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3.2矿区重金属耐受菌分离的意义
4.该领域需要解决问题
引言
土壤是人类赖以生存的基础，与人类的健康息息相关。
近年来，国内外土壤的各种污染都有明显的上升趋势，尤其是重金属污染。
[10]目前，全国遭受不同程度重金属污染的耕地面积已接近2000万hm2，约占耕地总面积的1/5。
农业部的调查表明，我国污染区面积约占140万hm2，遭受重金属污染的土地面积占污染总面积的64.8%，其中轻度污染面积占46.7%、中度污染占9.7%、严重污染占8.4%，以Hg和Cd的污染面积最大。
此外Cd污染耕地1.3万hm2，涉及11个省市的25个地区；
Hg污染3.2万hm2，涉及15个省市的21各地区；
粮食含Pb量大于1.0mg/kg的产地有11个，有6个地区生产的粮食含As量超过0.7mg/kg。
[9]
本研究所用土壤样品直接采自矿区，没有人为添加重金属，因此能真实反映自然状态下微生物状况。
而当前许多关于这方面的试验是通过试验室培养试验或田间试验，这类实验中重金属是直接加入的，按照试验设计控制有机质、pH值和含水率，一次性或分几次地加入相应的重金属，这样可以比较清楚地揭示重金属对土壤微生物的短期污染行为，但是由于大部分矿区土壤中的重金属是长期积累的结果，使得这些人为试验结果与自然污染土壤分析结果存在一定的差异。
临泽县位于河西走廊中部，地处东径99°
51′-100°
30′、北纬38°
57′-39°
42′之间。
东邻张掖市，西接高台县，南依祁连山与肃南裕固族自治县接壤，北靠合黎山与内蒙古阿拉善右旗连界，总面积2727.29平方公里。
临泽县地势南北高，中间低，由东南向西北逐渐倾斜，海拔在1370-2200米之间，地貌类型有南部祁连山中山区、中部走廊平原区、北部合黎山低山区。
全县国土面积中平原区占70％，山区占30％，成矿地质条件差，矿产资源相对贫乏。
境内已发现的矿产主要有石膏、含碘凹凸棒石粘土、海泡石、蛭石、石英石、水泥用灰岩、煤、铁、锰、铜、金、矿泉水等，集中分布在北部合黎山区。
共有矿产地28处，其中：
铁矿9处，探明储量819万吨；
海泡石矿2处，探明储量18万吨；
凹凸棒石粘土矿1处，探明储量6400万吨；
石膏矿4处，探明储量1.1亿吨；
蛭石矿1处，探明储量1万吨；
水泥用灰岩矿1处，探明储量300万吨；
矿泉水1处，枯水期最小流量每天300.23立方米；
煤矿、金矿、锰矿、铅矿、白云岩矿各1处，铜矿、石英石矿各2处，均在进一步做地质工作。
具有资源优势和开发潜力的矿床主要有：
东小口子锰铁矿床：
位于平川镇东北，面积12.45平方公里。
探矿面积12.2６平方公里，采矿面积0.185平方公里。
采矿区内分为南北两条矿带，探明矿石量306万吨，矿石以菱铁矿为主，次为磁铁矿、软锰矿。
矿石平均品位:
铁27.35%，锰8.66%。
小马鞍山锰铁矿床：
位于平川镇北，面积6.63平方公里，预测资源量370万吨。
矿石以磁铁矿为主，次为褐铁矿、软锰矿。
矿石平均品位：
铁27.33％，锰8.62％。
凹凸棒石粘土矿床：
位于板桥镇正北山－杨台洼滩，总面积60多平方公里，分为南、北、中三个矿带。
矿床中凹凸棒石粘土与石膏共生，呈互层状，凹凸棒石粘土在矿床中的含量为46%左右，石膏在矿床中的含量为12.9%左右。
目前，南、北矿带正在做进一步的地质勘查工作。
