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柠檬酸
柠檬酸发酵讲义
第一节柠檬酸发酵简史
柠檬酸又名枸橼酸，英文名citricacid，它来自拉丁名citrus，原义是存在于柠檬等水果中的一种有机酸。
柠檬酸学名为3—羟基—3—羧基戊二酸。
柠檬酸是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑枯、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤其以未成熟者合酸量铰多。
植物叶子中（如烟叶、棉叶、菜豆叶等）也合有柠檬酸。
柠檬酸在植物体内常与苹果酸、草酸及酒石酸等共同存在。
在动物中，柠檬酸存在于骨镕、肌肉、血液、乳计、唾液、汗和尿中，或者以游离状态或金属盐类的形式存在。
早在1784年，瑞典化学家Scheel就首次从柠檬汁中提取出了柠檬酸，并制成了结晶。
后来，德国科学家在1891年发现了微生物产生柠檬酸的能力，他指出，“柠檬酸是青霉两极毛霉属霉菌的糖代谢产物之一”。
但直到本世纪初，这种有机酸仍然绝大部分是从柠檬汁中提取的。
主要产地以意大利的西西里岛最为著名。
其次，美国加尼福尼亚、夏威夷群岛以及西印度群岛的产量也较高。
1891年，Wehmef从腐败的柑桔上分离出一种丝状菌，它能使含CaCO3的糖液变酸，从酸液中可以分离出柠檬酸和草酸。
因此，他将该菌命名为“柠酸檬霉菌”，即桔青霉。
1897年，他又发现淡黄青霉与梨形毛霉也有柠檬酸产地能力。
1913年，zahorsk5首先利用黑
曲霉生产柠檬酸。
1916年，ThopJ和curr5e对曲霉属的许多菌株进行过普查，发现很多菌种能产柠檬酸。
经过curr5e（1917年）的深入研究，初步奠定了发酵法生产柠檬酸的科学基础，1919年，比利时一家工厂成功地进行了浅盘发酵法的工业生产。
1923年，美国ch公司也开始用浅盘发酵法大规模生产柠檬酸。
利用糖蜜生产柠檬酸以比利时一家糖厂历史最早，规模最大，技术也校先进。
直到1950年，世界各国一直采用浅盘发酵法生产柠檬酸。
1952年，美国Mzes实验室公司首先采用深层发酵法大规模生产柠檬酸以后，深层发酵法逐渐流行起来。
近年来，世界很多柠檬酸生产国家和地区都投入了大量人力进行研究工作。
柠檬酸的世界总产量也急剧上升。
到1978年，已有35个以上的国家生产柠檬酸，总产量达40万吨，设备地产能力超过55万吨。
第二节柠檬酸的性质
柠檬酸是一种三元羧酸，结构式为
它的学名为3—羟基—3—羧基戊二酸，可以由本章介绍的微生物发酵法生产，也可以由化学合成法生产。
化学合成法的原料有丙酮、二氯丙酮或乙烯酮（丙酮热解产物）。
化学合成柠檬酸的工艺复杂，经济上竞争不过微生物发酵法。
所以现在世界上柠檬酸工业生产都采用发酵法。
发酵法的柠檬酸生产菌有曲霉、青霉和酵母。
酵母发酵能生成大量的副产物异柠檬酸，它是柠檬酸的异构体：
它的羟基在2位C上，并且含有2个不对称C原子（2位和3位）。
一、柠檬酸的物理性质
柠檬酸为无色半透明晶体，或白色颗粒，或白色结晶性粉末，无臭．虽有强烈酸味但令人愉快，稍有一点后涩味。
它在温暖空气中逐渐风化，在潮湿空气中微有潮解性。
1．结晶形态与性质
柠檬酸结晶形态因结晶条件不同而不同，有无水柠檬酸C6H8O7也有含结晶水的柠檬酸2C6H8O7•H2O或C6H8O7•H2O或C6H8O7•2H2O。
商品柠檬酸主要是无水柠檬酸和一水柠檬酸。
它们的晶体形态如图1—1所示。
