银杏叶提取物egb对ccl4肝损伤小鼠的mda含量以及sod活力的影响毕业论文设计.docx

资源描述

银杏叶提取物egb对ccl4肝损伤小鼠的mda含量以及sod活力的影响毕业论文设计.docx

《银杏叶提取物egb对ccl4肝损伤小鼠的mda含量以及sod活力的影响毕业论文设计.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《银杏叶提取物egb对ccl4肝损伤小鼠的mda含量以及sod活力的影响毕业论文设计.docx（23页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

银杏叶提取物egb对ccl4肝损伤小鼠的mda含量以及sod活力的影响毕业论文设计.docx

银杏叶提取物egb对ccl4肝损伤小鼠的mda含量以及sod活力的影响毕业论文设计

银杏叶提取物EGB对CCl4肝损伤小鼠的MDA含量以及SOD活力的影响

摘要目的：

探讨银杏叶提取物EGB（黄酮类）对CCl4肝损伤小鼠以MDA含量及SOD活力的影响，生产出一种有效保护肝脏的药物。

方法：

清洁级昆明种小鼠♀♂兼用，随机分为空白对照组、吐温对照组、模型对照组、联苯双酯阳性对照组、实验组（银杏叶提取物低浓度、银杏叶提取物中浓度、银杏叶提取物高浓度），用四氯化碳皮下注射法建立慢性肝损伤模型，分别用生理盐水或药物灌胃治疗。

检测肝组织中脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活力并加以探讨。

结果：

EGB能显著升高CCl4所致急性肝损伤小鼠其SOD活力，并可显著降低该模型小鼠肝组织中MDA的含量。

结论：

银杏叶提取物（黄酮类）对此模型小鼠的肝损伤具有显著的保护作用，可能与降低、抑制脂质过氧化反应以及抗自由基损伤有关.

关键词银杏叶提取物;CCl4肝损伤小鼠;MDA含量；SOD活力

近几年来由于大量有害物质的产生，人们可能在不经意间，接触大量有害物质，例如CCL4,CCL4致急性中毒性肝炎、肝中毒四氯化碳进入肝细胞后，使线粒体膜的脂质溶解，从而影响线粒体的结构和功能，使酶蛋白质的合成减少，造成酶的破坏，因而影响代谢功能和能量的合成，致死。

新观点认为细胞坏死的关键是由于四氯化碳抑制了细胞膜上钙泵活性，大量钙离子内流，堆积于细胞内的结果。

此种动物模型可观察到急性肝炎的糖、脂肪、胞色素等方面的代谢障碍、肝解毒功能障碍，磺溴酚纳滞留血清，转氨酶明显升高，迅速出现营养不良、肝脂肪化变性及坏死等形态学变化。

肝小叶中央坏死和肝细胞脂肪变性是其主要病变。

有一种阳性药联苯双酯，它是一种治疗肝炎的降酶药物，即可减轻因CCL4所致的肝脏损害，对CCL4所致的肝脏微粒体脂质过氧化，CCL4代谢为CO有抑制作用，对肝脏具有保护作用，虽治疗肝脏的药物很多，但效果不是很好。

近几年国内外学者对银杏叶药理进行了大量的研究，银杏（Ginkgobiloba）系银杏科银杏属落叶乔木，为中生代孑遗的稀有物种，被称为被子植物的“活化石”是我国特有植物。

20世纪以来，发现其主要药用成分为黄酮类和萜内酯类化合物。

药理试验表明银杏黄酮类化合物有使冠状血管及其他血管扩张的作用。

银杏黄酮有抗自由基、抑制脂质过氧化作用。

可直接清除02一、.OH一，捕捉脂化自由基、脂氧自由基和烷自由基等，通过对这些自由基起一种氢原子供用而终止自由基连锁反应链，从而阻止和抑制氧自由基反应和脂质过氧化的病理性加剧，减轻氧自由基和脂质过氧化损伤。

推测EGB对肝损伤也有保护作用。

本实验就是通过设计一系列的对比实验，研究EGB是否确实有此作用。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1药物

