微生物学实验室常用试剂与培养基.docx

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微生物学实验室常用试剂与培养基

微生物学实验室常用试剂与培养基

第一节常用试剂及其使用方法

一、诊断用纸片

⑴杆菌肽纸片（0.04U/片）：

抑菌圈>10mm为敏感。

质控菌株:

D群链球菌阴性,A群链球菌阳性。

⑵SMZ纸片（1.25μg/片、23.75μg/片）：

出现抑菌圈即为敏感。

质控菌株：

D群链球菌阳性，A群链球菌阴性。

⑶新生霉素纸片（5.0μg/片）：

抑菌圈≥16mm为敏感。

质控菌株：

表皮葡萄球菌阳性，腐生葡萄球菌阴性。

⑷O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片：

参见第五节《生化试验培养基》。

二、诊断用血清

1.沙门菌属诊断血清

⑴A-F群O多价诊断血清。

⑵特异O群因子诊断血清：

常用的有O2，O4，O7，O9，O10诊断血清。

⑶特异H因子诊断血清常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子诊断血清。

2.志贺菌属诊断血清

志贺菌属4种多价血清：

痢疾志贺菌Ⅰ、Ⅱ血清，福氏志贺菌多价血清及分型血清（1～6型），宋内志贺菌诊断血清，鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。

3.致病性大肠埃希菌诊断血清

肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清，产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清，肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清，肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157：

H7。

4.霍乱弧菌O1、O139混合多价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清

5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清

6.链球菌分类诊断血清

7.肺炎链球菌诊断血清

8.耶尔森菌诊断血清

三、常用染色液

1.革兰染色液

⑴结晶紫溶液A液：

结晶紫20g，95%乙醇20ml；B液：

草酸铵0.8g，蒸馏水80ml。

染色前24h将A液、B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。

⑵碘液:

碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。

将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升蒸馏水,使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至碘、碘化钾完全溶解。

最后补足水量。

也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。

⑶脱色液：

95%乙醇

⑷复染液：

沙黄2.5g，95%乙醇100ml为贮存液，取贮存液10ml，加蒸馏水90ml为应用液。

2.抗酸染色液

⑴碱性复红染色液：

①萋纳石炭酸复红溶液：

碱性复红乙醇饱和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。

②脱色液：

浓盐酸3ml，95%乙醇97ml。

③复染液（吕弗勒美蓝液）：

美蓝乙醇饱和溶液30ml，100g/L氢氧化钾溶液0.1ml，蒸馏水100ml。

⑵金胺O-罗丹明B染色液：

①罗丹明B液：

罗丹明B0.1g加蒸馏水100ml。

②1g/L金胺O液：

金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸5ml,混匀。

③3%盐酸乙醇。

④稀释美蓝液：

吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。

3.鞭毛染色液（改良Ryu法）

A液：

5%石炭酸10ml，鞣酸2g，饱和硫酸铝钾溶液10ml；B液：

结晶紫乙醇饱和液。

应用液A液10份,B液1份,混合,室温存放备用。

4.异染颗粒染色液

甲液：

甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿2g/L，95%乙醇2.0ml，蒸馏水100ml。

乙液：

碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。

先将碘化钾加入少许蒸馏水（约2ml）,充分振摇,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后,加蒸馏水至300ml。

5.荚膜染色液

⑴印度墨汁或50g/L黑色素水溶液

⑵5g/L苯胺蓝水溶液。

第二节      基础培养基

一、液体基础培养基

1.蛋白胨水

[用途]

用于细菌靛基质试验；一般细菌培养和传代。

[配法]

蛋白胨（或胰蛋白胨）10g，氯化钠5g，蒸馏水1L。

将上述成分溶于水中，校正pH至7.2,分装试管，每管2~3ml，置121℃灭菌15min备用。

[质量控制]

大肠埃希菌生长良好，靛基质阳性；伤寒沙门菌生长良好，靛基质阴性。

2.营养肉汤

[用途]

