蛋白质的盐析与电泳.docx

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蛋白质的盐析与电泳

生物技术

综合大实验报告

姓  名：

曾奇                 

学  号：

20112113310056         

学  院：

海洋学院           

专  业：

11级海洋科学          

指导老师：

方再光                

日  期：

2014年6月18日        

蛋白质的纯化与电泳

1.实验目的

采用硫酸铵盐析法将琼胶降解酶从琼胶降解菌FG1的产物中分离出来，并学习使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS—PAGE）测定蛋白质的分子量，使学生学习掌握离心技术和采用盐析法分离目的蛋白技术以及电泳法的基本原理和操作技术。

2.实验原理

2.1盐析法沉淀蛋白质技术

2.1.1盐析法的概念

用盐析法从成分复杂的蛋白质溶液（如细胞裂解液）中提取目的蛋白质是一种传统的目前仍被广泛使用的蛋白质分离纯化技术。

盐析法就是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

2.1.2盐析法的基本原理

蛋白质在稀盐溶液中，其溶解度会随盐浓度的升高而增加，此种现象被称作盐溶。

但是当盐的浓度继续增高时，蛋白质的溶解度又以不同程度地下降并先后从溶液中析出，此种现象被称为盐析。

上述现象是由于蛋白质分子中极性基团之间存在静电力。

在低盐浓度下，蛋白质分子中极性基团之间的静电力受盐离子的影响而被消除，蛋白质在水中的极性基团的电荷被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子之间相互聚集并从溶液中析出。

2.1.3影响蛋白质盐析的因素

（1）蛋白质溶液中盐的浓度。

不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。

从成分复杂的蛋白质溶液中分离蛋白质时，盐的饱和度应由稀到浓渐次增加。

每出现一种蛋白质沉淀就应将其分离除去后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀出来；

（2）蛋白质溶液的PH值。

在蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解度最小而容易沉淀出来，因此盐析时应将PH值调节在目的蛋白质的等电点附近；

（3）蛋白质浓度。

在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易被盐析沉淀。

但是浓度太高时，易使杂蛋白共沉淀；

（4）温度。

浓盐溶液对蛋白质有一定的保护作用，因此一般的盐析操作可以在室温下进行。

2.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS—PAGE）技术

2.2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳的概念和分类

聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）用于分离蛋白质和寡糖核苷酸，是生命科学研究领域重要的分析技术，是蛋白质纯度和浓度分析等实验的常用技术之一。

聚丙烯酰胺凝胶电泳有非变性聚丙烯酰胺凝胶和SDS—聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）两种形式。

非变性聚丙烯酰胺凝胶在电泳时，蛋白质是完整的，并且根据蛋白质的形状、分子量大小以及其所带电荷量而逐渐呈梯度分开。

本次实验所用技术为SDS—PAGE，此技术可以根据蛋白质亚基分子量的不同而将蛋白质分开。

该技术最初是Shapiro等于1967年发明的，他们发现强还原剂和离子去污剂在加入到样品介质和聚丙烯酰胺凝胶后，亚基分子量的大小是蛋白质亚基电泳迁移率的主要影响因子（可以忽略电荷因素）。

2.2.2SDS—PAGE的基本原理

蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。

当溶液的pH大于蛋白质的等电点（pI）时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。

本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。

由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。

这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。

同时，在制备上层胶（浓缩胶）和下层胶（分离胶）时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。

在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。

不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。

由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠（SDS），由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。

蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。

3.实验材料及器材

3.1实验材料

（1）琼胶降解菌FG1，由本实验室提供

（2）分析纯硫酸铵：

用干净的磁研钵研成细粉末

（3）30%三氯乙酸

（4）SDS-PAGE所需试剂

3.2实验仪器

（1）DYCZ-24D垂直板电泳槽（北京市六一仪器厂）

（2）电泳仪DYY-4（北京六一仪厂）

（3）长滴管及微量加样器

（4）烧杯（100mL、250mL、500m1）、量筒（500mL、250m1）、培养皿（15cml5cm）、离心管（50mL）、微量离心管（1.5mL）10支

（5）注射器、微量离心管支架

（6）高速冷冻离心机

（7）移液器（1ml、200μL、20μL）、移液枪（1ml、200μL、20μL）

（8）磁力搅拌器、搅拌磁棒

3.3实验试剂

试剂名称

规格

生产单位

SDS—PAGE所用试剂

丙烯酰胺

100g

BBI

甲叉双丙烯酰胺

100g

BBI

过硫氨酸

100g

BBI

尿素

500g

广州化学试剂有限公司

TEMED

100ml

Sigma

SDS

500g

BIOBASICINC

DTT

1g

中科瑞泰生物科技公司

甘氨酸

100g

中科瑞泰生物科技公司

冰醋酸

500ml

广州化学试剂有限公司

甲醇

500ml

广州化学试剂有限公司

考马斯亮蓝R-250

5g

中科瑞泰生物科技公司

低分子量蛋白质Marker

14.4-116KDa

中科瑞泰生物科技公司

硫酸铵盐析所用试剂

硫酸铵

500g

广州化学试剂厂

4.实验内容

4.1硫酸铵盐析法分离目的蛋白

4.1.1材料预处理

（1）菌体和产物的分离：

取6个50ml离心管分别装入琼胶降解菌FG1、FG2、FG3、FG4、FG5、FG6的发酵液，用分析天平平衡离心管，10000r/min，离心10min，取上清液。