1.1.1.1银杏叶提取物（黄铜类）江苏同源堂生物工程公司批号：

老师帮填一下

临用时用0.1%吐温—80，蒸馏水配制成10mg/kg，40,mg/kg，160mg/kg低中高三个浓度。

1.1.1.2联苯双酯（15mg/丸）浙江医药股份有限公司新昌制药厂批号：

080603

临用时用蒸馏水配制成0.12%混悬液取80丸*15mg/丸=120mg（120mg→100ml水=0.12%）

1.1.1.3CCl4北京化工厂提供批号：

080121临用前用大豆油制成0.1%的四氯化碳油溶液。

1.1.2试剂

ALT试剂盒批号：

20100316；AST试剂盒批号：

20100317；SOD试剂盒批号：

20100317；MDA试剂盒批号：

20100317，均为南京建成生物工程研究所生产。

总蛋白测定试剂盒北京北化康泰临床试剂有限公司批号：

20091028

1.1.3实验动物

小白鼠清洁级昆明种♀♂兼用，体重24+2g，北京医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：

SCXK（京）2004-0001

1.1.4仪器

1.1.4.1电子称：

ACS-A-JJ交直流电子计价秤，中航第一集团太原航空仪表有限公司生产。

1.1.4.2721分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。

1.1.4.3.HH-60数显恒温搅拌水箱，苏州威尔实验用品有限公司生产。

1.1.4.4FZQ-2型漩涡混合器，竞速泰县医疗器械厂

1.1.4.5电子天平，BP310P德国赛多利斯生产。

1.1.4.6离心机（KDC-1044低速离心机），科大创新股份有限公司中佳分公司生产。

1.2实验分组与处理

1.2.1分组

1.2.1.1空白对照组

1.2.1.20.1%吐温对照组

1.2.1.3模型对照组

1.2.1.4联苯双酯阳性对照300mg/kg

1.2.1.5银杏叶提取物低浓度10mg/kg

1.2.1.6银杏叶提取物中浓度40mg/kg

1.2.1.7银杏叶提取物高浓度160mg/kg

1.2.2处理

3月15日，随即分为七组后，灌胃给药（0.25ml/10g体重），空白对照组、模型组给予等量蒸馏水，吐温对照组给予等量吐温，连续灌胃七天，灌胃前称一次体重，灌胃后第二天再次称重，然后第四天三次称重，称重后，除空白对照组及吐温对照组外，各组动物均腹腔注射0.1%CCl4溶液10ml/kg（取CCl430µl→30ml大豆油），第七天灌胃给药后停食。

16小时后解剖取出肝脏、脾。

1.3称肝脏、脾

脱臼处死小鼠，剖取肝脏、脾称重。

1.4肝组织中脂质过氧化指标及抗氧化活性的测定　

1.4.1MDA含量测定方式

MDA含量测定方式是在国内外众多测试方法的基础上改进的一种微量、快速、简便、准确、对操作人员健康无损害的测试方法。

通过测试可反映出血清（浆）、乳汁等细胞外液、红细胞、白细胞、培养细胞以及各种动植物的细胞水平及亚细胞水平的脂质过氧化物的量。

1.4.1.1丙二醛（MDA）的测定意义：

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸（PUFA），引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。

如：

醛基（丙二醛MDA）、酮基、羟基、羰基、氢过氧基可内过氧基，以及新的氧自由基等。

脂质过氧化作用不公把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。

因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。

氧自由基不但通过生物膜中多不饱和脂肪酸（PUFA）的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。

因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。

MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接的反应了机本细胞受自由基攻击的严重程度，通过SOD与MDA的结果分析有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。

1.4.1.2MDA试剂盒测试原理：

过氧化脂质降狗解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。

因底物为硫代巴比妥（TBA）所以此法称TBA法。

1.4.1.3测试所需仪器设备

可见光分光光度计，可调到95℃左右的恒温水浴箱（或者铝锅内放几个去掉盖子的易拉罐，将罐壁及底部穿数十个孔，以便水的进入，用来代替水浴箱。

），离心机。

1.4.1.4100T试剂盒组成与配制

1.4.1.4.1试剂一：

液体20ml×1瓶，室温保存。

（天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用）。

1.4.1.4.2试剂二：

液体12ml×1瓶，用时每瓶加340ml双蒸水混匀，4℃冷藏（注意不要碰到皮肤上）。

1.4.1.4.3试剂三：

粉剂×1支，用时将粉剂加入到90℃-100℃的热双蒸水60ml中，（在溶解过程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至60ml再加冰醋酸60ml，混匀，配好的试剂避光冷藏。

（冰醋酸自备注）

1.4.1.4.4标准品：

10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml×1瓶，4℃冷藏。

测试盒冷藏至少可保存一年。

[注]：

冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级即分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为99%以上。

1.4.1.550T试剂盒组成与配制：

1.4.1.5.1试剂一：

液体10ml×1瓶，室温保存。

（天冷时会凝固，每次测试前适当水浴加温以加速溶解，直至透明方可应用）。

1.4.1.5.2试剂二：

液体6ml×1瓶，用时每瓶加340ml双蒸水混匀，4℃冷藏（注意不要碰到皮肤上）。

1.4.1.5.3试剂三：

粉剂×1支，用时将粉剂加入到90℃-100℃的热双蒸水30ml中，（在溶解过程中可适当加热），充分溶解后用双蒸水补足至30ml再加冰醋酸30ml，混匀，配好的试剂避光冷藏。

