限或下限会溶边界。

在图1A中，去污剂的浊点增长达到中间体浓度的胶束溶液的温度，就达到了混溶边界。

而在图1B中去污剂的浊点降低达到中间体浓度的去污剂胶束溶液的温度，就达到了上混溶界限。

图1A中是是典型的PEG—去污剂的相形态，而在图1B中的上混溶界限可观察到许多两性离子和糖苷去污剂。

当达到浊点，去污剂将形成一个独立相，水相将被去污剂耗尽。

在极高的去污剂浓度和低温（通常是在浓度与生化目的不相关）时，将形成包含有序去污剂分子的液晶相。

液晶相可分为立方体，六边形，或层状相[8]，这要取决于许多因素，但在此不进行讨论。

重点是要注意，温度与浓度的相图剧烈变化时，溶液的离子强度是多种多样的。

因此，可以通过加盐而不是改变温度达到胶束溶液的浊点。

已对Triton家族去污剂做了广泛的研究[9]。

其他添加剂像甘油或尿素因为不存在脂质的混合胶束[10]以及添加聚合物，都对去污剂的相形态有较大影响（见下一节）。

利用相分离纯化膜蛋白

去污剂基相分离是以聚合物基相分离为基础的。

当两个十分不同的水溶性聚合物（例如，葡聚糖dextran和聚乙二醇PEG）的混合溶液的浓度较高时，两个不混溶水相将形成。

不同的蛋白将分成两相，这取决于其物理性质和聚合物的性质[11]。

当使用带不同电荷的聚合物（例如，阳离子或阴离子聚乙二醇PEG衍生物），蛋白可以从一个相移到其它相，只需通过在低离子强度的缓冲体系中的等电离点从高到低改变pH值[12]。

这种方法的变化是两相体系，包括PEG和盐[13]。

双水相体系已可以适用于工业规模的生产[14]，但还很少应用于实验室研究。

聚合物基双水相系统可用于去污剂—溶膜蛋白，束缚去污剂的性质将影响膜蛋白分离的问题。

因为这涉及除此之外的两个聚合物，蛋白质和去污剂，

这种系统很难处理，同时在下游应用中移除聚合物也是一项额外的挑战。

但是，PEG—dextran系统联合去污剂TritonX-100已成功地用来纯化大肠杆菌外部膜磷脂酶[15]和溶壁微球菌细胞色素b556[16]。

表1.去污剂用于相分离纯化膜蛋白

图2.去污剂基的相分离可用于纯化或浓缩膜蛋白。

越过去污剂的混溶边界，

是由于温度或缓冲液离子强度的变化，又或者是由于添加了聚合物（A），会

形成一个分离出来的富去污剂相（B）。

放置一段时间（通常是几个小时）或

离心是使其充分分开为两相的必要条件。

请注意，根据缓冲体系的密度可在

贫去污剂相的上面或下面找到富去污剂相包含的膜蛋白（C）。

富去污剂相通

常是总量的1％-10％，可以达到明显的浓度因素。

当在去污剂中只加一种聚合物时也可以相分离，从而减少了系统的复杂性。

在这种情况下，去污剂胶束本身作用于第二种聚合物。

此方法是许多非离子去污剂与PEG或dextran结合使用，并已用于膜蛋白的纯化[17]。

当憎水性物质被添加到其他可溶性蛋白，在这样的系统中它们可以分割成富去污剂相[18]。

相分离也可以很好的应用于其它聚合物的体系，只要去污剂的浊点的温度不会伤害到蛋白质结构与功能就可以。

如果情况并非如此，则可以通过添加盐或改变pH值对浊点进行修正，在以下几节中就讨论不同类别的去污剂，并如图2所示，去污剂的相分离是很容易推广和应用到工业化生产过程[19-21]。