一般细菌的增菌培养，加入1%的琼脂粉亦可作营养琼脂。

[配法]

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L。

将上述成分称量混合溶解于水中，校正pH至7.4，按用途不同分装于烧瓶或试管内。

经121℃灭菌15min，作无菌试验后冷藏备用。

[质量控制]

金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、化脓性链球菌生长良好。

[保存]

置冰箱3周内用完。

3.牛肉浸液培养基

[用途]

细菌培养最基础的培养基，除用于一般细菌的培养外，又可以作营养琼脂及其它培养基的基础。

[配法]

新鲜除脂牛肉500g，氯化钠5g

蛋白胨10g，蒸馏水1L。

先将牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切块绞碎。

称取500g置容器加入蒸馏水1L，搅匀后置冰箱过夜，次日煮沸加热30min，并用玻棒不时搅拌用绒布或麻布进行粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。

在过滤中加入蛋白胨10g、氯化钠5g溶解后，用氢氧化钠溶液校正pH至7.6~7.8，并加热煮沸10min，补充蒸馏水至1L，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，经121℃15min灭菌备用。

[用法]

根据用途不同可以制成营养肉汤，以此为基础制成其它培养基。

如制作固体培养基，加入琼脂15~20g/L即可。

[质量控制]

金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良好。

[保存]

置4℃冰箱内可以使用较长时间。

注:

商品牛肉浸膏粉，一般使用量为3～5g/L。

二、固体基础培养基

1.营养琼脂

[用途]

一般细菌和菌株的纯化及传种。

[配法]

蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂粉（优质）12g，蒸馏水1L。

将上述成分（除琼脂外）溶于水中，校正pH7.2～7.4后加入琼脂，煮沸溶解，根据用途不同进行分装，经121℃灭菌15min，倾注平板或制成斜面，冷藏备用。

[质量控制]

金黄色葡萄球菌菌落呈浅黄色；痢疾志贺菌菌落无色；铜绿假单胞菌菌落无色或浅绿色。

[保存]

置4℃冰箱保存，2周内用完。

2.血琼脂培养基

[用途]

一般病原菌的分离培养和溶血性鉴别及保存菌种。

[配法]

pH7.4~7.6牛肉浸液琼脂100ml，脱纤维羊血（或兔血）5~10ml。

将血琼脂基础经121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右以无菌手续加入羊血，摇匀后立即倾注灭菌平皿内，待凝固后，经无菌实验冷藏备用。

[质量控制]

化脓性链球菌ATCC19615生长良好，β-溶血；肺炎链球菌ATCC6303生长良好，α-溶血；表皮葡萄球菌ATCC12228生长良好,不溶血。

[保存]

置4℃冰箱，1周内用完。

3.巧克力琼脂培养基

[用途]

主要用于嗜血杆菌的分离培养，亦可用于奈瑟菌的增殖培养。

[配法]

鲜牛肉浸出液1L，蛋白胨10g,

氯化钠5g，琼脂粉12g，无菌脱纤维

羊血或兔血100ml。

将上述成分（除兔血外）加热溶解，调pH至7.2，置121℃15min高压灭菌，待冷至约85℃，以无菌方式加入兔血，摇匀后置85℃水浴中，维持该温度10min，使之成巧克力色。

取出置室温冷至约50℃，倾注平板或制成斜面备用。

[质量控制]

流感嗜血杆菌ATCC10211、肺炎链球菌ATCC6305生长良好，菌落典型。

[保存]

置4℃冰箱，1周内用完。

4.胱氨酸胰化酪蛋白琼脂

[用途]

常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。

[配法]

胱氨酸0.5g,胰化酪蛋白20g,氯化钠5g，亚硫酸钠0.3g，琼脂3.5g，酚红0.0175g，蒸馏水1L。

将上述成分（酚红除外）混合溶解，调pH至7.2，加入酚红指示剂。

分装试管，115℃灭菌15min。

[用法]