一水柠檬酸是由低温（低于36．6℃）水溶液中结晶析出，经分离干燥后的产品，分子量210.14，含结晶水量为8.58％，熔点70-75℃，密度
=1.542。
20℃下，l00g水中可溶解无水物147g。
放置在干燥空气中时，处于晶体晶格中的结晶水逸出而风化。
一水柠檬酸晶体缓慢加热时，先在50~70℃开始失水，70~75℃晶体软化，开始熔化。
加热到130℃时完全丧失结晶水，最后在135~152℃范围内完全熔化。
一水柠檬酸剧烈加热时，在100℃熔化，结块变为无水柠檬酸，继续加热很精确地在153℃熔化。
二、柠檬酸的化学性质
1、酸性与电离
柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离。
2．加热分解作用
柠檬酸加热可以分解成多种产物，各种分解产物之间的关系以及转化过程见图1—3。
3．与酸反应
柠檬酸与发烟硫酸混合。
在常温下即产生乌头酸，稍稍加热能生成3—酮戊二酸。
柠檬酸与浓硫酸混合，温度在40℃产生丙酮、CO2、CO等，加热至150℃时生成乌头酸酐；加热至200℃时生成双康酸（diconicacid）C8H10O6及CO2、CO等。
当硫酸浓度低于94％，低温时生成3—酮戊二酸，当硫酸浓度低于60％，加热时生成鸟头酸。
无水柠檬酸与一份硝酸及二份硫酸作用生成硝酸酯C3H5（ONO2）（COOH）3，它不溶于醚，与钡及铅化合生成不溶性盐类。
4．与碱反应
柠檬酸在碱液中煮沸是得到丙烯酸。
柠檬酸的常规酸碱中和反应可以生成各种盐类。
5．与甘油作用
柠檬酸与甘油混合干馏得到丙酮、CO2、CO和甘油内醚丙酮酸酯。
柠檬酸与甘油混合共热至100℃，生成柠檬酸油脂，这是—种玻璃状物质。
如果甘油用量铰，加热至170℃时得到香茅二甘油（C12H18O11）。
6．其他反应
柠檬酸溶于氯化钠浓溶液中与氯作用生成六氯丙酮及氯仿。
三、柠檬酸钙盐的性质
在柠檬酸的工业生产中发酵后一般先制成钙盐，再用硫酸酸解为柠檬酸。
其目的是利用柠檬酸钙的沉淀性质而与其他有机酸或杂质分离开。
柠檬酸钙盐有3种类型：
柠檬酸一钙CaH4（C6H5O7）2
柠檬酸氢钙：
CaH（C6H5O7）·3H2O
柠檬酸三钙Ca3（C6H5O7）2·4H2O
工业生产中的柠檬酸钙系指柠檬酸三钙。
它是很细小的白色晶体或白色粉末，通常合有4个结晶水，分子量571.31。
四、柠檬酸其他盐类的性质
柠檬酸盐类是化工产品中一个很庞大的系列，在医药、塑料、食品和机械制造工业中部占有重要的地位。
现介绍部分盐类及共性质。
1．铵盐[（NH4）3C6H5O7，（NH4）2HC6H5O7]
白色粉末。
柠檬酸三铵是化学分析试剂之一。
柠檬酸氢二铵具有除锈、除垢作用，可用于工业中进行除锈和清洗操作。
它也是生产复写纸的原料之一。
2．铁盐[FeC6H5O7·3H2O]
红色透明鳞片状结晶，能缓缓溶于水及醇中。
柠檬酸根在体内易于被吸收，因此铁盐是很好的铁营养药，用于治疗缺铁性贫血。
在蓝色晒图纸制造中也用到这种铁盐。
3．铁铵复盐[Fem（NH4）n（C6H5O7）m+n]
铁铵复盐可以由硫酸亚铁、氨水及柠檬酸制备。
根据工艺不同，铁和铵的比例可以不同。
不同的复盐颜色也不同（见表l—14），呈红褐色透明鳞片或黄褐色粉末等。
无臭，味咸，微带铁味。
在水中极易溶解，在空气中有潮解性，遇光易发生变化。
加强热时分解，留下氧化铁残渣。
加稀盐酸溶解后，加入亚铁氢化钾液即发生深蓝色沉淀。
上述性质可鉴别此盐真伪。
这种复盐21~22％的水溶液治疗缺铁性贫血及出血后的贫血特别有效。
4．钾盐[K3C6H5O7·H2O]