中矿带推断的凹凸棒石粘土内蕴经济资源量107.5万吨，预测资源量5168万吨；
推断的石膏内蕴经济资源量16万吨。
凹凸棒石粘土具有较多的微量元素和吸附性、吸水性、脱色性、造浆性等特殊的物化性能，广泛用于石油、环保、化工、建材等领域。
该矿床具有资源量巨大、采矿成本低、矿区交通方便、凹凸棒石应用广泛等优势
矿产资源较丰富，目前已发现的矿种主要有凹凸棒、石膏、石英石、煤、大理石、蛀石、石墨、玻璃用石英、钾长石、膨润土、铁、锰、铜、沙金等，矿产地25处。
本研究是采集临泽县平川镇的铁锰矿作为研究对象。
锰铁矿是锰铁氧化物矿物，它属于尖晶石族中磁铁矿系列中的一种矿物。
重金属指原子密度大于5g/cm3的金属元素，包括Cd、Cr、Hg、Cu、Pb、Zn、Ag、Ni等。
由于As、Se在毒性和其他性质上与重金属类似，一般也列入重金属范畴。
重金属元素如Cu、Zn等是动植物代谢必需的微量元素，但当它们超过一定的阈值后就会有相当的毒性。
还有一些元素如Cd、Pb等，则被认为是动植物的非必需元素，由于它们能与氨基酸侧链上的S原子和N原子发生作用，具有很高的毒性。
[1]
重金属进入土壤中，不但会降低微生物数量和土壤酶活性，而且对土壤中有机污染物的降解、土壤的呼吸代谢、土壤的氨化和硝化作用会有抑制作用。
重金属作为一种重要的常见污染物，对生物的毒害作用主要表现在两个方面。
一是它们极易同一些生物大分子如酶的活性中心，以及给电子基团如蛋白质上的巯基、羧基，核酸上的碱基、磷酸酯基等结合，导致这些生物大分子失活，最终引起生物个体的病变和死亡。
其次，由于重金属大多不可能被生物分解，进入生物体内后和大量的金属硫蛋白、类金属硫蛋白和小分子量的配体如甘氨酸、牛磺酸等结合，极易在生物体内积累，这种积累作用会随食物链转移，可以危害到整个食物链网所有个体特别是人类的身体健康和生命安全。
微生物是土壤中生物类群最多、生物量最大、对土壤元素的地化循环和肥力具有最大影响力的类群。
钒：
伤人的心、肺，导致胆固醇代谢异常。
金属钒毒性很低，但钒化合物对人有中度或高度毒性，其毒性作用与钒的价态，溶解度，摄取的途径等有关。
接触钒的有些人可发生荨麻疹，过敏性湿疹样皮炎，剧烈瘙痒等，如果吸入过多的钒，可刺激呼吸、消化及神经系统，也可损害皮肤、心脏和肾脏，还可抑制三磷酸腺苷酶及磷酸酶的活性，使皮肤出现炎症并引起变态性疾病。
砷：
是砒霜的组分之一，有剧毒，会致人迅速死亡。
长期接触少量，会导致慢性中毒。
砷进入人体内被吸收后，破坏了细胞的氧化还原能力，影响细胞正常代谢，引起组织损害和机体障碍，可直接引起中毒死亡。
如果将砷作用于人体局部，最初有刺激症状，久之出现组织坏死。
砷对粘膜具有刺激作用，可直接损害毛细血管。
另外还有致癌性。
锑：
与砷能使银手饰变成砖红色，对皮肤有放射性损伤。
还能伤害骨骼、肝脏、肾脏。
铊：
会使人多发性神经炎。
锰：
超量时会使人甲状腺机能亢进。
也能伤害重要器官。
汞：
汞是重金属污染中毒性最大的元素。
食入后直接沉入肝脏，对大脑、神经、视力破坏极大。
天然水每升水中含0.01毫克，就会导致人中毒。
积累在体内的汞会侵入神经中枢系统，破坏脑血管，表现为四肢麻木、语言失常、视野缩小、听觉失灵等。
这些就是著名的公害病“水俣病”的典型特征。
镉：
镉不是人体所必需的微量元素。
新生婴儿体内几乎无镉，人体中镉全部是出生后通过外界环境（例如饮水、食物、香烟）进入人体的。
镉中毒症状主要表现为动脉硬化、肾萎缩、肾炎等。