用于测定糖发酵时，按需要加入各种糖溶液，将待检标本直接种于培养基管内，置35℃孵箱，18~24h观察结果。

培养基由红色变为黄色为阳性，不变色为阴性。

第三节保存和增菌培养基

一、菌种保存培养基

[配法]

蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，琼脂粉4.5g，蒸馏水1L。

将上述成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.4~7.6，分装试管2/3左右高度，121℃高压灭菌15min，成为半固体培养基，备用。

[质量控制]

培养基呈淡黄色半固体状。

大肠埃希菌（ATCC25922）生长良好,动力阳性；福氏志贺菌（ATCC12022）生长良好,动力阴性；金黄色葡萄球菌（ATCC25923）生长良好,动力阴性。

二、增菌培养基

1.葡萄糖肉汤

[用途]

用于血液增菌。

[配法]

蛋白胨（或月示胨）10g，氯化钠5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸橼酸钠3g，5g/L对氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，青霉素酶1000U。

将蛋白胨、氯化钠混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。

过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌115℃20min后，每瓶加入青霉素酶50U，经无菌试验合格后，冷却备用。

[用法]

将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35℃培养箱内，每天1次取出观察结果。

如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、伊红美蓝琼脂及巧克力琼脂平板等。

无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7d，仍无细菌生长方可弃去。

在观察的过程中，至少应作两次分离培养。

注:

⑴枸橼酸钠为抗凝剂，可使血液加入培养基中不凝固。

⑵对氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。

⑶硫酸镁主要抑制血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。

⑷本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%～0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体的抗药作用从而提高检出率。

2.血液增菌培养基

[用途]

血液和骨髓液病原菌的增菌培养。

[配法]

蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸橼酸钠3g，磷酸氢二钾2g，5g/L对氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，4g/L酚红溶液6ml，青霉素酶50U，聚茴香脑磺酸钠（SPS）0.3g，蒸馏水1L。

将上述成分（除酚红指示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶30～50ml，经121℃灭菌15min和35℃24h无菌试验备用。

临用时每瓶加入1.5～2.5U青霉素酶。

[质量控制]

伤寒沙门菌ATCC50096、白色念珠菌ATCC10231、化脓性链球菌ATCC19615、肺炎链球菌ATCC6305、金黄色葡萄菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC27853均生长良好。

3.亚硒酸盐增菌培养基

[用途]

沙门菌增菌培养。

[配法]

蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氢二钠4.5g，磷酸二氢钠5.5g，亚硒酸氢钠4g，蒸馏水1L。

先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。

其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH7.0~7.1（通过调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值）。

最后分装于15×150mm的试管内，每管10ml。

置水浴隔水煮沸10~15min，立即冷却，置4℃冰箱保存备用。

[用法]

取新鲜标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。

摇动后置35℃培养过夜。

如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。

然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、麦康凯琼脂平板等，进行培养。

[质量控制]

培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。

增菌灵敏度：

伤寒沙门菌1×10-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌1×10-7。

[保存]

4℃保存，1周内用完。

注：

⑴亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠均可使用，但以亚硒酸氢钠效果为好。

⑵磷酸盐缓冲对中，两者的用量比例与亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。

制备前应进行调试，其总量为10g/L。

⑶在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。

隔水煮沸时间亦不能超过规定时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物。

⑷培养基应呈淡黄色，有红色沉淀物出现时不可再用。

4.SS增菌液

[用途]

用于沙门、志贺菌的增菌。

[配法]

月示胨2g，蛋白胨8g，牛肉膏3.5g，酵母膏2g，葡萄糖2g，枸橼酸铁10g，硫代硫酸钠10g，亚硫酸钠0.7g，胆盐5.5g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0.1g，去氧胆酸钠（进口）1.5g，煌绿0.005g，蒸馏水1L。

将上述成分加热溶于水中，调pH至7.1，分装试管（15×150mm），每管5~7ml，隔水煮沸5min备用。

[用法]

取粪便标本1g直接种于增菌液内，35℃16~18h培养，取出转种于分离培养基即可。

[质量控制]