（冰醋酸自备注）

1.4.1.5.4标准品：

10nmol/ml四乙氧基丙烷5ml×1瓶，4℃冷藏。

测试盒冷藏至少可保存一年。

[注]：

冰醋酸又名乙酸，一般的医药公司、化剂公司均有售，要购AR级即分析纯级的乙酸较好，乙酸含量为99%以上。

1.4.1.6规范操作方法：

1.4.1.6.1操作表：

标准管

标准空白管

测定管

测定空白管

10nmol/ml标准品（ml）

0.1

无水乙醇（ml）

0.1

测试样品（ml）

0.1

试剂一（ml）

0.1

混匀（摇动几下试管架）

试剂二（ml）

试剂三（ml）

50%冰醋酸

旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸）40分钟，取出后流水冷却，然后3500-4000转/分，离心10分钟，（3000转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀完全）。

取上清0.1ml，532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管的吸光度值。

1.4.1.6.2参考取样量：

血清（浆）取0.1-0.2ml。

低密度脂蛋白悬液取0.1-0.2ml。

食油取0.03ml,肝组织、心肌、肌肉组织、螺旋藻等，取5%或10%匀浆0.1-0.2ml较好。

1.4.1.6.3规范操作方法标准管吸光度：

当标准品取样量为0.1ml时，则标准管吸光度减去标准空白管的吸光度为0.065-0.070。

当标准品取样量为0.2ml时，则标准管吸光度减去标准空白管的吸光度为0.130-0.140。

1.4.1.6.4规范操作方法及简便操作方法中，若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间40分钟延长至80分钟，但您的同一课题中MDA的检测都必须延长至80分钟，以免造成批间差异。