镉可取代骨骼中部分钙，引起骨骼疏松软化而痉挛，严重者引起自然骨折，另外镉还被发现有致癌和致畸作用。
镉还能导致高血压，引起心脑血管疾病；
破坏骨骼和肝肾，并能引起肾功能衰竭。
铅：
是重金属污染中毒性较大的一种，一旦进入人体将很难排除。
被人体吸收后有慢性中毒作用。
对儿童的血铅负荷，神经行为功能进行相应研究后得出，长时期暴露于含铅环境的儿童有着反应缓慢，视觉迟钝之现像。
能直接伤害人的脑细胞，特别是胎儿的神经系统，可造成先天智力低下；
对老年人会造成痴呆等。
另外还有致癌、致突变作用。
铬：
在非污染的低层大气和天然水中均含有微量的铬，如雨水中含铬2-4微克每升，土壤中含铬约在100-500毫克每升之间。
其中六价铬的毒性纟三价铬大，六价铬是一种常见的致癌物质，对人体和农作物均有毒害作用。
它能降低生化过程的需氧量，从而发生内窒息，铬盐对肠胃均有剌激作用。
铬的化合物在工业上应用较多，如电镀、化工、印染等行业都含有三价铬或六价铬的废水排出，使局部地区受到铬的污染。
钴：
能对皮肤有放射性损伤。
使用钴盐（氯化钴）时，可能由于摄入量过量引起钴中毒，常表现为皮肤潮红、胸骨后疼痛、恶心、呕吐、耳鸣及神经性耳聋，还可出现红细胞增多症，重者导致缺氧紫绀、昏迷甚至死亡，如治疗不及时，可直接或间接影响小儿智力发育。
因此要严格掌握钴盐的使用剂量，出现胃肠道反应时立即停用。
平时不要食用被钴污染的食物和饮水。
发现钴中毒应及时洗胃，口服豆浆、蛋清，服用半胱氨酸，维持体内水盐平衡，食物中增加蛋白质和维生素C的含量。
由于矿山开采、金属冶炼、工业污水、和污泥的农业应用，大量有毒有害重金属元素进入土壤系统，对生态环境造成严重的影响。
人类的生存和发展要依靠水源和可耕地的土壤，但目前水和土壤的污染已成为影响社会发展的主要问题之一。
特别是重金属的污染对动物和人类的健康都构成严重的影响。
由于大量的工业活动造成了许多微量元素如镉、铜、铅、锌和汞等非常有毒的重金属都频繁出现在人类的环境中，并且不断增加。
水体重金属污染及危害
中国土壤重金属污染
重金属污染
被重金属污染的湘江
土地重金属污染严重
重金属污染土壤的主要方式有：
①土壤中的重金属通过雨水淋溶作用向下渗透，导致地下水污染；
②受污染的土壤直接暴露在环境中，通过土壤颗粒物等形式直接或间接地被人或动物所吸收；
③外界环境条件的变化如酸雨、某些土壤
添加剂等因素提高了土壤中重金属的生物可利用性，使得重金属较容易地为植物吸收利用而进入食物链，对食物链上的生物产生毒害。
[5]
重金属污染的特点是不能被降解而从环境中彻底消除，只能从一种形态转化为另一种形态，从高浓度变为低浓度，能在生物体内积累富集。
所以重金属的生物修复有两种途径：
通过在污染农田种植木本植物、经济作物，利用其对重金属的吸收、积累和耐性除去重金属，或者利用生物化学、生物有效性和生物活性原则，把重金属转化为较低毒性产物（络合态、脱烷基、改变价态）；
利用重金属与微生物的亲合性进行吸附及生物学活性最佳的机会，降低重金属的毒性和迁移能力。
[11]
面对严峻的现实，许多有识之士在重金属土壤的修复方面做了许多卓有成效的工作，取得了显著的成果。
其中研究最多的就是污染土壤的生物修复技术，包括植物修复、微生物修复和动物修复。
生物修复技术是土壤污染修复的主要处理技术，而微生物修复是土壤生物修复技术的重要组成部分，是最具发展和应用前景的生物学环保新技术。
土壤重金属超积累植物的研究可追溯到19世纪。
