第一章蛋白质化学.docx
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第一章蛋白质化学
第一章蛋白质化学
第一节蛋白质的概述
一、前言
二、蛋白质的定义(重点)
三、蛋白质的生物学意义(重点)
四、蛋白质的组成(了解掌握)
一、前言
构成生物体的最基本的结构物质功能物质、参与所有生命活动。
占细胞质量50%左右,每个细胞中含几百万个蛋白质分子。
发展史:
1838年Muller研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后,发现它们均可以用C40H62N10O12来表示,命名为"Protein"(意为totakethefirstplace),并发展成"基团"学说
19世纪末从蛋白质水解产物分离得到了13种氨基酸,基团
学说消声匿迹
1902年Fischer,Hofmeister同时提出肽键理论
1924年Svedberg发明超离心机
1930年代Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽
1950年Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位:
α-螺旋和β-折叠
1953年Sanger确定了牛胰岛素的一级结构
1958年Perutz&Kendrew用X光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构
1961年Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其立体结构
1980年代蛋白质工程的兴起
1997年蛋白组研究的概念
1999年蛋白质芯片技术出现
二、蛋白质的定义(重点)
由许多不同的L-α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键(肽键)缩合而成的,具有稳定的构象(空间结构)并具有特写功能的生物大分子。
三、蛋白质的生物学意义(重点)
构成生物体的重要组成成分
生物学意义:
特异性功能
共性
外源蛋白质的开发利用。
叶蛋白、海藻蛋白
特异性功能:
载体、运输功能酶的催化作用抗体、干扰素激素,如生长激素、胰岛素运动的功能,肌球蛋白与肌动蛋白的滑动
接受信息传递信息的载体
毒蛋白共性:
能量来源
缓冲效应及平衡渗透压效应
四、蛋白质的组成(掌握)
1.元素组成部分
(C:
50-55%,H:
6-8%,O:
21-29%,N:
15-18%,S:
0-3%,P,金属)
N含量体现生物体的含N量,相当均衡平均为16%,即每100g蛋白质含16g氮,也即每克氮相当于6.25g蛋白质,
粗蛋白测定(凯式定氮法)
1gN=6.25g蛋白质
2.化学组成
简单蛋白质:
水解产物为AA
结合蛋白质:
水解产物为AA,糖等其他组成
3.构成蛋白质的基本单位:
氨基酸,175种中20种可构成蛋白质
(第一色氨酸可作用杀菌剂)
4.蛋白质种类繁多的原因:
n120=20*1018
第二节氨基酸化学
一.氨基酸的定义:
含有氨基的羧酸
结构特点
理化特点:
可溶性、旋光性、味感
显色反应氨基酸(aminoacid)的结构通式
(L-)二、构成蛋白质的氨基酸的结构特点与分类(了解掌握)
(一)结构特点
1.20种天然氨基酸均为α-氨基酸,且均为L-型
2.除甘氨酸外Cα原子为手性碳(不对称碳原子)
①有旋光性,左旋(-)右旋(+)
②D-型和L-型两种立体异构体
构成蛋白的AA均为L-α-AA
(二)分类:
以侧链R-分类
R基酸碱性:
中性AA,(弱酸性pH<7),酸性AA(天冬氨酸、谷氨酸),碱性AA(组氨酸、精氨酸,赖氨酸)
R基化学结构:
脂肪族AA,芳香族AA(苯丙氨酸、酪氨酸),杂环AA(组氨酸、色氨酸),杂环亚氨基酸(脯氨酸)
R基带电性、极性:
