分析实验2.docx

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分析实验2

熏肉制品中亚硝酸盐含量的测定

【摘要】亚硝酸盐是肉制品中的常用的添加剂，带较大的毒性，本次我们的实验以α-萘胺为显色剂,利用紫外可见分光光度计,测定熏肉制品中亚硝酸盐的含量。

采用分光光度法确定最佳吸收波长，根据最佳吸收波长，用标准曲线法检测熏肉中的亚硝酸盐含量。

【关键词】肉制品;亚硝酸盐;紫外-可见分光光度法

【引言】亚硝酸盐用于肉类食品中作为发色剂。

在食品加工过程中,添加适量的化学物质与食品中的某些成分作用,从而使食品呈现良好的色泽,这样的化学物质成为发色剂。

类腌制品中最常有的发色剂是硝酸盐,亚硝酸盐以及发色助剂,抗环血酸、烟酰胺等。

肉制品由于使用亚硝酸盐而呈鲜红色。

亚硝酸盐也是一种防腐剂,它可抑制微生物的增值,在食品工业生产中,原料内的红色是由肌红蛋白及血红蛋白所呈现的感官性状。

肌红蛋白约占60%-70%,血红蛋白占10%-30%,即肌红蛋白是表现肉颜色的主要成分,新鲜肉中还原型的肌红蛋白呈暗紫红色,它很不稳定,易被氧化而呈鲜红的氧合肌红蛋白,继续氧化则成褐色高铁肌红蛋白,再继续氧化呈黄色或绿色的氧化卟啉。

在肉制品加工过程中,为了使肉类食品呈鲜艳的红色,添加硝酸盐及亚硝酸盐,在肉制品内它们转化为亚硝酸,并分解出亚硝基,生成的亚硝基会很快的与肌红蛋白生成鲜艳亮红色的亚硝基肌红蛋白,亚硝基肌红蛋白遇热放出变成具有鲜红色的亚硝基血色原,赋予食品鲜艳的红色。

亚硝酸盐不仅具发色作用,同时对肉毒杆菌具有特殊的抑制作用,对提高肉类食品的风味有一定的功效,它们作为食品添加剂,对人体有一定的毒性,摄取过多亚硝酸盐,可使血液中正常的血红蛋白（二价铁）变成正铁血红蛋白（三价铁）而失去携氧功能,导致神经缺氧。

由于肉制品生产企业在生产过程中乱加、误加亚硝酸盐而引起食物中毒,所以强制检验肉制品生产企业加入硝酸盐与亚硝酸盐的含量起到非常重要的作用。

肉类罐头与肉制品最大使用量不得超过0.05克/公斤。

除了肉类食品含有硝酸盐及亚硝酸盐,果蔬制品、酱腌菜中也含有亚硝酸盐。

肉类食品中亚硝酸盐测定方法有很多种，以下是对几种方法的简介：

1．盐酸萘乙二胺法

在弱酸性溶液中，NO2-与对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物后，再与盐酸萘乙二胺偶联生成紫红色的偶氮染料，用分光光度法在540nm处测定，与标准曲线比较定量。

2．格里试剂比色法

在弱碱性条件下，用热水从样品中提取NO2-，然后用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀蛋白，过滤后，在弱酸条件下，NO2-与对氨基苯磺酸发生重氮化后，再和N—1—萘基乙二胺耦合形成红色偶氮染料，最大吸收波长为538nm，所选择的显色剂不一样，最大吸收波长也有所不同。