表1总结了去污剂的相分离已成功用于膜蛋白纯化的特性。

Triton家族

大多数已发表的相分离实验方案都是依靠Triton家族的去污剂。

叔辛基酚聚乙烯（乙二醇醚）n是在不同商标下商业上的应用。

其中产品略微的差别在于平均尺寸n和PEG基头基的粒度分布。

在TritonX-100，Nonidet®P-40（NP-40），和Igepal®CA-630中，n分别是9.6，9.0，和9.5[22]。

经典的相分离法应用于膜蛋白是依赖于去污剂TritonX-114（n=7-8），并在1981年由Bordier得到发展[23]。

这种去污剂在与膜蛋白工作的浓度有关时，其浊点大约为22°C，在室温下很容易分离，当样品存放在冰上时只有一相。

许多不同的膜蛋白由动物和植物组织以及微生物中提取和纯化时，均可用TritonX-114系统[22]。

为了更好地分离的两相，可以用6％的蔗糖垫；在室温下离心，可以从蔗糖垫下收集富去污剂相[24]。

假如由于蛋白质的有限稳定性而使室温为不利条件，则可添加15％-20％的甘油从而使TritonX-114的浊点降至4℃[25]。

TritonX-100的浊点为64℃[23]，因此需要添加剂来降低膜蛋白相分离的工作温度。

在室温下，添加>9％（NH4）2SO4或>16％的NaCl可降低2％TritonX-100的浊点[9]，可以用来分离膜蛋白[26]。

富去污剂相在（NH4）2SO4的浓度>20%时成为固体，很可能形成一个之前讨论过的液晶相。

在室温下，NP-40的相分离行为相类似，但是需要稍微降低盐浓度[9]。

所有叔辛基酚基去污剂都会强吸收紫外线，从而干扰光学检测。

此外，它们的CMC已经相当低而且与溶液渗析不一样。

因此，尽管它们是温和的去污剂，以致很少使膜蛋白变性，但是在许多应用中依然不是一个理想的选择。

Tween家族

Tween®去污剂是使膜蛋白溶解常使用的脂肪酸的聚氧乙烯山梨醇脂，因为它们是相对温和的去污剂，并且很少干扰酶的检测[6]。

相对于Triton和其他非离子型去污剂，盐对Tween去污剂的临界胶束浓度（CMC）和聚集数的影响较低[27]。

2％的Tween20或Tween80进行相分离时可分别加入16％或12％的（NH4）2SO4[9]，或者可以添加PEG或dextran[17]。

Tween80与两种复杂聚合物相结合已被用来纯化人和重组载脂蛋白A1[28]。

通常情况下，Tween去污剂只用于溶解蛋白质，之后使用TritonX-114的相分离方法，因为它们的特性非常相似。

Tween20和Tween80可以取代TritonX-100的相分离实验方案[29]。

聚乙二醇醚去污剂

某一尺寸分布中无论是作为纯物质或者是混合物，商品化聚乙二醇醚都可有多种不同的链长。

在许多的物理化学综述中列出了可用的聚乙二醇醚去污剂及其浊点，临界胶束浓度（CMC）和聚集数[30，31]。

所谓的CxEy是依据本身的烷基链长度（x）和聚乙二醇单位的头基数量（y）。

通常情况下，这些去污剂可以通过商品名称更好的了解它们（例如，Brij®35即C12E23，或者Emulgen147即C12E25）。

这些去污剂浊点的影响，取决于烷基链以及头基的长度；烷基链长度为常数时，浊点随头基大小的增大而降低（例如，从5°—8°C的C8E3到96°C的C8E8）。

然而，浊点随着烷基链长度的增长而下降（例如，从43°C的C8E4到4°C的C12E4）[31]。

尽管浊点有广泛的变异性，应允许在缓冲体系和常温下的任何条件下相分离，存在少数用PEG相分离法来分离纯化膜蛋白。

近来，C8POE，一种C8Ex混合物，X=2-9，已用于纯化细菌外膜蛋白。

C8POE的重要组成部分是C8E4，其浊点为43℃，而在室温下，借助于20％的（NH4）2SO4，其浊点会有所改变[22]。

C8POE优于TritonX-114的一个主要优点的是它的高临界胶束浓度（CMC），可轻松的分离去除多余的去污剂。

C10E4基本相同，其额外的优点为良好的性质，就是相分离在低盐缓冲液中可以发生在室温条件下[32]。

Triton和Tween系列去污剂，聚乙二醇醚与dextran或者PEG一起，可用于聚合物为基础的相分离。

一份详细的研究表明，膜蛋白细菌视紫红质和胆固醇氧化酶的相分离是通过去污剂C12E5，C12E8和C12E23（即Brij35），与dextranT500或PEG40000相结合来完成的。

聚合物与去污剂的浊点的转移，使得相分离发生在室温条件下，4℃时仅存在一相[17]。

同样，聚乙烯吡咯烷酮可用于诱导ＰＥＧ基的去污剂的相分离[33]。

糖苷去污剂

有糖苷头基的去污剂经常用于膜蛋白晶体。

这一类最常见的去污剂是烷基β-葡萄糖和烷基β-麦芽糖，其烷基链的长度一般为8至14。

看来，糖苷去污剂与带有其它头基的去污剂相比具有独特的性能，使它们特别适用于溶解和稳定的膜蛋白；β-十二烷基麦芽糖（即β-DM）胶束的界面区提供了一个水环境，而其它（非糖苷）去污剂的情况并非如此[34]。