1、非极性中性R基AA:
(9种)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸,苯丙氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸
2、不带电极性R基AA:
(6种)丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、谷氨酰氨
3、带电荷极性R基AA:
(1)正电荷(3种):
组氨酸、赖氨酸、精氨酸
(2)负电荷(2种)(不含必需氨基酸):
谷氨酸、天冬氨酸
三、人体必需氨基酸:
定义:
人体不能合成或合成速度不能满足机体需要,必须从食物中直接获得,称为必需氨基酸(essentialaminoacid,EAA)。
几种不常见的构成蛋白质的氨基酸
蛋白质中的稀有氨基酸
是常见氨基酸经过化学修饰的衍生物,在蛋白质合成后形成的。
如:
5-羟基赖氨酸,N-甲基赖氨酸,3,5-二碘酪氨酸。
胱氨酸、羟赖氨酸、羟谷氨酸(各蛋白质形成中的化学修饰,衍生而来)
非蛋白质氨基酸
不参与蛋白质的组成,以游离状态存在于生物体中,多为α-氨基酸的衍生物,也有β-,γ-,δ-氨基酸。
如β-丙氨酸,γ-氨基丁酸。
四、氨基酸的重要理化性质(重点)
物理性质
化学性质
(一)物理性质:
1.溶解性:
为晶体均溶于水,但溶解度差异大,酸或碱液中可溶,有机溶剂不溶。
可利用该性质分离氨基酸。
2.熔点:
200℃以上,两性解离导致
3.旋光性:
L-型,不对称碳原子,除甘氨酸均有旋光性。
4.光吸收的性质:
构成天然蛋白质的20种氨基酸在可见光均无吸收,在紫外光λ=280nm时色氨酸、酪氨酸及脯氨酸有吸收,且是测定蛋白质浓度的基础。
5.味感:
D-型AA多甜味,如D-色氨酸甜度=40蔗糖
L-型AA味感复杂
苦味:
甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸;
咸味:
组氨酸;
酸味:
如谷氨酸,天冬氨酸;
鲜味:
如谷氨酸以及天冬氨酸的盐类。
(二)化学性质
1、两性解离与等电点(isoelectricpoint,pI)
两性离子指:
同一个氨基酸分子上带有能放出质子的-N+H3正离子和能接受质子的-COO-负离子。
当两性离子溶于水时,其正负离子都能解离。
等电点(pI)
等电点(pI)的定义:
对某种氨基酸在某一特定的pH时,氨基酸以两性离子的形式存在,正负电荷相等,净电荷为零,在电场中不向任何一方移动。
此时,溶液的pH称为该氨基酸的等电点。
是氨基酸处于电中性的pH值。
利用在电场中静止可以使其水溶性明显下降,可用于制备氨基酸
等电点的特点:
绝大多数在5-6之间
酸性在2-3
碱性在9-11。
组氨酸pI=7.59。
等电点时溶解度最低。
2.显色反应
1.与茚三酮的反应(定性、定量)
反应特点:
(1)氨基和羧基同时参与;
(2)茚三酮为强氧化剂;
(3)脯氨酸和羟脯氨酸反应(黄色),其余反应(蓝紫色);
(4)蓝紫色在570nm处吸收,黄色在440nm处吸收;
(5)检出范围:
0.5~50ug/l。
2.Sanger反应(与2,4-二硝基氟苯DNFB反应):
用于蛋白质N端的测定
反应特点:
(1)与氨基反应;呈现黄色
(2)NH2+DNFBDNP-AA+游离AA
(DNP-AA溶解度与其他AA不同,可以用乙醚抽提)
应用:
蛋白质N端的测定
用于测定胰岛素的一级结构
5-二甲氨基奈磺酰氯代替DNFB,产物用荧光检测
3.Edman反应(与异硫氰酸苯酯反应)
反应特点:
1.与氨基的反应;
2.可以不断重复。
应用:
肽类和蛋白质的氮端测定,多肽顺序自动分析仪
改良方法:
DNS-Edman反应:
5-二甲基苯硫酰氯取代DNFB,用于微量测定:
10-12mol,1pmol
Sanger反应与Edman反应
最初用于蛋白质中的氨基酸测序
第三节蛋白质的分子结构
