第11章生物技术Word格式文档下载.docx

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培养基可分为两类。

一是基本培养基，包括大量元素和微量元素（无机盐类）、维生素、氨基酸、糖和水等。

迄今为止，基本培养基已有几百种，但较常用的仅一二十种，如MS、改良MS、White、Nitsch、N6、B5等；

二是完全培养基，即在基本培养基的基础上，添加一些植物生长调节物质（BA、ZT、KT、2，4-D、NAA、IAA、IBA、GA3等）以及其它的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽膏等。

一般分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物质（除蔗糖）、植物生长调节剂等不同浓缩母液。

配制培养基时分别计算和量取各种母液，添加蔗糖、琼脂和蒸馏水，混合并加热融化琼脂，煮沸后定容，调节pH值，分装，灭菌。

2．无菌培养体系的建立

尽管所有的植物细胞都具有重新形成植株的能力，但不是任何细胞都同样能表现出来，所以要选择那些在培养时容易进行再分化产生植株的部位作试验材料。

在同一植物不同部位的组织、器官中，其形态发生的能力，因植株年龄、采集季节、外植体大小及着生部位及生理状态而有很大不同，因此，选择外植体对离体快速繁殖是十分重要的。

一般选择生长健壮优良植株，在春季取幼年树体较基部的材料为好。

首先清理材料，将需要的部分用软毛刷、毛笔等在流水下刷洗干净，也可用毛笔沾少量洗衣粉或肥皂水刷洗，把材料切割到适当大小，用流水冲洗几分钟。

然后用灭菌剂（如70%酒精、10％的双氧水、84消毒液、0.1%的升汞）进行材料的表面灭菌。

在超净工作台上将外植体置入一个无菌的三角瓶或广口瓶内，用70%酒精处理较短时间，至少用无菌水冲洗一次；

用无菌的镊子将外植体移入另一无菌的瓶内；

倒入灭菌液处理一定时间，加入表面活性剂（如吐温－80）数滴，轻轻摇动灭菌器皿；

到预定时间后倒出灭菌溶液，立即用无菌水冲洗3－5次，即可接种。

有些外植体在启动培养中常常会发生褐化现象（browning）。

褐化是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织向培养基释放褐色物质，使培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。

在培养初期，外植体的褐化是诱导脱分化及再生的重大障碍。

产生褐化的因素较复杂，随植物种类、基因型、外植体年龄、着生部位及生理状态而不同。

选择适当的外植体并建立最佳的培养条件是克服褐化的主要手段。

改善培养条件，连续转接，勤换新鲜培养基，利用液体培养，在培养基中加入活性炭、抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养可抑制褐化。

3．外植体的分化及芽的增殖和继代培养

在启动培养阶段所获得的芽、苗和胚状体等数量不多，还需要增殖培养。

试管苗增殖是快速繁殖的重要环节，是提供大量的遗传性稳定种苗的手段，增殖过程受到外植体的部位与生理状态、培养基种类、外源激素配比与浓度、温度、湿度、光照与通气状况等的影响。

