MDCK细胞培育技术.docx

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MDCK细胞培育技术

孔板底面积,加的量,12孔板底面积,加的量2ml,24孔板底面积2cm2,加的量1ml,底面积,加培养液的量,

24孔板底面积2cm2,一样加培育液的量1ml,在接种病毒的时候一样病毒用量为添加培育液的5%-20%。

在做咽拭子标本时应视标本的搜集质量而定，若是标本搜集质量高能够少加一些，如若是标本搜集的不够好，那么应相对加大标本接种量，能够加到1ml.

附件1：

EDTA处理胰酶

GIBCOBRLCat.#15400

HEPES缓冲液

1M母液

GIBCOBRLCat.#15630-080

D-MEM培养基

GIBCOBRLCat.#11965-092

青、链霉素母液

10,000U/ml

GIBCOBRLCat.#15140-122/100ml

牛血清白蛋白组分V

%溶液

GIBCOBRLCat.#5260-037/100ml

三、MDCK细胞培育技术

（一）生物平安级别和生物平安规定

1.MDCK细胞培育实验室生物平安级别：

正常MDCK细胞培育在生物平安二级实验室进行。

2.MDCK细胞培育实验室生物平安规定：

遵守生物平安实验室相应的生物平安规定。

（二）MDCK细胞的传代培育步骤

1.细胞培育所需的材料（部份试剂在此列诞生产厂家货号仅供参考，可自行选择）：

（1）生长成片的MDCK细胞；

（2）T-75细胞培育瓶,颈口有倾角；

（3）D-MEM培育液；

（4）青、链霉素母液（10,000U/mL青霉素G；10,000µg/mL硫酸链霉素），分装后保留于-20℃；

（5）HEPES缓冲液，1M母液；

（6）胎牛血清；

（7）EDTA-胰酶％胰酶；·4Na）（GibcoCatNo.25300-062），分装后保留于-20℃；

（8）牛血清白蛋白组分V，％溶液（GIBCOCatNo.15260）；

（9）1mL和10mL无菌移液管等；

（10）70％～75％的酒精。

建议：

常常检查试剂利用的有效期和MDCK细胞的代数。

2.培育基和试剂的预备:

（1）500mL的D-MEM液中加入

a）青、链霉素母液5mL（终浓度达:

100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素）；

b）HEPES缓冲液（终浓度:

25mM）；

c）％牛血清白蛋白组分。

d）加入%NaHCO310-15mL（终浓度：

2-3%）

（2）细胞生长液

10mL胎牛血清加到90mL的上述D-MEM液，使胎牛血清的终浓度为10％。

每批胎牛血清均应进行血清测试，通过测试确信血清的最正确利用浓度。

此处提到的血清利用浓度只是一个参考浓度。

3.MDCK细胞的传代培育程序

此处以T-75细胞瓶单层培育为例，进行表达。

若是细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的浓度必需做相应的调整。

用于细胞培育的培育基、EDTA－胰酶等，置37℃预热后，用70％～75％酒精擦拭后放于生物平安柜内。

（1）弃去细胞已生长成片的细胞培育瓶中的培育液，加5mL37℃预热的EDTA-胰酶；

（2）温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀散布在整个细胞薄层。

然后用移液管吸去EDTA-胰酶；

（3）从头加入5mL37℃预热的EDTA-胰酶，重复上述步骤；

（4）加1mLEDTA-胰酶使其均匀散布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从细胞瓶的塑料表面分离（约5min～10min）。

必要时能够摇动或吹打来分离细胞。

加入1mL胎牛血清中和残余胰酶的活性；

（5）加9mL细胞生长液，轻轻移动移液管吹散细胞团，吹打从培育瓶底部一边开始到另一边终止，确保所有底部均被吹打到，吹打时动作要轻柔，尽可能幸免显现泡沫；

（6）吹打后，瓶中加入90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度约为每mL含105细胞），该培育液含终浓度为10％的胎牛血清；

（7）每一个T-25细胞培育瓶中加6mL（6×105/mL细胞）细胞悬液，剩余的细胞悬液能够加到另一T-75细胞瓶以用于细胞传代的种子。

通常6mL细胞悬液2～3日可长成80%～90%的单层细胞片；

（8）于37℃5%CO2培育箱里培育细胞，天天观看细胞状态。

注：

细胞传代的比例可依照细胞生长状况和实验需要进行调剂。

消化液除EDTA-胰酶外，也能够用％胰酶与Versene依照1:

7的比例配成消化液利用。

（三）细胞的冻存

1.细胞冻存材料

（1）成片的MDCK细胞：

80％～90％成片，细胞生长良好存活率高；

（2）二甲基亚砜（DMSO）；

（3）胎牛血清；

（4）EDTA-胰酶％胰酶；·4Na）；

（5）无菌移液管：

1mL和10mL。

（6）15mL无菌离心管

2.细胞冻存步骤

（1）冻存液的制备：

胎牛血清9mL；二甲基亚砜1mL。

（2）细胞消化：

消化进程同细胞培育的消化进程。

（3）细胞消化后，移入15mL离心管，1000rpm，离心5min，弃上清，轻弹离心管底，重悬细胞，加入配制好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。

细胞冻存浓度为1×106/mL细胞。

（4）常规细胞冻存进程：

4℃2h，-20℃2h，放入液氮长期保留。

如利用商品化冻存盒，直接放于-80℃留宿，第二天从冻存盒掏出，放入液氮保留。

（四）细胞的苏醒

苏醒细胞的原那么为快速解冻，以幸免冰晶从头结晶对细胞造成损害，从而致使细胞死亡。

新苏醒的细胞一样需要数日或继续传代1～2代，其细胞生长或细胞特性才会恢复正常。

1.材料

（1）37℃恒温水浴箱；

（2）细胞生长液；

（3）胎牛血清1mL；

（4）T-25培育瓶，无菌移液管；

（5）70％～75％的酒精；

（6）15mL无菌离心管

2.细胞苏醒步骤

（1）将细胞生长液放入37℃水浴预热，预热后以70％～75％的酒精擦拭外壁，放入生物平安柜内；

（2）自液氮中掏出细胞冻存管，检查盖子是不是旋紧，幸免热胀冷缩进程盖子松掉；

（3）当即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1min内全数融化，以70％～75％的酒精擦拭保留管外部，移入生物平安柜内；在解冻进程中，需做好个人防护，避免冻存管爆裂；

（4）掏出解冻的细胞悬液，缓慢加入到预先加有5mL细胞生长液的15mL离心管内，1000rpm，离心5min，弃去上清，用5mL细胞生长液重悬细胞，移入细胞培育瓶内，放入37℃5%CO2培育箱培育。

（五）质量操纵

MDCK细胞随着传代次数的增加，可能会降低其对流感病毒的灵敏性。

因此实验室应维持低代数的细胞株在液氮中。

为了维持该分离系统的灵敏性，当细胞苏醒后被持续传15～20代，或总代数达到40代以上时，能够用已知滴度的阳性质控病毒来查验MDCK细胞系的灵敏性。

若是细胞的灵敏性已经下降，即应苏醒新的细胞株。

所用细胞系应确保无支原体污染。

（六）MDCK细胞系的灵敏性的检测

选择已知TCID50的流感病毒，在同一条件下别离感染早代（小于30代）的细胞株和现有的细胞株，对其进行TCID50测定。

若是测试的TCID50比早代的低2个或以上Lg，说明其对病毒的灵敏性已下降，不该继续利用；若是二者相差不超出一个Lg，说明可继续利用。

四、流感病毒的分离

病毒分离培育是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最经常使用和最靠得住的方式之一。

目前多采纳鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。

通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。

另外由于“O”相毒株的重现，MDCK细胞对“O”相毒株的灵敏性远高于鸡胚，因此MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。

可是目前全世界要紧利用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。

具有流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。

假设同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK细胞对原始标本进行挑选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。

（一）实验室生物平安级别和生物平安规定

1.流感病毒分离实验室生物平安级别：

季节性流感病毒和2020甲型H1N1流感病毒生物平安二级；高致病性禽流感病毒生物平安三级。

2.流感病毒分离实验室生物平安规定

应当遵守生物平安实验室的有关生物平安的规定。

（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）

1.实验材料

（1）刚75-90％成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶

（2）TPCK处置胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）（SIGMAT8802）

（3）HEPES缓冲液,1M母液

（4）D-MEM培育基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's液

（5）青、链霉素母液（10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸链霉素）

（6）牛血清白蛋白组分Ⅴ，%溶液（GIBCOCatNo15260）

（7）处置好的临床标本（标本处置参见附件1第一部份）

（8）无菌移液管：

1mL和10mL

2.培育基和试剂的预备（建议：

常常检查试剂的有效期）

（1）500mLD-MEM液中加入：

a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：

100U/mL青霉素和100µg/mL链霉素）

b）牛血清白蛋白组分（终浓度:

％）

c）HEPES缓冲液（终浓度:

25mM）

d）加入%NaHCO310-15mL（终浓度：

2-3%）

（2）病毒生长液：

再向上述培育液中每500mL加入的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的浓度为2µg/mL。

3.流感病毒MDCK细胞分离程序

所有有关流感病毒分离的操作都应在相应生物平安级别的实验室中进行，必需遵守生物平安规定，严格执行标准操作规程和废弃物治理规定，做好个人防护要求。

（1）75～90％成片细胞的预备

a）用40倍光学显微镜镜观看细胞生长状态。

选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离。

b）轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸的Hank's液（或PBS缓冲液）清洗细胞3遍。

（2）接种于细胞培育瓶

a）用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培育瓶中移出。

b）用无菌的移液管吸取500µl临床样品置于细胞培育瓶中，温和摇动数次，使之均匀铺于细胞培育瓶底。

c）将步骤2）中的培育瓶放入35℃，5%CO2培育箱中吸附1～2h。

d）从培育箱中掏出细胞培育瓶，用10mL的无菌移液管吸取的Hank's液（或PBS缓冲液）清洗细胞，加入5mL含终浓度2µg/mLTPCK-胰酶的病毒生长液于细胞培育瓶中。

e）放置于35℃5%CO2培育箱培育。

f）每日观看细胞病变情形（细胞病变的特点是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严峻时细胞部份或全数脱落）。

（3）细胞培育物的收成

a）当75％～100％细胞显现病变时进行收成。

即便无细胞病变也应该于第7天收成。

b）进行红细胞凝集实验（HA），用HI方式进行流感病毒的鉴定（具体方式参见附件1：

五、红细胞凝集及红细胞凝集抑制实验）。

关于HA≤8的细胞分离物,进行10-1～0-3稀释后，再感染细胞继续进行细胞传代，直至HA≥8时才能利用HI方式进行病毒的鉴定。

经持续传代2次以上，HA<8者，能够用核酸检测方式鉴定分型。

（三）流感病毒鸡胚分离标准操作规程

1.实验材料

（1）9～11日龄鸡胚

（2）照卵灯

（3）70％～75％酒精

（4）一次性注射器

（5）鸡蛋开孔器

（6）蜡、胶水或胶布

（7）10mL试管和试管架

（8）10mL移液管

（9）无菌镊子

2.流感病毒鸡胚分离程序

所有有关病毒分离的操作都应遵守生物平安规定，严格执行标准操作规程和废弃物治理规定。

进入生物平安实验室要求遵循生物平安实验室的个人防护要求。

（1）验卵

a）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊腔的界限、胚胎的位置。

若是鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。

b）如何判定鸡胚状态

血管：

活胚血管清楚；死胚模糊，成淤血带或淤血块。

胎动：

活胚有明显的自然运动，可是大于14天的胎动那么不明显；死胚无胎动。

c）绒毛尿囊膜发育界限：

血管密布的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面（卵黄囊）形成明显的界限。

（2）鸡胚接种（照视下双腔接种法）

a）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每一个鸡胚,通常每一个样本接种3个鸡胚。

b）用70％～75％酒精消毒鸡胚表面，在气室端钻孔，开约6x6mm裂口。

c）注射器装上16号针头，吸200µL处置过的临床标本。

d）从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开大约1cm2面积（石蜡层不可将壳膜内层完全覆盖，会致使死胚），现在在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。

将注射针头缓慢刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100µl临床标本。

将针头退出至1/2寸长度，将另外100µl临床标本注入鸡胚尿囊腔。

e）用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外两枚鸡胚。

f）将针头弃于适合的生物平安装置中。

g）用消毒过的医用胶布封口。

h）33～35℃温箱培育鸡胚2～3天。

一样A型流感病毒培育2天，B型流感病毒培育3天，临床采样标本通常培育3天。

鸡胚进行病毒分离培育时，天天检查鸡胚生长情形，24h内死亡的鸡胚，以为是非特异死亡应弃去。

（3）鸡胚尿囊液和羊水的收成

a）鸡胚在收成前应置4℃留宿或至少放置4h。

b）标记15mL无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。

用70％～75％酒精消毒鸡胚顶部。

c）用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。

用10mL吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的搜集管中。

用吸管或无菌镊子刺破鸡胚羊膜，吸取羊水放置于另外的管中。

羊水较少时也能够将3个鸡胚的羊水归并。

d）将鸡胚收成液3000rpm离心5min去除血液和细胞。

进行红细胞凝集实验。

没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚盲传2次（关于“O”相的毒株，需要持续传代多次才能具有在鸡胚中生长的特性），盲传后HA滴度仍为阴性的标本，可按有关生物平安规定进行处置。