针对卫生标准的规定和工艺的不同，以及检测过程中pH、温度、放置时间对显色的影响，在检测肉制品中NO2-时，格里试剂比色法的准确性和稳定性均高于盐酸萘乙二胺法。

另外用对氨基苯磺酰胺代替对氨基苯磺酸，其灵敏度、精密度均得到提高。

3．离子色谱法

主要原理是当淋洗液携带样品进入分离柱后，样品离子便与离子交换功能基的平衡离子争夺树脂的离子交换位置。

经过多次竞争达到交换平衡。

由于不同离子对树脂固定相的亲和力不同，通过淋洗液的不断淋洗，各种离子便先后从色谱柱上被洗脱下来，实现了分离。

通过检测器，即可经检测器检测各种离子，得到一个个色谱峰，然后与标准进行比较，根据保留时间定性，根据峰面积或峰高定量。

用紫外检测离子色谱法对酱腌菜中的NO3-与NO2-进行定量分析。

样品经过超声提取后，以1.8mmol/LNaCO3及1.7mmol/LNaHCO3为淋洗液，经DIONEXIonpacAS4A—SC分析柱分离，于210nm处紫外检测。

该法可以采用其他类型的色谱柱进行分离，所用的检测器也可选用化学抑制型电导检测器（可大幅度降低淋洗液的电导值）。

4．高效液相色谱法

食品中NO2-含量的重氮化耦合高效液相色谱法测定方法是将食品样品中蛋白质、脂肪除去后，NO2-与对氨基苯磺酸重氮化，再与N一1一萘乙二胺耦合之后，进行HPLC分析。

若采用反相高效液相色谱法一二极管阵列检测器法测定卤肉制品中NO3-及NO2-的含量，则该方法选择四丁基溴化铵作为离子对试剂，与NO3-和NO2-阴离子形成中性缔合物，在甲醇一混合磷酸盐流动相中，被非极性键合相柱（ODS）分离并定量检测。

5．气相色谱法

在硫酸介质中，NO2-与环己基磺酸钠反应生成环己醇亚硝酸钠，环己醇亚硝酸钠在常温下成气态，顶空进样，用FID检测器进行检测。

该方法的取样量较少、简单快速，抗其他离子干扰的能力强，提高了灵敏度和准确度。

也可利用NO2-用KMnO4氧化为NO3-，用酸作催化剂，控制一定温度，使NO3-与苯发生反应生成硝基苯，萃取，然后利用选择性强的电子捕获检测器检测该生成物，从而测出样品中NO2-的含量。

6．示波极谱法

GB5009．033—2003测定方法中，另外一种方法是示波极谱法，试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性的条件下，NO2-与对氨基苯磺酸重氮化后，在弱碱性条件下再与8—羟基喹啉耦合形成橙色染料，该染料在汞电极上还原产生电流，电流与NO2-的浓度呈线性关系，可与标准曲线比较定量。

7．伏安法

伏安法是在酸性介质中以玻碳电极（GCE）为工作电极的铁氰化钾电催化还原亚硝酸盐的电化学行为及电分析方法。

当K3Fe（CN）6浓度一定时，电催化还原峰电流与NO2-浓度在4.0×10-7～1.0×10-4mol/L范围时有良好的线性关系，运用方波伏安法在优化条件下测定了水样中亚硝酸盐含量，测定结果令人满意。

8．原子吸收光谱

该方法是一种用原子吸收光谱法间接测定腌制食品和熏制食品中亚硝酸盐含量的方法.在酸性条件下,用高锰酸钾将食品中的亚硝酸盐先转化成二氧化锰沉淀,再用硫酸溶解沉淀,以原子吸收光谱法测定锰的吸光度,从而间接得到亚硝酸盐的含量,回收率在97.6%～105.2%之间.此方法简捷快速,适用于腌制食品和熏制食品中亚硝酸盐含量的测定.

9．分光光度法

在稀盐酸介质中，NO2-与碱性品红发生重氮反应，用8—羟基喹啉作偶联剂，在弱碱性条件下，生成茶红色偶氮染料来定量测定NO2-含量。

最常用的方法是盐酸萘乙二胺法,也就是用分光光度计测定样品吸光度,分光光度法以其设备简单、操作快捷、灵敏度高、结果直观的优点,深受欢迎。

本实验研究了以α-萘胺为显色剂,利用紫外可见分光光度计测定肉制品中的亚硝酸盐的含量的方法。

结果证明,此方法简单、快捷、准确,是一种食品检测的好方法。

【实验部分】

一、实验原理

自样品中抽提分离出亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，此重氮盐再与α-萘胺试剂发生偶合反应，生成紫红色偶氮化合物。