增殖有下列4种途径：

（1）无菌短枝型（minicuttingtype）：

即无菌短枝扦插，又称节培法或微型扦插法。

将微小短枝扦插在试管的培养基上，促使其基部分化出根而成为一完整植株。

该方法一次成苗，遗传性状稳定。

（2）丛生芽增殖型（organtype）：

又叫丛生芽增殖型，在适宜的培养基上不断诱导腋芽，从而形成丛生芽，然后转入生根培养基，诱导生根成苗。

其遗传性状稳定，繁殖速度快，是目前快速繁殖中采用的主要方法。

（3）器官发生型（organogenesistype）：

由植物器官诱导愈伤组织，再诱导不定芽。

切割不定芽诱导发根形成植株，也可以直接从离体器官和组织上诱导不定芽产生小植株。

这种方法可能会发生不良变异，用于良种繁殖时应注意。

（4）胚状体发生型（embryoidtype）：

从植物器官、细胞或愈伤组织通过胚状体途径，经原胚期、心形胚期、鱼雷形胚期及子叶期发育成植株。

胚状体发生的特点是数量多，结构完整，易成苗，繁殖速度快，受到国内外普遍重视。

4．增殖培养应注意的问题

能否保持试管苗的继代和增殖培养能力，是获得大量试管苗并用于生产的关键问题。

一般认为分化再生能力衰退是由多种原因引起，在培养过程中，逐渐消耗了母体中原有的与器官形成有关的特殊物质，一些组织经长期继代培养后发生了一些变化。

不同植物保持再生的能力有很大差异。

植物不同种类、同种不同品种、同一植株不同器官和部位，继代增殖能力不同。

一般是被子植物大于裸子植物；

幼年材料大于老年材料；

刚分离组织大于已继代的组织；

芽大于胚状体并大于愈伤组织。

培养基及培养条件适当与否对继代培养影响颇大，所以常改变培养基和培养条件来保持继代培养。

有研究表明，即使原来培养过程中丧失分化能力的一些组织，加入腺嘌呤、酵母汁和酪蛋白等物质后，器官分化能力又可得到一定的恢复。

在植物组织与细胞培养过程中，细胞、组织和再生植株以及后代中会出现各种变异，这种变异具有普遍性。

影响遗传稳定性的因素有培养材料的基因型、试管苗继代培养次数和离体器官发生方式等。

应尽量采用不易发生体细胞变异的增殖途径，缩短继代时间，限制继代次数，取幼年的外植体材料，采用适当的生长调节物质种类和较低的浓度，减少或不使用在培养基中容易引起诱变的化学物质，定期检测，及时剔除异常苗，多年跟踪检测，调查再生植株开花结实特性，以确定其生物学性状和经济性状是否稳定。

玻璃化（vitrification）现象是茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存中的严重障碍。

所谓玻璃化是试管苗叶、嫩梢呈水晶状透明或半透明，整株矮小肿胀、失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎。

玻璃苗分化能力下降，生根困难，移栽难以成活，有时高达50%以上，危害严重。

细胞分裂素浓度和培养温度与玻璃化呈正相关，琼脂和蔗糖浓度与玻璃化苗的比例呈负相关。

液体培养和密闭的封瓶口材料也是导致玻璃化的主要原因。

增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量，增加自然光照强度和时间，可在一定程度上减轻玻璃化现象。

5．完整植株的获得

外植体通过大量增殖后，多数情况下形成无根的芽苗。

绝大部分离体繁殖产生的芽、嫩梢需要生根培养才能得到完整的植株。

生根难易与母株的年龄和所处的生理状态有关，同时与取材季节和外植体所处的环境条件有关。

对于难生根的植物不仅要从培养条件中去找原因，同时也应从取材上考虑。

一般为木本植物比草本植物，成年树比幼年树，乔木比灌木难生根。

植物生长调节物质对不定根形成起着决定性作用，生长素促进生根，而赤霉素、细胞分裂素、乙烯通常不利于发根。

降低培养基的无机盐浓度，有利于根的分化。

生根需要适量的磷和钾；

Ca2+多数情况下有利于根的形成和生长；

硼（B）、铁（Fe）等微量元素对生根有利。

生根培养时通常使用低浓度的蔗糖。

由于植物根系形成与生长具有向暗性的特点，添加活性炭也可促进试管苗生根。

6．试管苗炼苗和出瓶移栽

试管苗长期在弱光、恒温、高湿的特殊环境下生长，适应性较差，在移植之前必须进行锻炼，增强小苗抗性以提高移苗成活率。

目前较为成功的炼苗方法是采用“闭口”阳光下炼苗，可在较长的炼苗时间内保持试管苗不污染，同时在炼苗中要提供适宜的温度和阳光强度。

试管苗移栽时从瓶中取出小苗，清洗干净，迅速栽在已经过消毒处理的基质中，喷淋透水，放在干净、排水良好的温室或塑料保温棚中，保持较高的空气湿度，20d左右可定植到大田。

基质以疏松、排水性和透气性良好者为宜，如珍珠岩、蛭石、河沙、过筛炉灰渣、椰糠等。

11.2体细胞胚胎发生和人工种子

11.2.1体细胞胚胎发生　

体细胞胚胎发生（somaticembryogenesis）是指不通过配子受精，但经胚胎发育形成胚的类似物，即胚状体（embryoid），再生长发育成完整植株的过程。

在20世纪50年代末，Steward和Reinert几乎同时在胡萝卜根组织培养中观察到了体细胞胚的形成。

林木的体细胞胚胎发生的研究始于70年代后期，到90年代初得到迅速发展。

目前，在已成功诱导出体细胞胚胎的100多种植物中，有40多种木本植物。

在落叶松、云杉、松、黄杉和北美红杉等属针叶树种中，至少有20个种成功地研制了体细胞胚；

在杨、柳、鹅掌楸等阔叶树种中，有20多个种观察到体细胞胚胎发生或获得了再生植株。

其中，火炬松、挪威云杉、花旗松和辐射松等的体细胞胚诱导和植株再生已应用于生产实践。

如新西兰一家公司已形成了年产200万株辐射松体细胞胚再生植株的能力，美国ArborGen公司在火炬松体细胞胚胎发生技术研究有所突破。

新西兰林业研究所辐射松良种繁育过程中，将种子园、采穗圃常规繁育技术与基因工程、组织培养和体细胞胚胎发生技术相结合，加速了辐射松良种无性系繁殖与推广的进程（图11－1）。