白色颗粒或结晶性粉末，无臭，味咸凉，密度1.98g／cm3，本品1：
20水溶液加入酒石酸氢钠溶液生成结晶性沉淀，该沉淀在氨试液、NaOH液或Na2CO3液中均溶解，可以用作定性。
本品在医药上用作利尿剂及发汗剂。
5．钠盐[Na3C6H5O7·2H2O，Na3C6H5O7·5
H2O]
钠盐在白金丝圈上于无色火焰上灼烧，火焰呈黄色钠光，可以用作定性。
柠檬酸钠是钠离子戴体。
由于柠檬酸根可以很快在机体内参与代谢，因此钠盐可以增加体内的碱储备。
在医药中它可作为退热剂、尿酸度矫正剂。
它的重要性之一是抗凝血性，可以用于保存血液、血浆，所以又称为抗凝血紊。
在食品工业中，它与柠檬酸共同用于果酱、果冻、蜜饯、软糖、冰棋淋等生产中作为风味剂和pH缓冲剂，干酪制造中用作稳定剂和乳化剂等。
6．镁盐[Mg3（C6H5O7）2·14H2O]
白色鳞片状结晶，能溶于水及酸，药用为轻泻剂。
与小苏打，柠檬酸糖浆混合使用具有起泡性。
7．铋盐[BiC6H5O7]
白色结晶粉末，不溶于水，可溶于氨水、柠檬酸碱金属岩溶液中。
医药上用作健胃剂和收敛剂。
8．镍盐[Ni3（C6H5O7）2·8H2O、Ni3（C6H5O7）2·14H2O]
绿色晶体或粉末，有吸湿性，能溶于水、在电镀工业上应用广泛。
9．锰盐[MnHC6H5O7]
白色粉末，有柠檬酸存在时能溶于水。
医药上是锰营养药及收敛剂。
10．铜盐[Cu2H4C6H5O7·2
H2O]
铜盐在工业上用作分析试剂。
医药上用作消毒剂，特别应用于眼病治疗，5~10％柠檬酸铜软膏用以治疗结膜炎、沙眼等。
5~10％的散剂用于治疗溃疡及淋病等。
11．银盐[Ag3C6H5O7]
极沉重之白色结晶性粉末，含有62％以上银，无气味，几乎不解于水。
易溶于稀硝酸和氨水，稍有感光性，遇有机物即行分解。
它是一种无刺激性的强烈防腐剂，用于外科消毒防腐，治疗粘膜炎、尿道炎、淋病、结膜炎、膀胱炎等。
12．锌盐[Zn2（C6H5O7）3：
·2H2O]
白色粉末，无气味，能溶于稀无机酸及氢氧化碱，微溶于水。
本品为化工原料，用于生产锌化合物。
13，钡盐[Ba3（C6H5O7）2·7H2O]
白色扮末，易溶于稀盐酸和硝酸，水中微溶，热到150℃全部失水。
用作化工原料，制造钡化合物，作为乳胶等涂料的稳定剂。
柠檬酸碱金属盐易溶于水，而其他金属盐（尤其是中性盐）大多难溶于水。
柠檬酸钙、银、锌、铅盐在热水中的溶解度比在冷水中低。
但钡盐的溶解度随温度上升而增大。
第三节柠檬酸发酵机理
黑曲霉利用糖类、乙醇和醋酸等发酵产生柠檬酸是一个非常复杂的生理生化过程。
早在上世纪末，人们就开始对柠檬酸的发酵机理进行了探讨，但都是从某些片面的现象或实验事实提出的假说，基本上属于猜测。
只有Raistrick和C1ark（1919年）提出的假说最接近于现代的理论，他们认为柠檬酸是由草酰乙酸和醋酸缩合成的。
随着酵母菌发酵的机理（EMP途径）被揭示和Krbse在1940年提出三羧酸循环学说以来，柠檬酸的发酵机理才惭渐被人们所认识。
现在普遍认为柠檬酸是经过EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环形成的。
一、EMP途径的证实
Jagnnathan等（1953年）证明，黑曲霉中存在EMP途径所有的酶。
Shu等（1954年）证实葡萄糖分解代谢中约80％走EMP途径。
虽然McDonough等（1958年）发现，在形成柠檬酸的条件下，磷酸戊糖循环（HMP）的酶也存在于黑曲霉中，但HMP循环主要在孢子产生阶段活跃，因为它提供了该酶合成等所需要的前体物质。