其颜色的深度与样液中亚硝酸含量成正比，可比色测定。

反应式如下：

肉制品中亚硝酸盐含量=

（mg/kg）

式中：

c为由测得的吸光度在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；m为样品质量（g）。

由于摄入过量的亚硝酸钠盐对人体有一定的危害，因此国家食品安全标准规定，我国的腌肉制品亚硝酸盐的限量标准为：

30mg/kg，即30ug/g。

二、主要试剂及仪器

（1）亚铁氰化钾溶液：

称取10.619克亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]溶于水，并稀释至100mL。

（2）乙酸锌溶液：

称取22.0克乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加3mL冰醋酸溶于水，并稀释至100mL。

（3）饱和硼砂溶液：

5.0克硼酸钠（Na2BO4·10H2O）溶于100mL热水中，冷却备用。

（4）对氨基苯磺酸溶液（0.4g/L）：

称取2.0g对氨基苯磺酸溶于500mL20%盐酸中，避光保存。

（5）0.2%α-萘胺溶液（2g/L）：

称取1.000g盐酸萘乙二胺，以水定容500mL，避光保存。

（6）亚硝酸钠标准溶液（200μg/mL）：

精确称取0.1020克于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠（优级纯），加水定容到500mL。

（7）亚硝酸钠标溶液（5μg/mL）：

临用前，吸取此溶液2.5ml于100ml容量瓶中，用水定容到100ml

（8）仪器：

①研钵②UV8500紫外-可见分光光度计③分析天平④1mL、2mL、5mL、20mL移液管各1支⑤50mL烧杯1个，100ml烧杯1个⑥10ml量筒1个，100ml量筒1个⑦500mL烧杯1个，500ml容量瓶4个⑧50mL容量瓶10个，100ml容量瓶4个⑨滤纸、过滤装置一套⑩比色皿2个。

三、实验操作

（1）样品处理

样品中硝酸盐及亚硝酸盐的提取：

称取经剁碎混合均匀的样品5.07克于100mL烧杯中，加入硼砂饱和溶液12.5mL，以玻璃棒搅拌，然后用70℃左右的水约300mL，将其稀释转移到500mL容量瓶，沸水浴中加热15分钟，取出，转动，加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加5mL乙酸锌溶液，以沉淀蛋白质。

冷却到室温，用水定容，摇匀。

放置片刻，去除上层脂肪，清液用滤纸过滤，前30ml滤液弃之不用。

（2）最大吸收波长的确定

先用0.0000μg/mL的去离子水作为空白溶液也就是参比溶液进行基线调零，调零后，把靠近外面的比色皿拿出换装浓度为0.204μg/ml的标准溶液在波长600nm—450nm之间进行扫描,求出最大吸收波长

（3）亚硝酸钠标准曲线的绘制

用移液管精确吸取亚硝酸钠标准液（5μg/mL）0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0mL于一组50mL容量瓶中，各加水至约25mL，分别加2mL0.4g/ml对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置3—5min后，各加入1mL0.2%α-萘胺溶液，并用水定容到50mL，摇匀。

（浓度分别为（0.000,0.020,0.041,0.061,0.082,0.102,0.153,0.204,ug/ml）

静置15min后，用20mm比色皿，用分光光度计在最大波长下测定吸光度，以蒸馏水为空白。

以测得的各比色液的吸光度对对应的亚硝酸浓度作曲线。

比色液中亚硝酸钠浓度为0~0.30ug/mg时，两者呈线性关系。

（5）亚硝酸盐的测定

取20mL待测液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%对氨基苯磺酸溶液，摇匀。

静置3～5分钟后，加入0.5mL0.2%α-萘胺溶液，定容，摇匀。

比色测定，记录吸光度。

根据标准曲线方程算得相应的亚硝酸钠浓度（μg/mL），计算试样中亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量。