我国已在云杉属、火炬松、马尾松、黑穗醋栗、桉树、桃树、枫香、鹅掌楸、杉木和马尾松等树种中开展了相关研究。

图11－1新西兰林业研究所辐射松常规繁殖与体细胞胚胎发生技术相结合的良种繁育过程

体细胞胚胎发生有三个途径：

一是从外植体上直接发生；

二是在固定培养基上，外植体先形成愈伤组织，再分化产生细胞胚；

三是悬浮培养中，先产生胚性细胞团，再形成体细胞胚。

体细胞胚大多首先起源于一个胚性细胞，胚性细胞经过首次分裂形成二细胞原胚，以后经过细胞分裂形成多细胞原胚。

原胚形成后，细胞分裂活跃，很快形成球形胚结构，进而完成胚胎繁育。

在植物体细胞胚的诱导过程中，影响诱导体细胞脱分化、再分化和发育过程的因素很多。

选择适当的外植体是成功诱导体细胞胚的关键。

目前松柏类植物几乎均以合子胚为外植体。

新鲜细胞系诱导体细胞胚的能力较强，老化细胞形成胚的能力明显下降。

2，4－D是诱导体细胞胚胎发生的必需条件，它是胚性感受态表达的重要因子。

高浓度的2，4－D、BA和KT组合对快速诱导胚发生愈伤组织有利，而要形成后期原胚则必须将激素浓度降低。

此外，也可采用NAA、BA和KT的组合，特别是在增殖培养阶段，用NAA代替2，4－D更有利于体细胞胚的发生。

长时间培养在2，4－D的培养基上易造成体细胞胚成熟能力的丧失。

ABA能抑制不正常胚的发育，促进体细胞胚的正常化，提高体细胞胚的发生频率。

胚细胞分化早期与多胺的生物合成关系较密切，多胺抑制剂可抑制球形胚的形成，但不影响愈伤组织生长，在球形胚后期不再影响胚的发育，可以提高体细胞胚的质量。

此外，影响体细胞胚胎发生的因素还包括培养基、碳源、渗透压、活性炭、光照、温度、微量元素、氮源成分、琼脂、蔗糖浓度以及pH值等。

11.2.2人工种子

人工种子即人为制造的种子（artificialseeds），是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其它成分的人工胶囊，又称合成种子（syntheticseeds）。

这一技术是20世纪80年代在植物离体繁殖的基础上发展起来的，人工种子的产生，减少试管移苗、苗木包装运输等生产环节。

人工种子由三部分构成。

①胚状体：

是由组织培养产生的有胚芽、胚根，类似天然种子胚的双极性结构，具有萌发长成植株的能力；

②人工胚乳：

保证胚状体生长发育需要的营养物质，一般以诱导胚状体的培养基为主要成分，或外加一定量的植物激素、抗生素、农药以及除草剂等；

③人工种皮：

包裹在人工种子最外层的胶质薄膜，这层薄膜既要保证内外气体交换畅通，又要防止水分及各类营养物质的外渗，且具备一定的机械抗压力。

人工种子研制大致包括:

外植体的选择和消毒、愈伤组织的诱导、体细胞胚的诱导、体细胞胚的同步化、体细胞胚的分选、体细胞胚的包裹（人工胚乳）、包裹外膜、以及发芽成苗和体细胞胚变异等内容。

1．人工胚乳及人工种皮：

包裹胚的营养基质称为人工胚乳，对营养需求因种而异，但与细胞、组织培养的培养基大体相仿，通常还要配加一定量的天然大分子碳水化合物（淀粉、糖类）以减少营养物泄漏。

常用人工胚乳有：

MS（或SH、White）培养基＋马铃薯淀粉水解物（1.5%）；

1/2SH培养基＋麦芽糖（l.5%）等。

也可根据需要在上述培养基添加适量激素、抗生素、农药、除草剂等。

人工种皮是指胚状体及其类似物以外部分的统称。

聚氯乙烯（商品名PolyoxWSR－N750）适用于包制种子。

它可直接溶于MS培养基中，干燥后可固化，再遇水又会溶解。

有多种水溶性胶均适用，其中以海藻酸钠、明胶、树胶、Gelrite为最佳。

人工种子胞衣制作的方法有：

干燥法、离子交换法和冷却法。

以离子交换法较实用、方便。

此法又以海藻酸钠最为常用，其价格低廉，使用方便，对胚状体基本无毒害作用，具有一定的保水、透气性能，经CaCl2离子交换后，机械性能较好。

为了克服人工种子易于沾粘和变干的缺点，美国杜邦公司以一种称为Elvax4260的涂料对人工种子进行表面处理，效果较好。

此外以5％CaCO3或滑石粉抗粘，也有一定效果。

2．人工种子贮存：

由于农林业生产的季节性限制，人工种子需要贮存一定时间，但人工种子含水量大，容易萌发，种球易失水干缩，贮存难度较大，目前技术尚不成熟。

一般将人工种子保存在温度为4～7℃、相对湿度＜67％条件下。

3．人工种子的萌发与转换：

转换（transformation）指人工种子在一定条件下，萌发、生长、形成完整植株的过程。

转换的方法可分为无菌条件下的转换和土壤条件下的转换。

无菌条件下的转换也称离体条件下的转换。

是将新制成的人工种子播种在1/4MS培养基，附加1.5%麦芽糖，8g/L的琼脂中，培养后统计人工种子形成完整植株的数目，即人工种子的转换率。

转换率的高低主要取决于：

①对提高体细胞胚质量的培养基成分的研究；

②改进转换条件的研究。

如麦芽糖代替蔗糖，有利于体细胞胚的萌发和转换。

土壤条件下的转换也称活体条件下的转换。

人工种子真正目的是直接播种于土壤，即在活体条件下，使转换成功。

试验采用方法有：

①无土培养试验。

目前以蛭石和珍珠岩试验较多，附加低浓度无机盐，0.75%麦芽糖有利于转换。

②土壤试验。

人工种子的土壤转换试验报道较少。

在无机盐转换中没有硝酸钾、硫酸镁、氯化钙时就不会发生转换，缺乏磷酸铵，转换率下降。

显然这些无机盐成分作为人工种子营养是不可缺少的。

0.75%（v/w）麦芽糖有利于提高转换率。

因而推测，碳源在人工种子转换中也是限制因子。

为此，人工种子必须贮藏一定的养分或提供外源营养物质。

与体细胞胚胎发生相比，人工种子的研究进展较慢，其主要原因是体细胞胚胎形成后可以直接诱导再生成苗，而不一定要走人工种子的技术路线，此外，制备人工种子的包裹材料及附加成分成尚不成熟，且转换率低。

11.3遗传标记技术在林木遗传育种中的应用

11.3.1遗传标记的概念

遗传标记（geneticmarker）是指可以稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多态性形式。

在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。

在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异或者是DNA序列的差异。

遗传标记主要有形态标记（morphologicalmarkers）、细胞学标记（cytologicalmarkers）、同工酶标记（isozymemarkers）和分子标记（molecularmarkers）。

理想的分子标记必须达到以下几个要求：

（1）多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；

（2）表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息；

（3）在基因组中大量存在且分布均匀；

（4）选择中性，即无基因多效性，不影响目标性状的表达；

（5）检测手段简单、快速，容易观测记载，成本低；

（5）实验重复性好。

1.形态标记

形态标记即植物的外部特征和特性。

典型的形态标记用肉眼即可识别和观察。

广义的形态标记还包括借助简单测试即可识别的某些形状如生理特性、生殖特性、抗病虫性等。

自然界的生物存在着许多非常明显的形态标记，如株高、果形、果色、花形、花色、种子的形态及色泽等等，这些一直是人类识别新品种的重要标记。

形态标记的特点是简单直观，通过细心观察从表型上就可将不同个体区分开来，长期以来用于林木遗传种质资源鉴定及品种选育。

但形态鉴定需额外占用土地，标记位点数少，周期长，花费大，易受环境、发育阶段、生理因素和人为因素的影响，准确性差，容易出现漏选、错选，而且需要有丰富的实践经验和知识，一般用于对大量材料进行初步筛选。

2．细胞学标记

细胞学标记能明确显示遗传多态性的细胞学特征。

染色体的结构和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。

染色体结构特征包括染色体的核型和带型。

核型特征是指染色体的长度、形态、着丝粒的位置和随体有无等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异。