1.4.1.6.5计算公式：

①血清（浆）中MDA含量计算公式：

血清（浆）中MDA含量测定管吸光度-测定空白管吸光度

（nmol/ml）=-------------------------------×标准品浓度×样本测定前

标准管吸光度-标准空白管吸光度（10nmol/ml）稀释倍数

②组织中MDA含量计算公式：

测定管吸光度-测定空白管吸光度

组织中MDA含量=———————————————×标准品浓度÷蛋白含量

（nmol/mgprot）标准管吸光度-标准空白管吸光度（10nmol/ml）（mgprot/ml）

nmol/mgprot为纳摩尔/毫克蛋白

取上清100µl,测定MDA含量。

1.4.2SOD活力的测定方法

1.4.2.1100管试剂盒的组成与配制：

1.4.2.1.1试剂一：

贮备液：

10ml×1瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用）；

试剂一应用液的配制：

用时每瓶加蒸馏水稀释至100ml，4℃保存6个月。

1.4.2.1.2试剂二：

液体10ml×1瓶，4℃保存6个月。

1.4.2.1.3试剂三：

液体10ml×1瓶，4℃保存6个月。

1.4.2.1.4试剂四：

液体350ul×2支，4℃保存不可冷冻；4号稀释液10ml×1瓶，4℃保存6个月。

用时两者按1：

14稀释，需多少配多少。

配好的试剂四4℃保存，不可冷冻。

注：

所用吸嘴为一次性吸嘴。

1.4.2.1.5试剂五：

粉剂×1支，用时加70℃-80℃热双蒸水75ml溶解后备用，若加热过程中水分

蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至75ml，配好后试剂避光4℃冷藏6个月。

1.4.2.1.6试剂六：

粉剂×1支，用时加蒸馏水75ml溶解后备用，配好后试剂避光4℃避光冷藏3

个月。

显色剂的配制：

按试剂五：

试剂六：

冰乙酸=3：

3：

2的体积比配显色剂，4℃避光冷藏3个月。

1.4.2.250管试剂盒的组成与配制：

1.4.2.2.1试剂一：

贮备液：

5ml×1瓶（天冷时或放冰箱会有部分析出，需热水浴溶解后再用）；

试剂一应用液的配制：

用时加蒸馏水稀释至50ml，4℃保存6个月。

1.4.2.2.2试剂二：

液体5ml×1瓶，4℃-10℃保存6个月。

1.4.2.2.3试剂三：

液体5ml×1瓶，4℃-10℃保存6个月。

1.4.2.2.4试剂四：

液体350ul×1支，4℃保存，不可冷冻；4号稀释液5ml×1瓶，4℃保存6个月。

用时二者按1：

14稀释，需多少配多少。

配好的试剂四4℃保存，不可冷冻。

注：

所用吸嘴为一次性吸嘴。

1.4.2.2.5试剂五：

粉剂×1支，用时加70℃-80℃蒸馏水37.5ml溶解后备用，若加热过程中水分

蒸发减少，此时必须用蒸馏水补充至37.5ml，配好后的试剂避光4℃冷藏保存6

个月。

1.4.2.2.6试剂六：

粉剂×1支，用时加蒸馏水37.5ml溶解后备用，配好后试剂避光4℃冷藏保存6

个月。

显色剂的配制：

按试剂五：

试剂六：

冰乙酸=3：

3：

2的体积比配显色剂，4℃避光冷藏3个月。

1.4.2.3总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的测定

1.4.2.3.1操作

总SOD（T-SOD）活力的测定：

试剂（ml）

测定管

对照管

试剂一（ml）

1.0

样品（ml）

0.05

蒸馏水（ml）

0.05

试剂二（ml）

0.1

试剂三（ml）

0.1

试剂四（ml）

0.1

用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟

显色剂（ml）

混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。

1.4.2.3.2计算：

1.4.2.3.2.1血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算：

（1）定义：

每亳升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

（2）血清（浆）、心肌灌流液、肾透析液、细胞培养液等总SOD活力计算公式：

总SOD活力=对照管吸光度-测定管吸光度反应体系的样本测试前的

（U/ml）-------------------------÷50%×稀释倍数×稀释倍数

对照管吸光度

1.4.2.3.2.2组织匀浆中总SOD活力计算：

（1）定义：

每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。

（2）计算公式：

组织匀浆中SOD活力对照管吸光度-测定管吸光度反应液总体积

（U/ml）=--------------------------÷50%×-----------------÷组织中蛋白含量对照管吸光度取样量（mgprot/ml）

取100mg肝脏加1ml生理盐水，研制匀浆，离心3000转，20分钟，取上清30µl，测定SOD的活力；

2结果

2.1体重、肝重及脾重

组别

大

号

编

号

体重

（g）3.16

体重

（g）3.18

体重

（g）3.21

肝重（g）

脾重（g）

空白对照

♀1

0.964

0.064

0.741

0.093

0.991

0.121

0.970

0.102

0.646

0.055

1.020

0.068

♂1

0.874

0.099

1.067

0.116

1.256

0.195

1.250

0.154

1.190

0.113

吐温对照

♀1

1.077

0.098

0.858

0.106

0.735

0.061

0.865

0.080

0.767

0.081

0.908

0.053

♂1

1.420

0.126

1.116

0.150

1.383

0.092

1.126

0.089

♀1

1.007

0.106

0.990

0.038

模型对照

0.898

0.112

1.070

0.130

0.905

0.052

1.195

0.214

♂1

1.439

0.142

1.129

0.054

1.492

0.172

1.034

0.075

1.377

0.126

♀1

1.078

0.097

1.095

0.167

阳性对照

0.911

0.055

0.806

0.048

0.833

0.045

♂1

1.144

0.122

1.798

0.092

1.428

0.199

1.270

0.129

1.414

0.133

♀1

0.831

0.145

0.977

0.114

银低

0.820

0.082

1.004

0.081

0.911

0.085

1.142

0.099

♂1

1.134

0.098

1.052

0.084

1.162

0.073

1.176

0.142

1.208

0.081

♀1

0.884

0.044

0.972

0.098

银中

1.126

0.156

0.824

0.073

1.039

0.107

♂1

1.251

0.101

1.195

0.101

1.120

0.087

1.094

0.109

1.087

0.111

1.129

0.093

♀1

1.140

0.194

0.924

0.122

银高

1.081

0.141

0.925

0.089

0.921

0.102

♂1

1.393

0.149

1.281

0.120

1.170

0.128

1.376

0.097

1.207

0.115

1.366

0.138

2.2小鼠肝组织中MDA含量的变化

性别

组别

剂量

MDA（nmol·mgprotein-1）

雌

空白

—

2.71±0.15

吐温

0.1%Tween-80

2.05±1.15

模型

—

6.12±2.83††,**

阳性药

30mg·kg-1

3.14±1.32※

10mg·kg-1

1.89±0.83※※

40mg·kg-1

1.88±1.29※※

160mg·kg-1

1.44±0.50※※

雄

空白

—

1.85±0.49

吐温

0.1%Tween-80

1.87±0.48

模型

—

3.05±1.85

阳性药

30mg·kg-1

2.54±1.39

10mg·kg-1

1.82±0.24

40mg·kg-1

1.27±0.32※

160mg·kg-1

2.32±1.13

EGB对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脂质过氧化产物的影响（n=5）

EffectofGPonlipidperoxi

展开阅读全文