培养基应呈淡黄色或略呈淡绿色。

伤寒沙门菌ATCC50096、福氏志贺菌ATCC12022生长良好；大肠埃希菌ATCC25922生长抑制。

注：

⑴切勿高压，隔水煮沸时间不超过5min。

⑵煌绿用量应根据不同产品批号酌情增减。

5.碱性蛋白胨水

[用途]

霍乱弧菌增菌培养。

[配法]

蛋白胨20g，氯化钠5g，蒸馏水100ml。

将上述成分溶解于水中,校正pH至8.6，分装于试管8~10ml，经121℃灭菌15min备用。

[用法]

将待检标本接种到碱性胨水中，置35℃培养6~8h，霍乱弧菌呈均匀混浊生长，表面有菌膜出现。

取表面菌液一白金环移种到碱性琼脂、庆大琼脂或TCBS琼脂平板上。

必要时做第二次增菌。

[质量控制]

有条件的实验室可用标准菌株，一般临床实验室可用非01群弧菌，培养后生长良好者方可使用。

霍乱弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生长良好（6h）；大肠埃希菌ATCC25922不生长（6h）。

[保存]

置4℃冰箱，2周内用完。

注：

若在每升碱性胨水中加入1%亚碲酸钾溶液0.5~1.0ml，则成为亚碲酸钾碱性胨水，其增菌效果更为理想。

第四节分离培养基

一、革兰阳性杆菌分离培养基

1.罗-琴改良培养基

[用途]

用于结核分枝杆菌培养。

[配法]

磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，枸橼酸镁（或枸橼酸钠）0.6g，天门冬素3.6g，甘油12ml，蒸馏水600ml，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1L，2%孔雀绿水溶液20ml。

先将磷酸盐、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素及甘油，加热溶解于600ml蒸馏水中。

再添放马铃薯粉，边放边搅，并继续置沸水中加热30min，待冷却至60℃左右时，加入鸡卵液1L及孔雀绿溶液20ml，充分混匀后，用无菌操作分装于灭菌试管，每支5~6ml，塞紧橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器内制成斜面，经85℃1h间歇灭菌2次（或高压灭菌115℃20min），待凝固后经无菌试验，4℃冷藏备用。

[用法]

取晨咳痰或其它体液标本，经消化处理和离心沉淀的浓缩液0.1ml（约2滴）滴种于培养基的斜面上，尽量摇晃，置35℃5%~10%二氧化碳温箱内培养1~4周，观察结果。

凡在1周内发现生长的菌落，一般不可能是结核分枝杆菌；在2周后生长的菌落，奶油状，略呈黄色，粗糙突起，不透明，即取菌进行涂片染色镜检及鉴定。

[质量控制]

用结核分枝杆菌菌株作阳性培养试验。

[保存]

置4℃冰箱内2~4周有效。

注：

⑴本培养基由Lowenstein-Jenden设计的基础上改良。

（2）本培养基pH约为6.0左右，一般无须校正。

（3）间歇灭菌的温度不宜超过90℃。

2.血清斜面培养基（吕氏血清斜面）

[用途]

用于白喉棒状杆菌培养。

[配法]

1%葡萄糖肉汤（pH7.6）100ml，无菌动物血清（牛、羊、猪、兔）300ml。

将上述成分混合后，分装于试管内，每管约4~5ml。

斜插在血清凝固器内（或蒸笼）加热80~85℃30min，使血清凝固成斜面，冷却后放4℃冰箱内。

取出后采用间歇灭菌法，85℃灭菌30min，连续3天，经无菌试验证明无杂菌生长即可应用。

[用法]

将喉拭子直接接种于上述斜面上，置35℃培养16~24h。

白喉杆菌在上述培养基上，菌落呈圆形，表面光滑、完整，9g/L氯化钠溶液中易乳化，用阿尔培脱染色，两极异染颗粒明显。

注：

⑴所用血清不能含有防腐剂。

⑵该培养基不能高热灭菌，以防破坏其中营养成分。

⑶配制时所有器皿、棉塞等均应高压灭菌。

3.亚碲酸钾血琼脂

[用途]