四、实验数据的记录计算与分析

（注：

我们小组测量吸光度时，显色时间已超过30min，远超过有效显色时间范围，数据无效，实验失败，故借用其他小组的数据进行分析。

）

1.最大吸收波长的确定

结论：

采用0.20ug/ml的亚硝酸钠溶液，在450nm——600nm扫描得最大波长为546.60nm。

讨论：

因为同时有多组同学进行实验，为合理安排时间，大概在显色10min时进行最大波长的扫描。

因为在10min时用0.082ug/ml（中间浓度）的亚硝酸钠溶液，没有显示出吸收峰，所以改用0.204ug/ml的亚硝酸钠溶液，因为浓度大，所以尽管显色时间不够，但依旧有吸收峰。

2、亚硝酸钠标准曲线和方法的灵敏度（确定最大波长为546.60nm）

亚硝酸钠标准液

浓度（ug/mL）

0.000

0.020

0.041

0.061

0.082

0.102

0.153

0.204

吸光度A

0.003

0.017

0.031

0.044

0.061

0.074

0.110

0.148

亚硝酸钠标准曲线

结论：

本次实验测得的标准曲线的相关系数为：

0.9998，相关系数高，结果较为可靠。

3待测溶液的吸光度和结果

待测溶液吸光度Abs

0.045

待测溶液浓度ug/ml

0.060

数据处理：

由计算亚硝酸盐含量P=

（mg/kg）式中：

c为由测得的吸光度在标准曲线上对应的亚硝酸钠质量浓度（μg/mL）；m为样品质量（g）。

将c=0.060ug/ml,m=5.00g代入，计算得P=7.50mg/Kg<30mg/kg（国家肉制品亚硝酸盐的限量标准）。

结论：

该熏肉的亚硝酸盐含量为7.50mg/Kg，符合国家标准！

结果分析与讨论

1.结果讨论

（1）.实验的显色剂只有在一定的显色时间范围内才有效，若超过该时间段，则所配制的溶液的吸光度与浓度将不成正比例关系。

本次实验中，由于实验条件的限制以及时间安排的不合理，我们小组的实验由于测定时显色时间也超过30min，远超过最佳显色时间，导致测量标准曲线时吸光度与浓度不成正比例关系，实验数据无效，实验失败。

（2）.以上实验数据中，实验测定样品时，显色时间大概是12min，比测标准曲线时的显色时间稍短，可能导致显色不充分，测定所得的数据偏低。

（3）.在实验过程中，由于实验条件的限制，很难保证实验过程中时间的准确控制，在一定程度上由于显色时间的差别会造成实验结果的偏差。

（4）.实验中的乙酸锌及亚铁氰化钾是蛋白质沉淀剂，这两种试剂混合形成白色的氰亚铁酸锌沉淀，能使溶液中的蛋白质共同沉淀下来。

过滤稀释得到待测液。

（5）.实验中不能任意改变试剂的加入顺序，在弱酸条件下亚硝酸盐先与对氨基苯磺酸重氮化，再与盐酸萘乙二胺偶合形成红色染料，才能用分光光度法进行测定。

（6）.本实验是多人大组，两人小组完成实验，可以避免试剂的浪费，但是也减少了我们实际操作的机会，比如我们平时较少接触到的蛋白质的沉降，以及浑浊液的冷却过滤，在本实验中也只是一个小组有机会操作。

2.部分食品中亚硝酸盐的限量标准（以NaNO2计）

　　品名限量标准mg/kg

食盐（精盐）、牛乳粉≤2

香肠（腊肠）香肚、酱腌菜、广式腊肉≤20

鲜肉类、鲜鱼类、粮食≤3

肉制品、火腿肠、灌肠类≤30

蔬菜≤4

其他肉类罐头、其他腌制罐头≤50

婴儿配方乳粉、鲜蛋类≤5

西式蒸煮、烟熏火腿及罐头、西式火腿罐头≤70

8、参考文献

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