如Baumann早在1885年就报道了遏蓝菜属植物茎叶灰分中的ZnO含量达17%。
目前，超积累植物的定义采用较多的是Baker和Brooks1983年提出的参考值，即把植物叶片或地上部分（干重）中含Cd达到100mg/kg，含Co、Cu、Ni、Pb达到1000mg/kg，Mn、Zn达到10000mg/kg以上的植物称为超级累植物。
一般情况下，重金属超积累植物的认定要考虑三个条件：
植物地上部富集重金属的量要达到一定临界标准，在较低污染水平下也有较高的吸收速率；
S/R>
1（S和R相应代表植物地上部分与地下部分的重金属含量），即植物应有较强的转运能力，一般植物的S/R<
0.1；
与一般植物相比超富集植物能够忍耐较高浓度的重金属毒害，一般植物则会发生毒害甚至死亡。
铬对植物的毒性主要发生在根部，吸收的铬约有98%保留在根部，高浓度的铬不但对作物产生危害，而且会干扰植物对必需元素的吸收和运输。
[1]。
目前，对砷超积累植物的研究主要集中的蜈蚣草上。
今后，需要研究不同种属、种群获生态型对砷的吸收、转运、富集和解毒机理，同时开发砷超积累植物在环境修复工程上的应用技术，寻找筛选更多的砷超积累植物[1]。
目前发现的硒超积累植物并不多，除豆科的双槽紫云英与十字花科的Stanleyapinnata外，其余均为次级富集体。
[1]。
锰是人体必需的微量元素之一，但摄入过量的锰则引起人体锰中毒。
已报道的锰超积累植物只有11种，主要集中的夹竹桃科、卫矛科、藤黄科、桃金娘科、山龙眼科，主要是生长在亚热带地区的木本植物[1]。
铜是植物生长所必需的微量元素，但过量的铜却有着很高的植物毒性。
目前发现的铜超积累植物只有24种，主要分布在扎伊尔内。
鸭跖草是铜的超积累植物。
到目前为止，已报道的锌超积累植物有18种，主要生长在富含Zn/Pb的土壤上，分布在欧洲和澳大利亚等。
东南景天是我国杨肖娥等发现的一种锌超积累植物，具有无性繁殖、生长快、适于刈割等特点。
在所有的重金属污染环境中，铅是最常见的一种，目前有关Pb的植物修复研究很多。
据报道，圆叶遏蓝菜可吸收铅达8500mg/kg茎干重；
印度芥菜不仅可吸收铅，还可以吸收并积累隔、铜、镍、铬和锌等。
一些农作物，如玉米和豌豆也可大量吸收Pb，但达不到植物修复的要求。
此外，由于污染土壤通常表现为多种金属的复合污染，因此多金属超积累植物资源对复合污染土壤的植物修复有着极其重要的意义。
微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物群，在适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术，它已成为污染土壤生物修复技术的重要组成部分。
微生物修复长期在重金属的选择作用下，微生物也不断增强自己的耐性、抗性，有高度的选择性。
面对重金属的危害，微生物有自身的防护措施，可通过各种代谢活动，发生氧化还原、酶化等反应，以适应日益加剧的污染状况。
微生物还可以通过直接、间接的代谢活动溶解重金属离子。
代谢产生的有机酸和氨基酸可溶解重金属及含重金属的矿物，也可以加速重金属元素从风化壳中的释放。
这些都可以改变重金属在土壤中的存在状态，降低污染程度。
微生物也可通过活动产生铁载体、金属硫蛋白、植物螯合肽、改变土壤酸碱度影响重金属的化学行为。
大多数微生物表面带负电荷，有利于对重金属的吸附，但吸附主要取决于不同结合部位对金属的选择性。
同时微生物的修复作用与土壤的状况也有关，试验表明在添加了氮磷营养盐的土壤中，微生物的降解作用明显减弱[7]。
