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分子生物学复习资料
一、PCR扩增
1．什么是PCR？
聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。
2.PCR原理
PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。
3．PCR程序通常有哪几个步骤
DNA模板、反应缓冲液、dNTP混合物、MgCl2、引物、耐热TaqDNA聚合酶、水
（1）引物设计与合成
设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。
其中一引物与目的片段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的片段下游另一条模板链的序列相互补。
（2）DNA模板的变性
加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。
（3）模板与引物的结合（退火或复性）
解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。
（4）引物延伸
将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。
反应阶段
循环数
温度
持续时间
1
1
94℃（预变性）
3min
2
35
94℃（变性）
30s
55℃（退火）
30s
72℃（延伸）
30s
3
1
72℃（补充延伸）
10min
4（可选）
1
4℃（冷却）
置于4℃可短时间保存PCR产物；若需长时间保存取出后置-20℃保存
4．引起PCR扩增的因素？
（1）引物的质量与特异性；
特异性：
长度适当、避免二级结构和二聚体;
完整性：
避免反复冻融;
浓度：
应适当,过高导致非特异性增加,过低则扩增产物太少.
（2）PCR循环条件（变性温度和退火温度）；
94-95℃for30-45seconds；变性不完全,往往使PCR失败，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
通常PCR的退火温度选择为Tm-5℃;退火温度越高,所得产物的特异性越高。
有些反应甚至可将退火与延伸两步合并，完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。
（3）Mg2+浓度；
Mg2+浓度越高，聚合酶活性越强，过强就会出现非特异性扩增
Mg2+浓度越低，聚合酶活性越低，扩增效率也就越低，产物就越少
（4）模板DNA的质量；
纯度：
蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应;
完整性：
模板降解会导致PCR扩增无产物;
浓度：
加量过多导致非特异性扩增增加.
（5）酶的质量。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少.
（6）dNTP
浓度适当;避免反复冻融;
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少.
（7）延伸时间：
1-2kb/min；延伸时间过长会导致产物非特异性增加。
但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。
一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间（10min）的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。
（8）循环数：
35cycles；循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加
二、基因组DNA的提取
1．原理
•CTAB，十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可使细胞破裂，释放出核酸；
•CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解释放出来的DNA（DNA在2mol/LNaCl中DNA具有较高的溶解度）；
•加入无水乙醇，可以使DNA从溶液中沉淀出来。
•EDTA主要是二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子和镁离子和EDTA结合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA
•TE缓冲液（PH为8.0），可减少DNA脱氨反应
•氯仿：
蛋白变性剂，除去蛋白
•NaAc：
沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，减少分子间的排斥力，有助于分子之间的聚集
在缓冲液Tris-HCl的条件下，用CTAB使细胞破裂，释放出核酸，核酸溶解于1.4mol/LNaCl中，再用无水乙醇沉淀出DNA来，EDTA可以保护DNA，使DNA免于被DNA酶酶解，以此得到完整的DNA。
2．提取基因组DNA的用途
构建基因组文库、Southern杂交、RFLP（限制性内切酶片段多态性）、基因克隆（PCR）
三、琼脂糖凝胶电泳
1．原理
在pH8.0~8.3，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极泳动。
采用适当浓度的凝胶介质为支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
核酸分子中嵌入荧光染料后，在紫外灯下课观察到核酸片段的位置。
2.质粒DNA的构型与电泳速率的关系（不同浓度胶有所区别）
DNA分子的迁移速率取决于由DNA分子的大小与构型而形成的分子筛效应。
①在相同的构型下，DNA分子迁移速率与其相对分子量成反比。
①相同分子量但不同构型的DNA分子迁移速率不同
分子量相同，凝胶浓度小于1.2%~1.5%浓度下，cccDNA（超螺旋）>IDNA（线性DNA）>ocDNA（开环DNA）；凝胶浓度大于1.5%浓度下，IDNA（线性DNA）>cccDNA（超螺旋DNA）>ocDNA（开环DNA）
四、质粒DNA的提取
1．什么是质粒DNA？
细胞染色体外能够自主复制的小型环状DNA分子
2．质粒DNA特点
能自主复制或整合到染色体上随染色体复制并表达、有多个限制内切位点、可转移性
3．碱裂解法提取DNA的原理
利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异分离质粒DNA和染色体DNA。
变性时，染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同，染色体DNA双螺旋结构解开而彻底变性；共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。
复性时，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；质粒DNA迅速而准确复性，保持可溶状态而留在上清中。
通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA和蛋白质。
除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
3．三种溶液的作用
（1）溶液Ⅰ：
葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）；EDTA（10mmol/L）
低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。
EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。
Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。
（2）溶液Ⅱ：
NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鲜配制）
SDS的作用：
破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。
NaOH（pH>12）的作用：
破坏氢键，使DNA分子变性。
（3）溶液Ⅲ：
60ml的5mol/LKAC；11.5ml的冰醋酸；28.5ml水
由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。
能中和溶液II的碱性，使DNA复性。
K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。
溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
Tris饱和酚：
使蛋白质变性而沉淀。
氯仿+异戊醇（24：
1）：
氯仿使蛋白质变性，但比酚缓和；异戊醇可防治溶液起泡。
无水乙醇：
夺取DNA外的水合层使DNA聚合而沉淀。
70%乙醇：
与无水乙醇的作用类似，同时可以清洗DNA，溶解与DNA一起沉淀下来的离子。
ＴＥ缓冲液（pH8.0）：