现在已统一认为，EMP途径在已糖的柠檬酸发酵中起主要作用。
EMP途径对柠檬酸发酵的调节主要表现在对磷酸果糖激酶（PFK）酶调节。
黑曲霉柠檬酸产生菌的PFK酶是酵解途径中第一个调节酶，也是决定EMP途径代谢流量的最重要的关键酶。
此酶受正常的生理浓度范围的柠檬酸和ATP的抑制，为AMP、Pi、NH4+所激活，NH4+还能有效地解除柠檬酸和ATP对PFK酶的抑制。
NH4+在细胞内的生理浓度水平下，PFK酶对柠檬酸不敏感。
考察柠檬酸发酵时，PFK酶的这些效应物在细胞内的浓度表明，铵离子浓度与柠檬酸生产速率有密切关系，并且显示在锰缺乏和充足条件下的显著差别，可以认为，锰的效应是通过铵离子浓度升高而减弱了柠檬酸对PFK酶的抑制。
二、三羧酸循环的证实
根据Krebs理论，柠檬酸是三羧酸循环成员之一。
研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环所有的酶，黑曲霉中三羧酸循环如图1-4所示，其主要调节酶包括：
（1）柠檬酸合成酶的调节
柠檬酸合成酶是TCA循环的第一个酶。
在许多细胞中是一种调节酶，然而根据柠檬酸合成与CO2固定之间的关系为化学计量关系，可以推测，黑曲霉的柠檬酸合成酶没有调节作用，这一点为Rohr证实。
他们从黑曲霉柠檬酸产生菌提纯此酶，此酶仅仅对CoA和ATP敏感，而其他有调节作用的化合物不起作用。
由于细胞中ATP是以镁络合物形式存在的，所以ATP的调节不明显，此酶的动力学性质是不平常的。
它对乙酰CoA的亲和力取决于草酰乙酸的浓度，在柠檬酸积累的情况下，草酰乙酸的浓度可提高此酶对乙酰CoA的亲和力.
（2）顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节
LaNauze等（1966）比较了在不同产率的柠檬酸发酵中，顺乌头酸水合酶、NAD和NAD-异柠檬酸脱氢酶的活力。
在柠檬酸产生和不产生的情况下，这3种酶均存在。
当供给铜离子0.3mg/L、铁离子2mg／L和pH2.0情况下，这三种酶均不出现活力，而发酵中柠檬酸正是在这个酸度下积累的。
因此他们认为细胞内pH2.0时上述酶失活，那么黑曲霉细胞内的pH会下降，即柠檬酸开始是如此积累的。
顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸
顺乌头酸
异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：
柠檬酸：
顺乌头酸：
异柠檬酸=90：
3：
7。
并发现在柠檬酸发酵中，无论培养基中是否存在铁离子，顺乌头酸水合酶催化的反应总是趋向柠檬酸一侧，保证柠檬酸得到充分积累。
一旦柠檬酸积累到一定水平，细胞内的pH下降，就能抑制顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，就抑制了柠檬酸自身的进一步分解。
黑曲霉中的异柠檬酸脱氢酶有三种：
一种NAD异柠檬酸脱氢酶，活力很低，两种NAD-异柠檬酸脱氢酶，其一在细胞质中，不受柠檬酸抑制，其二在线粒体中，与TCA循环有关，它受生理浓度的柠檬酸抑制，所以当柠檬酸积累到一定水平时，就抑制此酶的活力，从而更加促进柠檬酸的积累。
AD一异柠檬酸脱氢酶的抑制作用在碱性pH和30mmol／L锰离子时被解除，这就是国外菌种柠檬酸积累受锰离子毒害的缘故之一。
（3）a一酮戊二酸脱氢酶的调节