用于分离白喉杆菌。

[配法]

蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉浸膏3g，葡萄糖2g，胱氨酸0.05g，1%亚碲酸钾45ml，脱纤维羊血100ml，琼脂2g，蒸馏水900ml。

先将蛋白胨、氯化钠、牛肉浸膏、葡萄糖和胱氨酸加水加热溶解，调pH至7.6，加入琼脂，高压灭菌115℃15min备用。

待冷至50℃左右，用无菌操作加入已灭菌的亚碲酸钾溶液及羊血，混匀倾注平板。

[用法]

将标本直接接种于亚碲酸钾平板上。

置35℃孵箱，经24~48h培养，观察结果。

白喉杆菌能使亚碲酸钾还原成金属碲而形成黑色和灰黑色的菌落。

二、革兰阴性杆菌分离培养基

（一）弧菌分离培养基

1.碱性琼脂

[用途]

用于霍乱弧菌分离培养。

[配法]

蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，脂20g，蒸馏水1L。

将前4种成分混合于水中，加热溶解，校正pH至8.4，分装后121℃灭菌15min，倾注平板。

[用法]

凡急性患有水样便标本做增菌培养的同时，应直接取标本接种到碱性琼脂平板或亚碲酸钾琼脂平板上。

置35℃培养12~16h，观察结果。

霍乱弧菌生长较快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑湿润。

在亚碲酸钾琼脂上菌落呈灰黑色。

[质量控制]

各实验室凡自配培养基或商品培养基,在使用前可用标准菌株生长对照，临床实验室可送防疫部门所设立的专门检验机构进行目的菌监测,质量可靠者方可使用。

EL-Tor弧菌生长良好；大肠埃希菌ATCC25922生长抑制。

[保存]

置4℃冰箱，1周内用完。

2.碱性胆盐琼脂

[用途]

用于霍乱弧菌分离培养。

[配法]

蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化纳5g~10g，琼脂20g，胆盐（牛、猪）2.5g，蒸馏水1L。

将上述成分称量混合于水中加热溶解，校正pH至8.4，分装121℃灭菌15min，倾注平板。

[用法]

取粪便标本或增菌培养物1接种环接种平板，置35℃温箱培养16~18h。

霍乱弧菌迅速生长，其它细菌生长较缓慢。

在16~18h后，霍乱弧菌的菌落，直径可达2mm左右，呈扁平，青灰色，半透明，光滑湿润，易挑起。

其它细菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。

[质量控制]

同碱性琼脂。

[保存]

置冰箱，1周内用完。

3.庆大霉素琼脂

[用途]

用于霍乱弧菌分离培养。

[配法]

蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，枸橼酸钠10g，无水亚硫酸钠3g，蔗糖（或白糖）10g，琼脂15~20g，庆大霉素、多粘菌素B“双抗液”2ml，蒸馏水1L。

将上述成分（除“双抗液”外）称量混合于水中，加热溶解，校正pH至8.4，分装灭菌121℃15min，待冷却至50℃后，每100ml内加“双抗液”0.2ml，另加5g/L亚碲酸钾溶液0.1ml，再倾注平板。

最后每毫升培养基内含有庆大霉素0.5U，多粘菌素B6U。

[用法]

将粪便标本或增菌培养物划线接种到该平板上，置35℃培养16~18h。

由于该培养基抑制性强，其它非弧菌科细菌被抑制，而霍乱弧菌生长迅速，16h菌落可达2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑湿润。

若培养时间长，菌落略黄色、隆起，中心厚而不透明。

[质量控制]

霍乱弧菌（小川、稻叶）生长良好，培养18~24h菌落直径2.5~3.0mm；大肠埃希菌和变形杆菌生长抑制。

[保存]