关于HA<8的鸡胚分离物进行10-1～10-3稀释后，继续进行鸡胚传代，HA≥8时才能利用HI方式进行病毒的鉴定。

经持续传代2次后HA<8者，能够用核酸检测方式鉴定分型。

（四）注意事项

1.不要在-20℃条件下保留病毒分离物，因为该温度条件下流感病毒极不稳固。

2.流感病毒分离操作严格依照生物平安规程的要求。

禁止在同一实验室，同一时刻处置和接种未知临床标本和已知病毒。

禁止在同一实验室，同一时刻处置接种采自不同动物的标本；动物标本（如猪、禽等）必需与人的标本别离保留。

五、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验

流感病毒的血凝素（HA）能够引发多种禽类和哺乳动物的红细胞发生凝集，因此而得名。

用于检测流感病毒滴度的红细胞凝集实验也是依照病毒的这一特性而成立的。

当血清中特异性抗体与病毒血凝素结合后，那么能够抑制红细胞凝集的显现，即为红细胞凝集抑制实验（HI）的理论依照。

微量红细胞凝集抑制实验是目前最经常使用的一种鉴定流感病毒型/亚型的方式。

该方式简单、易行、结果可信。

用于HI的标准参照血清必需及时更新，要包括昔时的疫苗株和/或流行代表株的抗血清。

HI中所用的血清必需经特殊处置以去除非特异性抑制素及非特异性凝集素。

（一）生物平安要求

生物平安要求及个人防护要求与流感病毒的分离相同，并应遵守相应的生物平安规定。

（二）实验所用试剂

1.抗原：

季节性A（H1N1）、A（H3N2）、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒液

2.抗血清：

经RDE或过碘酸钾处置后的季节性A（H1N1）、A（H3N2）、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒抗血清。

（三）其他试剂/材料/仪器（试剂盒中不包括）

1.红细胞悬液

2.PBS缓冲液，

3.水浴箱（37℃，56℃）

4.台式离心机

5.多道可调加样器

6.离心管

7.96孔微量血凝板（利用豚鼠和人红细胞进行实验须用“U”底板，利用鸡/火鸡红细胞进行实验最好用“V”底板，“U”底板也可利用）、可调多通道加样器、单道加样器等。

8.200ul、1000ulTIP头、水槽

流感病毒红细胞凝集实验各项条件比较

红细胞

鸡

火鸡

豚鼠

人“O”型血

终浓度

孔底部形状

V型

U型

孵育时间

30min

45min

60min

红细胞沉积形状

细胞沉积成点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状

细胞沉积成环状

（四）流感病毒鉴定步骤

1.红细胞配置

如用火鸡、鸡的红细胞，工作液浓度为1%，如用人“O”型、豚鼠红细胞，工作浓度为%。

下面介绍WHO流感参比与合作中心提供的红细胞标定的方式：

（1）S液中的红细胞，1200r/min离心5min，弃上清。

（2）加入等量的PBS液体洗涤，充分混匀，1200r/min离心5min，弃上清。

（3）PBS液体洗涤三次。

最后一次洗涤后，1200r/min离心10min。

（4）将红细胞稀释至适合的浓度。

注：

液全称为Alsever氏液。

配制方式为葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠、去离子水加至100mL，微热溶解，将pH值调到，8磅20min高压灭菌，4℃贮存备用。

2.流感毒株HA滴度的测定

（1）在微量血凝板的第2~12列加入50ulPBS（）。

（2）在第一列（A1~G1）中加入100ul病毒悬液。

（3）H1加入100ulPBS，作为红细胞阴性对照。

（4）从第一列各孔吸50ul病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀释，最后一列每孔弃去50ul。