在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点是a一酮戊二酸脱氢酶的合成受高葡萄糖和铵离子的阻遏。
因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生长期，菌体内不存在a一酮戊二酸脱氢酶或活力很低。
在以乙酸为碳源时才有此酶活力。
a一酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应，一旦a一酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：
①TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。
②a一酮戊二酸又抑制NAD-异柠檬酸脱氢酶的活性。
三、丙酮酸羧化途径的证实
在积累柠檬酸的情况下，三羧酸循环已被阻断，显然必须要有另外的途径提供草酰乙酸。
按照Ramakn5hman等的说法，是由苹果酸酶位丙酮酸还原羧化，先生成苹果酸，再提供草酰乙酸的（参考图1—4）。
但后来更多的研究者证实黑曲霉中存在丙酮酸羧化酶。
而且此酶是组成酶。
因此现在已公认草酰乙酸是由丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸羧化形成的。
Johngon等在研究黑曲霉的CO2固定机理时发现，有两个系统可以使CO2固定，这两个系统都需要Mg2+和K2+。
其一是在磷酸烯醇丙酮酸（PEP）水平上羧化，生成ATP。
另一个系统是在丙酮酸水平上羧化，需要ATP和生物素
四．柠檬酸积累的生物调节
在正常生长情况下，柠檬酸在细胞内不会积累，而且，柠檬酸是黑曲霉的良好碳源。
毫无疑问，柠檬酸积累是菌体代谢失调的结果。
从理论推测起来（参看图1—4），乌头酸水合酶失活，三羧酸循环阻断是积累柠檬酸的必要条件之一。
现在已知，乌头酸水合酶需要Fe2+，将含Fe2+量高的原料（如糖蜜）用亚铁氢化钾除铁，可以提高柠檬酸产率。
也有人报道，在积累柠檬酸时，乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性丧失。
因此有人认为，柠檬酸积累是培养基中铁限制的结果。
但是后来的研究证实，在霉菌生长阶段，上述酶并末失活，而且在柠檬酸形成阶段也存在，它们在无细胞抽提物中消失是由于它们的不稳定性和制备时变性的结果。
另外，柠檬酸发酵中尚需少量的铁（0.1ppm）。
这些事实是上述假说所不能解释的。
另外，它也不能解释其他菌种在缺铁时为什么不能大量积累柠檬酸。
LaNauze（1966年）比较了在不同产率的柠檬酸发酵中，乌头酸水合酶、NAD—和NADP—异柠檬酸脱氢酶的活性。
在柠檬酸产生和不产生的情况下，这3种酶都存在。
在供给铜0.3mg／L，铁2mg／L和pH2.0的情况下，这3种酶不能呈现活性，而在工业发酵中，柠檬酸正是在这个酸度下积累的。
而且他还发现，菌体内也存在柠檬酸。
Lockwood（1979年）也证实菌体内存在柠檬酸，因此他认为，细胞内的pH也在2左右，上述酶的失活是由于酸度太高造成的。
但这还不能说明为什么pH会开始下降，即柠檬酸是怎样开始积累的。
Habison在研究黑曲雷B60时发现，EMP途径中的磷酸果糖激酶（PFK）是一个调节酶，它显示典列的真核生物PFK的共同调节性质（表1—16）。
根据现在已掌握的证据（见表l—16），PFK是柠檬酸合成中的主要调节点。
最值得注意的是它在正常的生理条件能被柠檬酸抑制。
促在柠檬酸发解中柠檬酸浓度很高，为什么EMP途径仍能保持畅通呢?
根据现有的知识，柠檬酸发酵需要下述环境条件：
磷酸盐浓度低；氮源用NH4+盐；pH值低（低于2.0）；溶氧量高；Mn2+、Fe2+、Zn2+含量极低。
那么，这些环境因素与柠檬酸发酵时的代谢调节，以致柠檬酸积累的关系究竟怎样呢?
对此，Rohr等（1983年）从锰和氧调节作用角度进行了理论解释，他们提出的代谢调节模型如图l—5所示。
众所周知，柠檬酸发酵时对Mn2+极端敏感。
根据现有观察，在缺乏锰的柠檬酸生产培养基上黑曲霉有下述生理和代谢变化：
HMP途径和三羧酸循环酶水平降低；
生长期氨基酸水平升高，NH4+水平升高；
丙酮酸和草酰乙酸水平升高；
甘油三酯和磷脂水平较低；
细胞型几丁质增多，但β葡聚糖和聚半乳糖减少；
生长期蛋白质和核酸水平较低。
一般说来，锰缺乏降低了HMP途径和三羧酸循环酶的活性，也导致了某些合成代谢的减弱，尤其是细胞内NH4+水平升高。
这很可能是蛋白质的合成受干扰，从而导致蛋白质的分解相应增加。
细胞内这种高浓度NH4+很可能是PFK的一种调节因子，因为已经证实它能解除前述柠檬酸相对PFK的抑制。
用纯化的黑曲霉PFK的体外研究也证实，NH4+在细胞内的生理浓度水平下，PFK对柠檬酸几乎不敏感。
既然NH4+是影响PFK的唯一媒介物，并且显示在锰缺乏和充足条件下的显著差别，可以认为。
锰的效应是通过NH4+水平升高而减弱了柠檬酸对只EMP途径关键酶（PEK）的抑制。
最近的研究表明，黑曲霉中有一种单纯的、位于线粒体上的乌头酸水合酶（acon5tatehy6rotase），它催化时建立一个平衡，
柠檬酸：
顺乌头酸：
异柠模酸=90：
3：
7
这个平衡也发现存在于其他真核生物中。
关于异柠檬酸的分解，其途径也行不同。
黑曲霉中依赖于NAD+的异柠檬酸脱氢酶只有一种，活性很低。
依赖于NADP+的异柠檬酸脱氢酶据发现有3种，两种与三羧酸循环有关，在线粒体中发现的两种都受生理浓度下的柠檬酸抑制，而细胞质中发现的一种不受它抑制。
这样可以推测，一旦柠檬酸积累到一定水平它就能抑制它自身的进一步分解，从而促进它自身的积累。
黑曲霉中三羧酸循环的另一个特点是，它的α—酮戊二酸脱氢酶被葡萄糖和NH4+抑制。
对于其他真菌，也有此酶缺失的报道。
此酶催化的反应是不可逆的，这一步缺失以后，形成所谓“马鞍形”循环。
而4C酸是由草酰乙酸沿逆向途径生成的。
因此，丙酮酸羧化酶必须是组成型的，以保证草酰乙酸的供应。
上述循环的4C酸部分似乎不受代谢物的调节．只有琥珀酸脱氢酶例外，它能被低浓度的草酰乙酸强烈抑制（参考表1—16）。
另外，氧对柠檬酸发酵也有关键性的影响，发酵结果可以简单表示为，
显然，O2是一个观念上的底物，它是发酵中（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH重新氧化的需要。
另外，近来的研究还发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链，后者对水杨酰异羟肟酸（SHAM）敏感（图1—6）。
柠檬酸发酵受SHAM强烈抑制（至少在一定时期如此），而菌休生长不受它抑制。
在生产中可以发现，只要通气中断很短时间，就会导致柠檬酸产率的急剧下降，而对菌体生长并无负的影响。
这种现象可以解释为，NADH通过标准呼吸链氧化产生ATP，会抑制磷酸果糖激酶（图1—5）；而通过侧系呼吸链氧化不产生ATP。
缺氧（即使很短暂）会导致侧系呼吸链的不可逆失活，从而导致产酸下降而并不有害于菌体生长。
因此发酵中必须维持高浓度溶氧。
综上所述，柠檬酸的积累机理可以概括如下：
（1）由锰缺乏抑制了蛋白质合成而导致细胞内NH4+浓度升高和一条呼吸活性强的侧系呼吸链不产生ATP，这两方面的因素分别解除了对磷酸果糖激酶的代谢调节，促进了EMP途径畅通。
（2）由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。
（3）在控制Fe2+含量的情况下，鸟头酸水合酶活性低而不能及时转化柠檬酸。
（4）一旦柠檬酸浓度升高，就会抑制异柠檬酸脱氢酶，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。
因为1moI己糖理论上可以生成1moI柠檬酸，所以理论产率为106，6％（192／180）。
五、乙醛酸循环的证实
上述理论只能解释由糖质原料可以产生柠檬酸，而不能解释出乙醇、乙酸或（酵母）烷烃发酵也可以生成柠檬酸。
Olsen（1954年）证明黑曲霉中有异柠檬破裂解酶存在，它催化异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸。
Kornberg等（1958年）发现，生长在标记醋酸和异柠檬酸上的黑曲霉生成了标记苹果酸，从而有力地证明了黑曲霉中也象其他生物一样存在乙醛酸循环。
由乙醛酸循环合成柠檬酸的途径见因l—7。
这个途径的原始底物只有乙酰CoA一种，理论上3mol乙酰CoA可以合成1mol柠檬酸。
虽然许多研究者证明在这种情况下异柠檬酸裂解酶和乌头酸水合酶活性较高，但在糖质原料发酵时异柠檬酸裂解酶活性丧失，乌头酸水合酶活性降低。
第四节柠檬酸发酵微生物
柠檬酸是好氧（或兼性好氧）生物体内代谢框纽——三羧酸循环的成员之一，在这些生物体中自然是广泛存在。
微生物中，能向体外分泌和在环境中积累柠檬酸者也很多。
但在工业生产上有价值的只有几种曲霉和几种酵母，其中黑曲霉是现在工业上最有竞争力的菌种。
酵母中竞争力强的菌种有解脂假丝酵母、季也蒙毕赤酵母等。
一、黑曲霉（AspergillusnigerVanTieghem）
（一）黑曲霉形态
在察氏琼脂上成局限菌落，室温（24-26℃）下培养10~14天直径达2.5—3cm，菌丝大部分在培养基内，着生丰富密集的直立分生孢子梗。
菌落典型为炭黑色，但有时也为深揭黑色；有霉味，不典型。
分泌物无，或局限为微小液滴，无色。
分生孢子头呈黑色，初为球形，然后呈放射状，常分裂成2瓣或多瓣柱状（图l—8），一股达700—800μm。
小而不典型的孢子头有时呈褐色，有时呈近球形。
较大的孢子头有时不全部着色。
分生抱子梗：
大小可变，常1.5~3mm×15~20μm;壁光滑，较厚（2~2.5μm）；无色
或哟有淡褐色阴区，特别在上半部分。
顶囊：
球形或近球形，直径一般45~75μm，常有较小者，偶尔也有80μm的较大者。
小梗：
双层，褐色、遍生，初生小梗随菌株和孢子头的成熟使而变，在多数培养物中梗基20~30μm×5—6μm，但常有达60~70×8~10μm者（甚至更大），成熟时有的具横隔。
次生小梗较为均一，一般为7~10×3~3.5μm。
分生孢子：
典型的成熟时球形，偶尔稍扁，不同（甚至不同）菌株中大小稍有不同，直径常为4~5μm，呈褐色；壁较厚；不规则粗糙，或显示低度戊中度突峤，或毛刺，—般不连续，使表面看上去似乎排列着明显的色条。
在察民琼脂上有些菌株产菌核，偶尔布满菌落表面。
球形防亚球形，一般直径0.8~1.2nm，起初奶油色防米黄色，老熟时转成禾杆黄色。
黑曲霉在麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，室温下2
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