微生物对土壤中重金属活性的影响主要体现在４个方面：
①溶解和沉淀作用；
②生物吸附和富集作用；
③氧化还原作用；
④菌根真菌对土壤重金属的生物有效性影响[5]。
在土壤环境中，微生物能够利用有效的营养和能源，在土壤滤沥过程中通过分泌有机酸络合并溶解重金属。
微生物对土壤重金属离子的溶解方式主要是通过各种代谢活动直接或间接地进行，其代谢作用能产生多种低分子量的有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等。
土壤微生物可通过带电荷的细胞表面吸附重金属离子，或通过摄取必要的营养元素主动吸收重金属离子，并将重金属离子富集在细胞表面或内部。
土壤中的一些重金属元素可以多种价位形态存在，它们以高价离子化合物存在时溶解度通常较小，不易发生迁移，而呈低价离子化合物存在时溶解度较大，较易发生迁移。
微生物的氧化作用能使这些重金属元素的活性降低。
2.4.4微生物对重金属-有机络合物的生物降解
重金属可与土壤有机质形成稳定的络合物,对重金属在土壤中的化学行为产生深刻的影响。
[8]
2.4.5菌根真菌与土壤重金属的生物有效性影响
众所周知，菌根真菌与植物根系共生可促进植物对养分的吸收和植物生长。
菌根真菌也能借助有机酸的分泌活化某些重金属离子。
菌根真菌还能以其他形式如离子交换、分泌有机配体、激素等间接作用影响植物对重金属的吸收。
[12]
2.4.5有关微生物修复领域展望
从目前来看，微生物修复是最具发展和应用前景的生物修复技术，在降解途径以及修复技术研发等方面取得了一定的进展，但大规模应用于实践的并不多，且微生物与土壤，以及微生物与重金属之间是如何相互作用的仍需进一步研究。
因此，驯化和筛选高效菌株，构建菌种库；
应用现代生物技术，培育具有超量蓄积重金属的微生物；
研究微生物的重金属抗性基因的结构和功能；
优化组合修复技术，如动物＋生物、植物＋微生物、物化方法＋微生物等组合修复等几个方面将是未来研究的重点[5]。
从采矿学与地质学研究中发展起来的地统计学是应用数理统计学的一个分支。
与传统的统计学相比，地统计学可应用于土壤重金属研究中，能探索土壤重金属的空间分布特征及其变异规律。
地统计学的基础理论与方法主要包括：
区域化变量、半方差函数、克立格空间插值技术。
半方差函数可以用来描述研究土壤重金属分布的空间相关性；
而克立格插值可以对未采样区土壤重金属的含量进行无偏最优估计[6]。
土壤微生物可以积累和转化环境中的重金属，其中，生物积累机理主要表现在胞外络合作用、胞外沉淀作用以及胞内积累三种作用方式。
由于微生物对重金属具有很强的亲和吸附性能，有毒金属离子可以沉淀在细胞的不同部位或结合到胞外基质上，或被轻度螯合在可溶性或不可溶性生物聚合物上。
一些微生物如动胶菌、蓝细菌、硫酸还原菌以及某些藻类，能够产生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的阴离子基团，与重金属离子形成络合物。
同时，重金属进入细胞后，可通过“区域化作用”分布在细胞内的不同部位，体内可合成金属硫蛋白（MT），MT可通过Cys残基上的巯基与金属离子结合形成无毒或低毒络合物。
可见，微生物生物技术在净化污染土壤环境方面具有广泛的应用前景。
3.2矿区重金属耐受菌分离的意义
在实验室条件下，细菌长期在有单一重金属的培养基中培养时，对该重金属的耐受能力会逐渐增强，但对不同重金属的适应进化反应是不一样的。