（5）在每孔中加入50ul红细胞悬液，轻拍血凝板，充分混匀。

（6）室温孵育，孵育时刻见表：

流感病毒红细胞凝集实验各项条件比较。

3.HA实验结果判定

引发全数红细胞凝集为完全凝集，以“+”记录；只有部份红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录“-”。

血凝滴度的判定以显现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。

HA滴度判定举例

病毒稀释度

HA滴度

128

256

512

1024

2048

128

≥2048

＜1

4.制备用于红细胞凝集抑制实验的4个血凝单位的抗原

（1）一个凝集单位指能引发等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。

进行红细胞凝集抑制实验时一样用4个血凝单位的病毒量。

（2）制备4个单位血凝抗原时，第一计算出红细胞凝集抑制实验所需的病毒抗原的总量。

如每种血清做8孔稀释，每孔用抗原25ul，则测定一份血清需抗原。

依照标准血清的份数（本试剂盒包括5种标准血清）计算出实验所需病毒抗原总量。

（3）第二，计算出病毒稀释度。

用病毒的HA滴度除以8，取得的商即为配置4个血凝单位所需的稀释度。

如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8，那么1:

8（1mL病毒液加7mLPBS）稀释该病毒即可取得4个血凝单位的抗原。

注：

红细胞凝集抑制实验中所用的4个血凝单位是指每25ul病毒液中含有4个血凝单位（等于50ul病毒液中含有8个血凝单位）。

所需抗原总量为1600ul时，4个血凝单位配置对照表

HA滴度

病毒液（ul）

PBS（ul）

800

400

1200

200

1400

128

100

1500

256

1550

512

1575

1024

2048

5.4个血凝单位抗原的复核滴定

为了保证红细胞凝集抑制实验中抗原用量一致而且准确无误，新配置的4个血凝单位抗原需复核滴定。

操作方式同HA实验步骤。

若是只有前4孔显现凝集，说明每50ul病毒含有8个血凝单位，该病毒稀释准确，能够用于红细胞凝集抑制实验。

如第5孔也显现凝集，说明每50ul病毒含有16个血凝单位，该抗原必需等量稀释。

如只有前3孔凝集，说明每50ul病毒仅含4个血凝单位，病毒量需加倍。

另外，4个血凝单位抗原必需每次用前新配置。

6.红细胞凝集抑制实验（HI）鉴定未知病毒

（1）在血凝板的每孔加入25ulPBS。

然后在A1—A5、A7—A11各列别离加入：

抗季节性A（H1N1）流感病毒标准参考血清、抗季节性A（H3N2）流感病毒标准参考血清、抗B-Yamagata系流感病毒标准参考血清、抗B-Victoria系流感病毒标准参考血清、抗新甲型H1N1流感病毒标准参考血清25ul，A6、A12加入25ulPBS，作为阴性对照。

用多道移液器从A行每一个孔别离取25ul，由A至H行做2倍稀释血清，最后一行弃去25ul。

（2）A1至A5各列每孔加入25ul待检抗原（4个血凝单位）阳性对照：

A7至A11各列别离加入4个血凝单位的季节性A（H1N1）流感病毒标准参考抗原、季节性A（H3N2）流感病毒标准参考抗原、B-Yamagata系流感病毒标准参考抗原、B-Victoria系流感病毒标准参考抗原、新甲型H1N1流感病毒标准参考抗原各25ul/孔。

对照孔A6、A12各列加入25ulPBS/孔。

轻拍，混匀，室温孵育30min。

（3）每孔加入50ul配置好的红细胞悬液，轻拍混匀，室温孵育30-60min，观看血凝抑制实验结果。

（具体孵育时刻依照利用的不同种血球来定，详见表1。

）

（4）血凝抑制效价是完全抑制血凝显现时血清的最高稀释度的倒数。

7.鉴定结果判定

（1）标准参照血清对待检抗原的抑制效价≥20才能够算为阳性。

（2）一种待检抗原不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制。

（3）待检抗原标准参照血清有交叉抑制，但与一种亚型（B型流感称为系）的标准参照血清抑制效价大于其他亚型参照血清4倍以上时，即能够判定为此种亚型的流感病毒。

（五）注意事项

1.血红细胞凝集抑制实验必需用4个血凝单位/25ul的抗原，抗原必需新鲜配制。

2.红细胞悬液的配制必需标准化。

3.正确寄存试剂，幸免反复冻融及污染。

4.冻干的试剂应依照说明溶解，保留。

5.任何待检病毒与一种以上的推

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