104-106道尔顿(分子量)
化学结构:
一级结构(primarystructure)
空间结构(高级结构):
二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)
1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次
1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。
介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构
(二级结构的组合)和结构域(在空间上相对独立)
这两个层次。
一、基本问题——肽(了解掌握)
肽(peptide):
一个AA的α一羰基与另一个AA的α一氨基脱水缩合而成的化合物。
肽键(peptidebond):
1分子氨基酸的α-羧基与另一分子的α-氨基之间缩水形成的键,又称酰胺键。
20以下——高聚肽低聚肽,
20以上——多肽
二肽、多肽链、主链、侧链
氨基酸残基、N-端、C-端
二硫键(disulfidebonds):
-SH+-SH→-S―S―
蛋白质就是由几十到几百甚至几千个氨基酸分子借肽键相互连接起来的多肽链。
肽类物质的特点:
肽类中的氨基树酸单元称“氨基酸残基”
具有特定的AA的排列顺序
有一个-N端和一个-C端
具有一定的方向性,-N端走向-C端
肽键的特点:
共价键,具有共轭性
原子共处于一个平面(肽平面,酰胺平面)
肽平面:
由组成肽键的四个原子能及相临的两个Cα组成的平面
具有百分之40双键的性质,旋转构象受到限制
以反式结构出现肽链中的肽平面生物活性肽:
生物体内具有特殊生物活性的肽。
是一种游离状态,分子量较小的肽类。
化学信使
脑五肽:
镇痛
谷胱甘肽--SH生物体内抗氧化剂
苦瓜肽:
植物胰素
二、蛋白质的一级结构(重点)
AA在多肽链中的排列顺序。
最小单位为氨基酸。
具体内容:
①AA的顺序(成键方式,氨基酸种类,氨基酸数目)
②肽链的数量级
③二硫键的数量,位置
二硫键(disulfidebonds)
肽链中相应部位上的两个半胱氨酸残基脱氢连接而成,是连接肽链内和肽链间的主要桥键。
在蛋白质分子中起着稳定肽链空间结构的作用,与生物活性有关。
一般数目越多,蛋白质结构越稳定。
生物体内起保护作用的角、皮、毛发的蛋白质中二硫键最多。
一级结构的测定
1.原则将大化小,逐段分析
2.步骤P18蛋白质一级结构测定的步骤
1、蛋白质的分离纯化
2、二硫键的拆分与保护
3、(亚基分离)
4、多种方法的部分水解
5、分离水解后得到的多肽
6、测序
7、重叠OverlappingN末端和C末端测序法
N末端:
1、Sanger法
2、Edman法
3、Dansylchloride/Edman组合法
4、酶降解法
C末端:
1、肼法
2、3H标记法
3、酶降解法
几种常见的多肽化学结构
(1)谷胱甘肽(glutathione,GSH)
(2)胰岛素三、蛋白质的空间结构(*重点)
蛋白质的空间结构通常称为蛋白质的构象(高级结构),是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽键的走向。
空间结构是一级结构为基础的。
二级结构
多肽链的主链在空间螺旋,折叠而成
氢键在链内或链间作用,导致二级结构出现α-螺旋β-折叠β-转角,自由加转
(一)α-螺旋(α-helix)
(存在于球型蛋白)
蛋白质主链的一种典型结构方式。
存在于羊毛等纤维状蛋白质(α-角蛋白),普遍存在于球型蛋白质中
特点:
1.肽内氢键形成的,由第一个AA的-CO与第五个AA的-NH2形成氢键,氢键走向与分子轴平行
2.肽平面以Cα为原点进行盘旋形成右手-螺旋
3.ns表示螺旋结构,典型的α螺旋ns=3.613,表示见P21
4.由于一级结构不同,蛋白质α-螺旋比例不同。
例如:
角蛋白100%,肌红蛋白97%,溶菌酶10%,
稳定性的影响因素
多肽链上有脯氨酸,即中断,产生一个“结节”。
原因在于脯氨酸的α-亚氨基上的氢原子参与肽键的合成后,就没有多余的氢原子形成氢键了。
带有相同电荷的氨基酸出现在多肽链上,同性电荷相斥影响α-螺旋形成。
所带R基比较大,空间结构太大也影响α-螺旋形成。
螺旋上升一圈为3.6个氨基酸,沿轴上升0.54nm
相邻螺旋间形成氢键,取向平行于中心轴
右手螺旋
影响因素:
一级结构、侧链大小、电荷
(二)β-折叠(β-pleatedsheet)
(球状,纤维状蛋白质均有)
链间的氢键形成:
由两条或以上的肽链形成,氢键走向与分子轴交叉;
β-折叠有平行β-折叠,反平等β-折叠(相对稳定)。
特点
a.长轴平行
b.肽链间肽键形成氢键
c.有平行、反平行之分
平行:
所有肽链的N端都处在同一端。
是同方向的。
(β-角蛋白)
反平行:
肽链的N端一顺一倒的排列。
(丝心蛋白)
四、氨基酸的重要理化性质(*重点)
物理性质
化学性质
(一)物理性质:
1.溶解性:
2.熔点:
3.旋光性:
4.光吸收的性质:
5.味感:
D-型AA多甜味L-型AA味感复杂
(二)化学性质
1、两性解离与等电点
2.显色反应
1.与茚三酮的反应(定性、定量)
2.Sanger反应(与2,4-二硝基氟苯DNFB反应):
用于蛋白质N端的测定
3.Edman反应(与异硫氰酸苯酯反应):
用于蛋白质N端的测定
第三节蛋白质的分子结构
一、基本问题
肽:
一个AA的α一羰基与另一个AA的α一氨基脱水缩合而成的化合物。
肽键(peptidebond):
1分子氨基酸的α-羧基与另一分子的α-氨基之间缩水形成的键,又称酰胺键。
二肽、多肽链、主链、侧链
氨基酸残基、N-端、C-端
二硫键(disulfidebonds):
-SH+-SH→-S―S―
蛋白质就是由几十到几百甚至几千个氨基酸分子借肽键相互连接起来的多肽链。
肽类物质的特点:
肽类中的氨基树酸单元称“氨基酸残基”
具有特定的AA的排列顺序
有一个-N端和一个-C端
具有一定的方向性,-N端走向-C端
二、蛋白质的一级结构(重点)
AA在多肽链中的排列顺序。
最小单位为氨基酸。
具体内容:
①AA的顺序(成键方式,氨基酸种类,氨基酸数目)
②肽链的数量级
③二硫键的数量,位置
二硫键(disulfidebonds)
两个半胱氨酸残基脱氢连接而成,是连接肽链内和肽链间的主要桥键。
在蛋白质分子中起着稳定肽链空间结构的作用,与生物活性有关。
三、蛋白质的空间结构(重点)
蛋白质的空间结构通常称为蛋白质的构象(高级结构),是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽键的走向。
空间结构是一级结构为基础的。
二级结构
多肽链的主链在空间螺旋,折叠而成
氢键在链内或链间作用,导致二级结构出现α-螺旋β-折叠β-转角,自由加转
(一)α-螺旋(α-helix)特点:
1.肽内氢键形成的,由第一个AA的-CO与第五个AA的-NH2形成氢键,氢键走向与分子轴平行
2.肽平面以Cα为原点进行盘旋形成右手-螺旋
3.ns表示螺旋结构,典型的α螺旋ns=3.613,表示见P21
4.由于一级结构不同,蛋白质α-螺旋比例不同。
例如:
角蛋白100%,肌红蛋白97%,溶菌酶10%,
稳定性的影响因素
多肽链上有脯氨酸,即中断,产生一个“结节”。
原因在于脯氨酸的α-亚氨基上的氢原子参与肽键的合成后,就没有多余的氢原子形成氢键了。
带有相同电荷的氨基酸出现在多肽链上,同性电荷相斥影响α-螺旋形成。
所带R基比较大,空间结构太大也影响α-螺旋形成。
螺旋上升一圈为3.6个氨基酸,沿轴上升0.54nm
相邻螺旋间形成氢键,取向平行于中心轴
右手螺旋
影响因素:
一级结构、侧链大小、电荷
(二)β-折叠(β-pleatedsheet)
(球状,纤维状蛋白质均有)
链间的氢键形成:
由两条或以上的肽链形成,氢键走向与分子轴交叉;
β-折叠有平行β-折叠,反平等β-折叠(相对稳定)。
特点
a.长轴平行
b.肽链间肽键形成氢键
c.有平行、反平行之分
平行:
所有肽链的N端都处在同一端。
是同方向的。
(β-角蛋白)
反平行:
肽链的N端一顺一倒的排列。
(丝心蛋白)
(三)β-转角(球状蛋白质P20)
多肽链中的一段主链骨架以180°回转。
第一个AA>C=O与第四个AA的>NH形成氢键
甘氨酸残基侧链为氢原子,脯氨酸残基环状侧链的固定取向都有利于形成β-转角。
(四)自由回转(无规卷曲)
没有一定规律的松散肽链结构
酶的活性中心
(五)超二级结构(supersecondarystructure)
与结构域(structuraldomain)(过渡态)
超二级结构:
在球状蛋白质中,由相邻的二级结构单元组合,相互作用,形成有规则的αα,ββ,αβα,βββ,βαβ,空间上可辨认的二级结构组合体,充当三级结构的构件。
结构域:
在超二级结构基础上进一步螺旋,折叠,组装成几个相对独立的三维实体。
近似球状的结构,只具有部分生物功能。
结构域与功能域的关系:
对于小分子多肽链pro结构域即为三级结构(功能域)
对于大分子多肽pro通常几个结构域构成三级结构
结构域在空间上相对独立
免疫球蛋白
蛋白质的三级结构:
定义:
多肽链上的所有原子在三维空间的分布,
球状pro具亲水性
在二级基础上,侧链间的作用
作用力:
次级键(弱键),
主要有盐键、疏水键、氢键、范德华力
三级结构共同特点:
(1)外圆、中空
(2)疏水基在内
(3)亲水基在外
蛋白质的四级结构:
指两条或多条肽链以特殊方式结合成为有生物活性的蛋白质。
两条多肽链以上的pro具有四级结构,肽链之间在空间上相互作用(非共同键)形成的称为寡聚蛋白。
该种肽链就称为该蛋白质的亚基。
四、蛋白质分子中的共价键与次级键(重点)
共价键(一级结构):
肽键、二硫键
次级键(高级结构):
氢键、疏水键、盐键、范德华力
氢键:
维持蛋白质二级结构的作用力。
存在于多肽链内、链间和氨基酸侧链极性基团之间。
疏水键:
稳定蛋白质三级结构。
多肽链上疏水性较强的氨基酸(缬、亮、异亮、苯丙等)的非极性侧链避开水相自相粘附聚集,形成空穴。
盐键:
蛋白质中正、负电荷的侧链基团相互接近,通过静电吸引形成。
范德华力:
分子间的吸引力。
一级结构化学键:
肽键(键内共价键),二硫键(链间共价键)——桥键
二级结构化学键:
氢键
三级结构化学键:
氢键,疏水键,盐键,范德华力
四级结构化学键:
范德华力,盐键
第四节蛋白质分子结构与其种类、生物功能的关系(了解掌握)
一、蛋白质一级结构与功能的关系——
功能体现的前提条件
二、蛋白质高级结构与功能的关系——
功能体现的必要条件
一、蛋白质一级结构与功能的关系
二级者之间的关系,多肽链中不同部位的AA残基与生物功能的关系
(一)分子病,某种蛋白质分子结构的AA排列顺序与正常的蛋白质有所不同的遗传病
例:
镰刀型贫血症,血红蛋白β链的N端第六个AA由极性的谷氨酸被疏水性的缬氨酸取代,细胞出现镰刀型,溶血现象导致贫血。
(二)多肽键的AA残基的化学修饰与切割。
(胰岛素,酶原)
酶在封闭或合成过程中,没有活性,激素也如此
例:
胰岛素,合成时分子量2倍大,无活性,经切割实验(两次),才可具活性,有降血糖作用
(三)同源蛋白质
在不同生物体中实现同一功能的蛋白质
例;细胞色素C(60多种生物体)
27个AA残基均有,共有,不变——实现生物功能的不变残基
其余的为可变AA残基。
通过改变程度判断亲缘关系
例:
胰岛素51个中,22个不变残基
二、蛋白质高级结构与功能的关系——功能体现的必要条件
别构效应(变构效应)诱导使蛋白质构象发生变化,更适合于体现其生物功能
例:
血红蛋白
总结:
1.蛋白质的化学组成(AA的排列顺序)决定高级结构,从而体现生物功能
2.高级结构直接决定生物功能