（2）粗提物的获取：

在

（1）中所获取的上清液中加入20%（NH4）2SO4，放入装有碎冰的泡沫箱，静止2h，获得琼胶降解物的粗提物。

4.1.2预实验：

硫酸铵盐析最佳饱和度的确定

（1）取7支微量离心管，用记号笔在管帽上标记20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%；

（2）以上述离心管作容器分别称取磨细的硫酸铵晶体末0.171克、0.246克、0.366克、0.468克、0.477克、0.705克和0.843克；

（3）分别向上述装有（NH4）2SO4粉末的离心管中添加1.5ml的粗提物（琼胶降解菌FG），充分振荡使（NH4）2SO4溶解后，在4度下静置12h；

（4）将离心管放置于离心机中，以1000转/分转速离心5分钟后，倾去上清，倒立离心管，以便尽可能多地去除上清；

（5）添加0.5ml蒸馏水及8μl30%三氯乙酸混匀,静置10分钟后,离心,尽量去除上清；（因此步会造成蛋白质不溶影响后续工作，所以省略）

（6）将离心管置于快速干燥器中干燥30分钟；

（7）向离心管中添加100μISDS-PAGE上样缓冲液悬浮沉淀后，在沸水浴中煮沸3分钟，取出置-20℃冰箱中备用；

4.2SDS—PAGE电泳确定目的蛋白最佳饱和度

4.2.1主要试剂

（1）标准蛋白混合液

（2）30％凝胶贮备液：

丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g,加双蒸水至100mL。

外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。

（3）分离胶缓冲液（1.5mol／L）:

Tris18.17g,加双蒸水溶解,6mol/LHCl调pH8.8,定容100mL。

4℃冰箱保存

（4）浓缩胶缓冲液（0.5mol／L）:

Tris6.06g,加水溶解，6mol/LHCl调pH6.8，并定容到100mL。

4℃冰箱保存

（5）电极缓冲液（pH8.3）：

SDSlg，Tris3g，Gly14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。

4℃冰箱保存。

（6）10％SDS，室温保存

（7）质量浓度10％过硫酸铵（新鲜配制）

（8）上样缓冲液：

0.5mol／LTris-HClpH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。

（9）0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：

0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸

（10）脱色液：

50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml双蒸水混合

（11）未知分子量的蛋白质样品（1mg／mL）

4.2.2实验操作

（1）装板

将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度,即可灌胶。

（2）凝胶的聚合

分离胶和浓缩胶的制备：

按下表中溶液的顺序及比例，配置10％的分离胶和4.8％的浓缩胶。

试剂名称

10%的分离胶

5%的浓缩胶

Acr/Bis30%/ml

分离胶缓冲液（pH8.9）/ml

浓缩胶缓冲液（pH6.8）

10%SDS/ml

10%过硫酸铵/ul

双蒸水/ml

TEMED/ul

3.3

3.75

0

0.1

50

4.05

5

0.8

0

1.25

0.1

25

2.92

5

按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。

将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。

然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。

室温放置聚合30-40min。

待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。

用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子（梳子）；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。

（3）蛋白质样品的处理

若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL0.5mol／LpH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg／mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。

本实验所用样品为15～20g的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20l的样品处理液。

在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。

吸取未知分子量的蛋白质样品20l，按照标准蛋白的处理方法进行处理。

（4）加样

SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法

用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。

加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15l（含蛋白质10～15g），稀溶液可加20～30l（还要根据胶的厚度灵活掌握）。

（5）电泳

加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。

当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约6小时。

如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。

（6）染色、脱色

电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。

弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。

5.数据处理和现象记录

5.1盐析现象和数据记录

5.1.1盐析现象

蛋白质盐析后，发现1号离心管基本无絮状沉淀，2号离心管略有沉淀，3、4、5号离心管均有较多絮状沉淀，6、7号离心管底部有很多沉淀并硫酸铵盐过饱和而析出。

5.1.2盐析梯度浓度

硫酸铵浓度

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

硫酸铵质量g

0.171

0.264

0.366

0.468

0.587

0.705

0.843

溶液体积ml

1.5

5.2SDS—PAGE电泳数据记录和处理

5.2.1SDS-PAGE电泳图谱

两胶分离界面

Line6

Line8

Line7

Line5

Line4

Line3

Line2

Line1

上图所示区域为本组点样区，从右到左依次标记为1到7号。

并出现图示的8个条带。

5.2.2实验结果：

从上图的电泳图谱可以看出来，本次实验总共分离出8条较为清晰的电泳带，按照蛋白质分子量的大小依次为Line1到Line8，表明琼胶酶降解菌FG1所分泌的蛋白质总共有8种。