在含有PEG的缓冲系统中，糖苷去污剂的相图显示了上会溶边界，从而进行低温的相分离[35]（图1B）。

这可以应用于纯化膜蛋白，可采用PEG（或dextran）与β-辛基多苷（β-OG），β-十二烷基麦芽糖苷[17，36]，或β–辛集硫葡糖苷（β-OTG）来进行相分离[37，38]。

根据不同去污剂和脂质的比率，用β-OG的相分离可以发生在不添加高聚物的膜增溶，并已用于纯化烟碱型乙酰胆碱受体[10]。

其他非离子型去污剂

N-氧化-N,N-二甲基-1-十二胺（DDAO；也可称为N-氧化-N,N-十二烷基-二甲胺，或LDAO）已成功地用于通过相分离纯化细菌反应中心。

这个特殊应用中，当pH值为8.0转变至pH小于7.0开始使用相分离。

在这种体系中富去污剂相的密度与水相非常相似，导致乳浊液在离心时并不容易被分离[39]。

在升高温度是促进其相分离，但添加盐是抑制其相分离[40]。

毛地黄皂苷，一种温和的去污剂，其主要用于真核细胞质膜蛋白的选择性溶解[41]，可用于相分离法。

膜的相分离发生在0°C时添加了13%的PEG6000和可溶性毛地黄皂苷（例如，葡萄球菌）[42]。

许多其他类型的非离子型去污剂用于膜蛋白时，在生物化学和晶体学中没有相图和浊点的详细信息。

例如去污剂烷基-N-甲基葡糖酰胺（MEGA-8toMEGA-10）[43]和6-O-（N-庚基氨基甲酰）-甲基葡萄糖苷（HECAMEG），所有这些都是很容易透析却不会使膜蛋白变性的物质，即使在高浓度中也是一样。

两性离子去污剂

许多两性离子去污剂的相图显示上会溶边界[44]，类似于糖苷去污剂（图1B）。

其浊点随烷基链的增长而增大。

但是，只存在于烷基dimethylammonioethylsulfates和烷基dimethylammoniopropylsulfates的详细物理化学研究是用于提取小疏水性有机物，而不是膜蛋白生化[44，45]。

烷基dimethylammoniopropylsulfonates（烷基链长为10至16，或者可称为磺酸甜菜碱去污剂或两性去污剂）是温和性的去污剂可用于溶膜蛋白[46]。

其浊点在0℃以下，因此，在温度降低的条件下它们的上会溶边界不能引发相分离，除非缓冲溶液添加剂的浊点达到室温[44]。

胆酸基两性离子去污剂3-[（3-胆酰胺丙基）-二甲氨基]-l-丙磺酸内盐（CHAPS）[47]经常被用来溶解膜蛋白，但是，没有资料显示其相图或浊点的存在，而C8-卵磷脂可以被很好的研究相分离行为，但还没有被用于提取膜蛋白[48]。

阴离子去污剂

十二烷基硫酸钠（SDS）常用于蛋白质的应用方面，但通常会使蛋白质变性。

至于其他阴离子去污剂，SDS的溶液行为强依赖于缓冲系统的离子强度。

SDS的聚集数从62至132增加了一倍以上，而当在25°C，NaCl浓度从0增加到500mM，其临界胶束浓度从8.1至0.5mM减少了16倍[49]。

诱发SDS产生相分离，要将0.4-0.5M的NaCl添加到SDS蛋白质混合物中[50，51]。

显然，大多数的蛋白质在高浓度的SDS中会变性，但有一点是可以想象的极其稳定的膜蛋白（例如，一些细菌外膜蛋白）可以用SDS来纯化。

阴离子去污剂胆酸和去氧胆酸似乎可以非常好的稳定膜蛋白，但他们加入盐后会产生沉淀，因此不能用于相分离[9]。

阳离子去污剂

阳离子去污剂与SDS类似，会使大多数蛋白质变性[52]。

然而，十二烷基三甲基溴化铵（DTAB或C12TAB）已成功地用于分离完整的牛视网膜视紫红质[53]。

因此，阳离子去污剂也可用于提取膜蛋白的相分离技术。

甲基三烷基氯化铵（Aliquat®-336）结合Na2SO4通过相分离可以浓缩水样中的肽类毒素[54]。

一些相分离实验方案使用阳离子与非离子型去污剂的混合物。

加入少量DTAB以引发在细菌反应中心的LDAO的相分离[39]。

将C10E4与C10TAB混合以改善以相分离为基础的纯化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶技术[55]。

混合型去污剂

在某些情况下，它可以有利于混合不同的去污剂以改变去污剂缓冲体系的相分离性能。

非离子与阳离子去污剂的混合物已被成功地用于纯化膜蛋白（例如部份阳离子去污剂），C10E4和OTG的混合物与单一去污剂相比，改进了纯化细菌反应中心的相分离性质[56]。

TritonX-114与两性离子去污剂SB-10的混合物，通过相分离的蛋白质组学研究确保了其可以增溶和富集膜蛋白，而单一去污剂却不可以[3]。

许多去污剂都是商品化的不同烷基或头基链长的混合物，它们更廉价一些因此适用于大型生产应用[例如,Triton[57],Angrimul®[58],orLorol®[21]]。

是否可以使用混合去污剂来纯化膜蛋白将主要取决于下游应用；在膜蛋白晶体学中，去污剂纯度是否影响晶体性质，这无疑会是一个问题。

去污剂的脱除

相分离中，膜蛋白分到富去污剂相。

高浓度的去污剂在这个阶段可能对蛋白质有不好的影响，以及相粘度技术造成的液体处理问题（如准确的移液量）。

收集富去污剂相并稀释它，是最简单的方法来重新建立一个单相胶束溶液。

在缓冲体系中可分离时的去污剂浓度的界定，只在去污剂高临界胶束浓度时，但它的优点是在富去污剂相中保留高蛋白质浓度。

凝胶过滤可用于缓冲液更换[59]，也可以像其他色谱方法一样进行离子交换或亲和层析。

另外，去污剂可以结合和去除，疏水性聚苯乙烯树脂（Bio-Beads®,Calbiosorb™,或Amberlite®XAD2,等）[60]或环糊精。

环糊精结合去污剂单体。

它们可以被添加到其中连同束缚去污剂一起增溶和消除，因为它们是小于胶束的不可分离的去污剂[61]。

环糊精也可以结合色谱树脂以去除去污剂[62]。

必须注意的是，如果去污剂浓度减少到低于临界胶束浓度时，膜蛋白会沉淀。

如何编写你所需要的实验方案

相分离技术发展的起点是去污剂缓冲体系，其组成视纯化何种膜蛋白而定，因为大多数增溶膜蛋白只有在某些去污剂中是稳定的[63，64]。

然后测试这个缓冲体系的相分离性能。

在最简单的情况下，可以在相分离时增加或减少温度（见表1和图1）。

通常情况下，可以在相分离开始时添加高浓度的（NH4）2SO4或其他盐。

同样，大多数去污剂加入PEG，dextran，或其他高分子量聚合物后，将进行相分离。

需要进行测试稳定的膜蛋白中是否可以存在的高盐或高聚合物浓度。

此外，必须注意的是，发生相分离时蛋白质在高浓度去污剂中不会变性。

但是，如果这些条件得到满足，即使许多专业去污剂的相图不可用时，在大多数情况下也可以相分离。

资料显示相分离的条件还可以由膜蛋白晶体试验得到，因为许多去污剂溶液中的膜蛋白晶体接近去污剂的浊点[65-67]。

通常选择盐或聚合物对去污剂缓冲体系进行简单的滴定，去建立一个有用的实验方案。

可以用肉眼去观察相分离，用分光光度计或静态光散射进行浊度的测量[68]。

更详细地分析相分离性能及动力学，可用传输和静态光散射相结合的方法测量[69]。

往溶液中添加疏水性染料结合紫外可见光谱（UV-VIS）或荧光检测可以改善这种浊点分析[70]。

有时候，相分离只发生在高于或低于一定的温度后，甚至是加入盐或聚合物之后；我们推荐在室温条件下滴定，在4°C时离心可以加快相分离。

经过收集富去污剂相，过多的去污剂，以及盐或聚合物像原先所讨论的必须被去除。

另外，相分离可以使用已确定的实验方案，其次是使用去污剂交换透析或色谱方法。

一种有前途的新相分离方法是使用含有金属螯合组的聚合物能够结合聚组氨酸标签。

His标记膜蛋白可以分成聚合物相（而不是富去污剂相），以便从非标记膜蛋白和保护标记蛋白与极端去污剂浓度中进行分离标记[71]。

这种方法还可以用来纯化膜囊内His标记蛋白[72]。