带型特征是指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。

染色体数量特征是指细胞中染色体数目的多少。

染色体数量上的遗传多态性包括整倍性和非整倍性的变异，前者如多倍体，后者如缺体、单体、三体、双体等非整倍体。

用具有染色体数目和结构变异的材料与染色体正常的材料进行杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。

因此染色体结构和数目的特征可以作为一种遗传标记，用来区分不同物种和同一物种的不同种类。

但是细胞学鉴定工作量较大，并不能很好地消除环境对性状的影响，而且基因的显隐性、上位性及连锁等会影响分析结果，再加上标记数目有限，对于染色体数目较多或染色体较小的植物难以进行理想的鉴定分析。

3．生化标记

生化标记是以基因表达的直接产物——蛋白质为特征的遗传标记，它包括贮藏蛋白标记和同工酶标记。

生化标记具有结果稳定可靠，不受环境因素影响，呈共显性，在分离世代中能反映各单株的基因型，检测相对简单快速，在种子和幼苗期就可以鉴定，且所需材料少，费用不高等优点。

近年来，利用生化标记在品种鉴定及变异体鉴定等方面开展了大量工作，其中应用较多的是同工酶标记。

同工酶（isozyme）一词是Markert及Miller于1957年提出的，指来源相同，催化同一化学反应，而蛋白质分子结构、组成又不相同的一类酶。

同工酶作为遗传标记有以下特点：

首先它比较稳定，不受环境因素的影响；

其次，它在种子和幼苗期就可以鉴定，且所需试材少；

再次，同工酶为共显性，即来自双亲的一对等位基因可以在杂交后代中同时检测出来。

不象显隐性状那样，杂交后代隐性性状被显性性状所掩盖。

但是，在植物的群体研究中，仅有10～20种同工酶表现出位点的多态性。

因而同工酶标记也有其局限性，不能成为最理想的遗传标记。

4．DNA分子标记

生物体之间的差异本质上是DNA水平上的差异。

随着分子生物学的发展，遗传标记的概念发展为在核酸分子水平上具有相对差异的等位区域（也称等位基因）。

因它们广泛存在于生物DNA，故称之为DNA分子标记。

DNA的分子标记是以DNA分子多态性为基础的遗传标记。

70年代初，分子标记开始在植物遗传育种研究中得到应用，随后尤其是近10年来，在人类基因组计划的推动下，分子标记的研究和应用得到了迅速发展。

与上述三种遗传标记相比，分子标记具有以下优越性：

①1直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；

数量极多，遍及整个基因组；

多态性高；

表现为“中性”；

有许多分子标记表现为共显性。

DNA分子标记检测技术大致可分为三类：

第一类是以电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术，其代表性技术有限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）；

第二类是以DNA聚合链式反应（polymerasechainreaction，PCR）技术为核心的分子标记技术，其代表性技术有随机扩增多态性DNA（RandomlyamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）标记、扩增片段长度多态性（amplifiedfragmentlengthploymorphism，AFLP）和简单重复序列（simplesequencerepeat,SSR）等；

第三类是以DNA序列为核心的分子标记技术，其代表性技术为表达序列标记（expressedsequencestags,EST）和单核苷酸多态性（singlenudeotidepolymorphism,SNP）。

现已形成了许多分子标记系统，常用的分子标记技术有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等4种。

经过十几年发展，标记的种类日渐增多，已被广泛应用到遗传多样性分析、遗传作图及基因标记等多方面。

11.3.2分子标记技术

1．RFLP标记

RFLP的产生主要是由于在植物基因组DNA序列上的变化，造成限制性核酸内切酶（restrictionenzymes）酶切位点的增加或丧失以及内切酶位点之间DNA片段的插入、缺失或重复等变化。

1974年Grodzicker等人开发了DNA水平上的分子标记——RFLP，它是最早发展的分子标记。

1980年，人类遗传学家Bostein首先提出了用RFLP作为构建遗传连锁图的设想。

1987年Donis-kellen等报道了第一张人类RFLP遗传图谱，开创了分子标记应用的新纪元。

限制性内切酶能识别DNA顺序上由特定碱基组成的识别位点（即限制性位点），并切开DNA。

通常DNA上存在大量的限制性内切酶酶切位点，因此限制性内切酶能将很长的DNA分子降解成许多长短不一的小片段，片段的数目和长度反映了DNA上限制性酶切位点的分布情况。

通过琼脂糖凝胶电泳将这些片断按大小分离开来，然后将他们按原来的顺序和位置印记