10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）
RNaseA酶：
降解RNA污染物
5．理想状态下DNAOD260/OD280分别是多少？
在什么范围比较合适？
偏大或偏小分别说明什么？
出现RNA、蛋白质等污染怎么处理？
核酸在260nm处有最大吸收峰
蛋白质在280nm处有最大吸收峰
盐和小分子在230nm处有最大吸收峰
理想状态下DNAOD260/OD280为1.8
1.7延长RNase存在时间，增加加入的量；
把RNase放入溶液1中进行RNA消化，保证了RNA更有效地被除去，也防止了在最后加入RNase导致RNase无法除去造成不必要的蛋白质污染。
OD260/OD230>2.0
五、酶切连接
1．酶切原理
限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
2．连接原理
DNA连接酶是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。
但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的（T4DNA连接酶除外），而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。
常用的DNA连接酶有两种：
来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。
二者的作用机理类似。
3．影响酶切的因素
DNA纯度、缓冲液中离子强度、Mg2+
在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。
4．出现不完全酶切如何处理？
（1）酶是否有活性
（2）模板性质是否清楚：
酶切效果与DNA的性质（线状，超螺旋状）、位点数目、位点左右的序列、甲基化程度、纯度等有很大的关系。
对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍
（3）模板纯度是否够
（4）甲基化程度对酶的活性是否有影响
（5）反应条件是否合适：
温度，BSA,缓冲溶液，DTT
（6）酶稀释和添加方式是否正确：
一般要求在最后加酶，提前混合，动作要快一些，没有分装前的Mix，要求放在冰里，尽快使用
5．什么是星号活性？
为何出现星号活性？
星号活性：
在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。
酶浓度太高；高PH；低盐；含Mn2+、Cu2+等非Mg2+金属离子；甘油浓度高于5%；存在某些有机溶剂。
过多的酶量和过长的反应时间会造成星号活性。
六、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
1．什么是感受态细胞
细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞（Compenentcells）。
2．大肠杆菌转化的原理（CaCl2法）
0.1mol/LCaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。
在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。
摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。
带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
3．CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，低温的主要目的？
低温目的：
（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；
（2）有助于DNA—Ca2+吸附于细胞表面；（3）防止DNAase降解DNA。
5．热休克温度和目的是什么？
热休克温度是42℃；目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。
6．制备感受态细胞和转化过程注意事项
（1）一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%
（2）对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低
（3）重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍
（4）整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿及试剂都要灭菌
（5）用纯的试剂，注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染
（6）整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴
（7）CaCl2处理后细胞很脆，动作要轻，慢。
6．筛选阳性克隆的方法有？
插入失活法、抗性筛选（含有抗生素的培养基，能长出菌落的是重组基因表达）、蓝白筛选（白斑是重组子，蓝斑是未表达的）、杂交筛选、免疫学筛选、酶切图谱鉴定、PCR鉴定
7．蓝白斑筛选的原理是？
现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。
这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这种现象称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
而重组大肠杆菌形成白色菌落。
七、SDS-PAGE
1．SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳的原理？
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
因此在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和强还原剂后，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小
2．如何将一DNA片段连接进入蛋白表达载体并进行蛋白的表达？
（1）目的基因的获取
（2）克隆载体的选择与构建
（3）外源基因与载体的连接
（4）重组DNA导入受体细胞
（5）重组体的筛选
（6）克隆基因的表达
3．琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳异同点
聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析，其装载的样品量大,回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离。
什么是琼脂糖凝胶电泳？
琼脂糖凝胶的凝胶孔径大，适合大分子DNA电泳和需要快速简单分析的DNA电泳，电泳方式一般采用水平潜水电泳.优点是快速简单，但分辨率不是很高,对于差异较小的DNA片段难以分辨。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的异同？
（1）相同点
聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶都可以作为DNA电泳的介质。
聚丙烯酰胺凝胶电泳与琼脂糖凝胶电泳都能够用于纯化蛋白质的电泳。
一般说来,分离鉴定小于1000个核苷酸的核酸片段可用聚丙烯酰胺电泳,分离鉴定0.1-50kb的DNA片段可用恒场常规琼脂糖电泳,而分离鉴定大于50kb的
DNA片段则需采用脉冲场琼脂糖电泳.
（2）异点
物理性质不同：
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，只有变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶两种形式，且分辨力小；琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质，分辨率高，制备容易，分离范围广。
分离对象不一样：
聚丙烯酰胺电泳则是分离蛋白质，琼脂糖凝胶电泳用来分离DNA或者RNA。
结合介质不同：
聚丙烯酰胺电泳驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷，琼脂糖凝胶电泳驱动力来源于DNA骨架本身负电荷，虽都是负电荷，但是方向相反。
结果观察方式不同：
聚丙烯酰胺电泳是在考马斯亮蓝染色观看，琼脂糖凝胶电泳是在紫外灯下观察
反应不同：
聚丙烯酰胺电泳所是靠发生的化学反应来形成的凝胶，而琼脂糖凝胶电泳是加热融化，冷却凝固等物理反应。
烦琐性不同：
聚丙烯酰胺电泳可以很快地进行，并能容纳较大的DNA上样量，但与琼脂糖凝胶电泳相比在制备和操作上还是更烦琐些。
装载量不同：
聚丙烯酰胺电泳的装载量远大于琼脂糖凝胶电泳，而其分辨率不受到显著影响。
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