置4℃冰箱内，1周内用完。

注：

⑴该培养基国内有商品出售，多数产品已加入庆大霉素，使用时，应详阅说明书。

⑵“双抗液”配制：

98ml灭菌蒸馏水中加庆大霉素（25000U/ml）1ml,多粘菌B或抗敌E（300000U/ml）1ml。

4℃冰箱保存，1月用完。

4.四号琼脂

[用途]

用于霍乱弧菌分离培养。

[配法]

蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉浸膏3g，亚硫酸钠（无水）3g，枸橼酸钠10g，猪胆汁粉5g，十二烷硫酸钠20g，利凡诺（雷佛奴尔）3g，琼脂粉12g，庆大霉素亚碲酸钾混合液1ml，蒸馏水1L。

将前8种成分放入玻璃或搪瓷容器内（严禁用铝制容器等金属容器），加入蒸馏水，加热溶解混合后，调整至pH8.0,然后按1.2%加入琼脂，煮沸至琼脂溶化后，冷至60℃左右，按每100ml琼脂加入庆大霉素亚碲酸钾混合液（1ml40000U庆大霉素加79ml蒸馏水混合后，加入0.8g亚碲酸钾溶解混合即成，每毫升含500U庆大霉素和10g/L亚碲酸钾）0.1ml，摇匀，倾注平板。

[用法]

取待检标本划线接种平板，置35℃培养过夜。

8h后即可初步观察结果。

24h培养后，霍乱弧菌呈中心黑色、较大而扁平的菌落。

[质量控制]

配成的培养基呈亮黄色透明；EL-Tor弧菌稻叶型生长良好；EL-Tor弧菌小川型生长良好；大肠埃希菌ATCC25922抑制生长。

注：

⑴庆大和亚碲酸钾混合液应新鲜配制并置冰箱保存。

⑵雷佛奴尔应避光保存，而且每批均应预试后方可使用。

成品培养基应避光保存。

（二）肠杆菌分离培养基

1.中国蓝琼脂

[用途]

分离肠道菌的弱选择性培养基。

[配法]

肉膏汤琼脂（pH7.4）1L，10g/L中国蓝溶液（灭菌）10ml，乳糖10g，10g/L蔷薇红酸乙醇溶液10ml。

取乳糖10g置于已灭菌的肉膏汤琼脂瓶内，加热溶解琼脂并混匀。

待冷却至50℃左右，加入中国蓝、蔷薇红酸乙醇溶液混匀，立即倾注平板，凝固后备用。

[用法]

将标本接种平板，置35℃18～24h。

分解乳糖产酸的细菌，其菌落呈蓝色；不分解乳糖的细菌，菌落为淡红色的透明菌落。

[质量控制]

大肠埃希菌ATCC25922菌落呈蓝色；痢疾志贺菌Ⅰ型ATCC13313和鼠伤寒沙门菌ATCC13311菌落呈淡红色。

[保存]

4℃冰箱保存，1周内用完。

注：

（1）中国蓝溶液需煮沸或115℃灭菌15min后应用。

蔷薇红酸乙醇溶液无需灭菌，但加热时应避开火焰。

（2）蔷薇红酸能抑制革兰阳性细菌生长，但对大肠埃希菌没有抑制作用，标本接种量不宜太多。

（3）此培养基pH7.4，应呈淡红色。

若过碱呈鲜红色，过酸则呈蓝色，均不适用。

2.木糖、赖氨酸、去氧胆酸盐（XLD）培养基

[用途]

为肠道菌选择性培养基。

[配法]

酵母浸膏3g,L-赖氨酸5g,氯化钠5g,D-木糖3.75g,乳糖7.5g,蔗糖7.5g,去氧胆酸钠2.5g,硫代硫酸钠6.8g,枸橼酸铁铵0.8g,琼脂13.5g,1%酚红溶液8ml,蒸馏水1L。

将上述成分（酚红除外）混合，加热溶解，校正pH至7.2,再加入酚红溶液混匀。

121℃高压灭菌15min，倾注平板备用。

[用法