其中，Line1，Line2，Line3，Line7四条带清晰程度高，表明其含量高，说明这四种蛋白质在FG1降解菌的分泌蛋白质占主导地位，而其余4种蛋白质条带模糊不清，表明其含量低，FG1降解菌分泌的少。

这说明FG1琼胶酶降解菌分泌的酶是非常多样的，存在着复杂的协同效应，并且主要是大分子量的蛋白质。

另外纵向来看，3,4，5号点样孔尤其是4号点样孔的条带最为清晰可辨，表明在盐浓度为40%到60%时，蛋白质盐析结果较好，其中以4号盐析浓度下（即50%浓度）的蛋白质析出效果最好。

5.2.3分析与讨论

电泳图谱中显示有些条带弥散较为严重，如Line4和Line5最为明显。

分析原因大概有以下几点：

比如实验操作误差，冷藏时将蛋白质误存入-20度冰箱保存，电泳时电压不稳定，电泳仪出现一些问题等等，这些因素都会最终影响实验结果。

6.问题与解答

6.1为提高蛋白质盐析分离效率，应采取哪些措施？

由统一单蛋白盐析公式：

lgS=Ks×I可知，要想提高蛋白质的盐析效率，主要从盐的种类、PH、温度等方面考虑。

其中，对于盐的选择来说，可使用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠、柠檬酸钠等，目前前两者最广泛使用，前者最受欢迎。

PH影响值，进而影响蛋白质溶解度，在蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解度最小而容易沉淀出来，因此盐析时应将PH值调节在目的蛋白质的等电点附近。

在同离子强度溶液中，升高温度可使值下降，在保证蛋白质不失活的条件下，可加快盐析过程。

此外，蛋白质溶度对沉淀具有双重标准，蛋白质溶度越高，盐的饱和度极限越低，但杂蛋白的共沉淀现象也随之加重，故蛋白质浓度一般控制在2.5-3.0%。

6.2．为测定用硫酸铵盐析法分离某种蛋白质的最佳硫酸铵浓度，除采用本讲义设计的操作程序之外，请你设计另一种工作程序测定盐析目的蛋白质的硫酸铵最佳浓度，并指出两种方法的优缺点。

（1）称量法：

称取盐析完毕干燥后的粗蛋白提取物质量，建立硫酸铵饱和度—蛋白质质量曲线，得出硫酸铵盐析最佳饱和度。

（2）优缺点比较：

优点

缺点

称量法

方法简便，操作简单

误差大，不能准确确定目的蛋白的硫酸铵盐析最佳饱和浓度

SDS-PAGE电泳法

精确，能准确测定目的蛋白的硫酸铵盐析最佳饱和浓度

操作繁琐，试验时间长，实验花费成本较大

6.3聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？

指的是缓冲液离子成分的不连续性，pH的不连续性，凝胶浓度和孔径的不连续性及电位梯度的不连续性。

6.4电泳时的三个物理效应是什么？

是怎样造成的？

（1）样品浓缩效应

主要由缓冲液离子成分的不连续性，pH的不连续性，凝胶浓度和孔径的不连续性及电位梯度的不连续性等造成。

（2）电荷效应

在缩胶中，被分离物的各组分被浓缩，特别是浓缩胶与分离胶的分界处被高度浓缩，形成一个狭窄的高浓度区，但进入分离胶中，被分离物中各组分所带电荷不同，而有不同的迁移率，表面电荷多，迁移快，反之则慢。

因此被分离物按照电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排列

（3）分子筛效应

经过浓缩效应前导离子、被分离物和尾随离子均进入分离胶时胶pH值同使得前导离子与尾随离子迁移率相同再形成高电压所有物质同、均电压梯度下迁移时影响分子量大小和形状与其迁移率密切相关：

分子量小并且球型移动快

6.5电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？

为什么？

不可以。

上槽缓冲液最好每次更换，因为它直接接触样品，重复用可能会交叉污染，影响电泳效果。

下槽缓冲液可以重复用多次。

前提是电泳都不跑出去。

因为电泳的过程是从阴极到阳极，所以阳极缓冲液里面的杂质不会污染电泳胶。

但是如果电泳也很脏的话就要换了。

6.6上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？

主要目的是增加溶液的粘稠度，加样的时候更加容易操作而已。

直接沉到加样孔的底部。

6.7贮液配制及贮存应注意什么？

（1）见光易分解的溶液用棕色试剂瓶装，并在外面包裹锡纸

（2）不稳定的溶液应在4°C低温保存

6.8过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？

过硫酸铵——加速剂；70%乙酸——固定剂，脱色剂成分；考马斯亮蓝——染色剂