在矿区土壤中，土壤往往同时受多种重金属的污染。
本研究调查了锰铁矿的微生物区系，发现其理化性质随堆积年代以及深度的不同发生若有规律的变化，本研究通过把矿区土壤中的微生物在不同的重金属下培养处理，考察了不同种金属对锰铁矿渣中的细菌和放线菌存活率的影响，从侧面说明了这些因子对细菌和放线菌适应重金属污染的影响[2]。
4.该领域需要解决的问题
目前，在进化毒理学领域内，来自动植物种群的研究报道尽管很少，资料有待补充，但也取得了一些成果。
使得人们对污染物的慢性效应，即对动植物种群的隔代效应（遗传多样性和等位基因频率改变）有了一些基本的认识。
对于微生物来说，目前在这种水平上的工作主要集中在实验室条件下纯化菌种对重金属的抗性、吸收和积累的规律，实际上仅是传统毒理学最基本的研究内容。
有关自然微生物种群受污染后生理遗传结构的变化至今仍然是空白，因此在进化生态毒理学的研究领域内还没有来自微生物种群的研究报告。
形成这种局面的原因主要是难以获取具有自然污染经历的微生物种群作为研究材料。
以动植物为例，通常可以在污染环境中种植相同的植物，然后考察不同污染环境或不同污染经历对同种植物的遗传结构影响。
也可以直接观察污染环境中自然生长的动植物种类来考察自然种群对污染的响应。
然而要将一个一直种的微生物在野外条件下进行培养，在技术上不可行。
其次，直接分离和鉴定自然环境中的同种微生物群体是一个艰巨的工作，要从不同污染经历的环境中得到同一种微生物本身也很盲目。
这些问题是探讨重金属污染环境中自然微生物种群遗传多样性变化的主要障碍。
[3]
然而由于大多数微生物特别是细菌属于单细胞生物，不存在基因显隐性，基因突变可以很快在表型上显现，因此对环境因子反映迅速。
此外，，微生物生长繁殖快，有的种类在野外一般每天分离1-2次，因此，在较短的时间内可以达到对重金属胁迫的适应进化。
有研究表明，在暴露到Cu、Cd、Zn、Ni、污染5-8个月内，土壤细菌就显示了增加的耐受能力，对Pb的耐受也仅在2年时间内发生。
这些实验证据和微生物固有的特性，受重金属污染的群体在遗传结构上的变化肯定存在，但如何变化时亟待解决的问题。
此外，自然环境中微生物的分布、生长和繁殖不仅受其他种类的微生物影响，还受到动植物、PH、水分等因子的影响。
环境中存在的群体，实际上是污染初期存活下来的群体对随后整个污染环境适应的综合结果，可以想象这些环境中的微生物不仅要对重金属的毒性胁迫产生适应，还要对重金属污染连带的PH变化、营养物缺乏、水分胁迫等多种生态因子进行适应。
因此在污染环境中某个种群的生理遗传改变或群落结构的改变有时并不是重金属直接作用的结果，有可能是因为重金属的介入导致其他物理和生物因子重新组合而产生的间接效应。
已知在分子水平上，在主导生态因子不变的情况下，次级生态因子会改变选择作用的靶位点。
因此，同样的一个重金属元素污染，如果环境中其他理化因子组合不同，适应群体在分子水平的变化可能也不相同，最终导致的遗传多样性水平会有所差异。
比如，微生物对某种重金属抗性的提高可能并不仅是针对该种重金属的毒性产生的，有可能是因为适应他种重金属甚至是其他生态因子如干旱、高盐胁迫的同时增加了对该种重金属的适应。
这种复合效应如果不结合多个生态因子来综合考察微生物种群的重金属抗性以及其他生理和遗传等特征不变化很难说明问题。
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