3.每种蛋白质具有特定的化学组成,所以才具有特定的生物功能
肽键的特点:
共价键,具有共轭性
原子共处于一个平面(肽平面,酰胺平面)
肽平面:
由组成肽键的四个原子能及相临的两个Cα组成的平面
具有百分之40双键的性质,旋转构象受到限制
以反式结构出现
二、蛋白质的一级结构(重点)
AA在多肽链中的排列顺序。
最小单位为氨基酸。
具体内容:
①AA的顺序(成键方式,氨基酸种类,氨基酸数目)
②肽链的数量级
③二硫键的数量,位置
二硫键(disulfidebonds)
肽链中相应部位上的两个半胱氨酸残基脱氢连接而成,是连接肽链内和肽链间的主要桥键。
在蛋白质分子中起着稳定肽链空间结构的作用,与生物活性有关。
一般数目越多,蛋白质结构越稳定。
生物体内起保护作用的角、皮、毛发的蛋白质中二硫键最多。
三、蛋白质的空间结构(重点)
蛋白质的空间结构通常称为蛋白质的构象(高级结构),是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽键的走向。
空间结构是一级结构为基础的。
二级结构
多肽链的主链在空间螺旋,折叠而成
氢键在链内或链间作用,导致二级结构出现α-螺旋β-折叠β-转角,自由加转
(五)超二级结构(supersecondarystructure)
与结构域(structuraldomain)(过渡态)
超二级结构:
在球状蛋白质中,由相邻的二级结构单元组合,相互作用,形成有规则的αα,ββ,αβα,βββ,βαβ,空间上可辨认的二级结构组合体,充当三级结构的构件。
结构域:
在超二级结构基础一进一步螺旋,折叠,组装成几个相对独立的三维实体。
近似球状的结构,只具有部分生物功能。
结构域与功能域的关系:
对于小分子多肽链pro结构域即为三级结构(功能域)
对于大分子多肽pro通常几个结构域构成三级结构
蛋白质的三级结构:
定义:
多肽链上的所有原子在三维空间的分布,
球状pro具亲水性
在二级基础上,侧链间的作用
作用力:
次级键(弱键),
主要有盐键、疏水键、氢键、范德华力
蛋白质的四级结构:
指两条或多条肽链以特殊方式结合成为有生物活性的蛋白质。
两条多肽链以上的pro具有四级结构,肽链之间在空间上相互作用(非共同键)形成的称为寡聚蛋白。
该种肽链就称为该蛋白质的亚基。
四、蛋白质分子中的共价键与次级键(重点)
共价键(一级结构):
肽键、二硫键
次级键(高级结构):
氢键、疏水键、盐键、范德华力
一级结构化学键:
肽键(键内共价键),二硫键(链间共价键)——桥键
二级结构化学键:
氢键
三级结构化学键:
氢键,疏水键,盐键,范德华力
四级结构化学键:
范德华力,盐键
第五节蛋白质的性质
一、蛋白质的分子大小(了解掌握)
二、蛋白质的两性离解和电泳现象(重点)
三、蛋白质的胶体性质(了解掌握)
四、蛋白质的沉淀作用(重点)
五、蛋白质的变性(重点)
六、蛋白质的紫外吸收(了解掌握)
七、蛋白质的颜色反应(了解掌握)
一、蛋白质的分子大小(了解掌握)
蛋白质的分子量104-106……107
分子量的测定方法:
1.沉降渗析法(超离心法)
2.凝胶过滤法
3.SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法
4.质谱法
5.渗透压法
分子量测定方法:
1.沉降渗析法(超离心法60000-80000转/分):
根据pro颗粒的沉降系数S,扩散系数D,R:
气体常数,T:
绝对温度,V:
溶质特异性体积,ρ:
溶剂密度
M=RST/[D(1-Vρ)]
2.凝胶过滤法:
计算收集到的洗脱液的体积。
V=k+clogM
3.SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法:
pro在电泳中的迁移速率。
d=k+clogM
4.质谱法:
利用高能带电粒子将pro从一金属支持物上释放出来
5.渗透压法:
M=cRT/Π
6.光散射法: