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有无藻红蛋白的微囊藻株的16srDNA序列与系统发育分析

ShigetoOtsuka，ShoichiroSuda,RenhuiLi,MasayukiWatanabe,HiroshiOyaizu,SatoshiMatsumoto,MakotoM.Watanabe

摘要

通过测定16SrDNA序列（16SrRNA基因），对含有五个变种和两种藻胆色素的15株微囊藻进行了系统发育分析。

所有的序列显示出了较高的相似性，不同形态与类型的藻胆素之间，有些甚至100%的相似。

从中可以推导出系统进化树与有无藻红蛋白的微囊藻株之间的密切关系。

数据显示微囊藻的表型不一定反映其发展史，因此需要重新构建当前物种级别间的分类。

关键字:

蓝藻；微囊藻；16SrDNA；分类

1.介绍

微囊藻属是一种有毒且能形成水华的蓝藻。

根据伯杰氏细菌鉴定手册（第九版）[1]可知，微囊藻的特点是具有气泡，细胞形状呈球形，倾向于形成聚集体或群体，有不定形的粘液或者胶被，无藻红蛋白等等。

大部分物种是满足这些标准的，近年来[2]在日本海域区分了六个物种：

绿色微囊藻（A.Brown）,惠氏微囊藻（Komaèrek）,铜绿微囊藻（Kuëtzing）,M.挪氏微囊藻（Komaèrek）,鱼害微囊藻和水华微囊藻（Wittrock）.Komaèrek并没有将鱼害微囊藻和水化微囊藻区分开[3]。

“形态”一词用于对微囊藻种类进行分类，它包括细胞的大小，菌落的形态，和胶被的特性。

尽管形态分类的正确性总是受到质疑，但目前却没人能解答。

最近对四株以藻红蛋白为藻胆素的铜绿微囊藻进行了分离。

虽然藻红蛋白的占有率不符合上面所提到的标准的[1]，但除却藻胆素的成分不同之外，这些生物有着相同的作为微囊藻的分类特征。

据观察这些菌株的菌落形态与铜绿微囊藻所具有的形态是相同的。

然而，这些菌株是否应该根据形态特征归类为铜绿微囊藻或者根据藻胆素成分不同而被归类为新物种却还不能确定。

应用分子遗传学分析已成为蓝藻分类的一种重要方法。

以16SrDNA为基础的系统进化分析法是在细菌的分类中广泛使用的一种工具，该方法的优越性也已被证实[5]。

Neilan[6]等人用这个方法来探讨微囊藻的种间关系。

然而，在微囊藻属中他们没有找到任何系统发育与形态特征之间的相关性，而且有、无藻红蛋白的菌株之间的亲缘关系也没有检查。

在本文中，我们探讨了微囊藻株的16SrDNA序列和微囊藻形态的系统发育分析，然后讨论是否藻胆素成分和形态特征的不同会影响系统发育。

2.材料与方法

2.1.蓝藻文化

菌株的研究如下：

微囊藻4A3,4B3,T1-4,和T17-1;绿色微囊藻TAC17和TAC78;铜绿微囊藻TAC71,TAC86,和TAC170;挪氏微囊藻TAC20andTAC65;和鱼害微囊藻TAC48和TAC91.在我们以前的研究中四株微囊藻全部是被隔离的[4]并均含有藻红蛋白，而其他不含有藻红蛋白的则来自日本筑波国立科学博物馆的藻类收藏。

该菌株的来源：

中国（微囊藻4A3和4B3），泰国（微囊藻t1-4和t17-1）和日本（其他菌株）。

这些菌株中除了4B3和T17-1均是无菌的。

将该菌株培养在MA[7]培养基中，温度为25±1℃，周期是12:

12L/D，同时用光子通量密度为30µmolmˉ¹sˉ¹的日光灯的进行照射。

2.2.引物设计

以蓝藻的16SrDNA序列为基础，重新设计了扩增和测序的引物，但不包括被Neilan[8]重新修复的引物23SR.两对扩增的引物，msr-s1f和msr-s2r序列，在基因数据库中进行比对[9]的时候显示出高特异性。

无菌株的扩增引物是msr1f和23sr，而非无菌株的扩增引物是两对msr1f和msr-s2r，和msrs1f和23sr。

所有的引物都是由由日本粉米尔斯有限公司商业合成。

（神奈川，日本）。

2.3.聚合酶链反应扩增和测序

依据palinska等人提取的DNA聚合酶链反应（PCR）的模板[10]，从被提取的DNA中扩增16SrDNA序列。

Pcr进行的条件是，50-or100-µl的反应混合物，0.05µl的耐热扩增DNA聚合酶（PerkinElmer,Branchburg,NJ,USA），PerkinElmer提供的缓冲液，0.2mM的dNTPs，0.5uM的引物，0.01^0.05µlˉ¹的基因组DNA溶液（100^500ngµlˉ¹），1.5mM处理过的氯化镁。

该反应在一个接地的热循环仪（Hybaid,Teddington,Middlesex,UK）中运行，94℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火30s，72℃延伸1分钟s，循环30次，最后72℃延伸3分钟。

使用microspin1S-400HR柱（PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden）纯化扩增产物，用已被荧光标记引物的热循环测序试剂盒进行循环测序。

（AmershamLifeScience,Buckinghamshire,UK）。

该反应产物使用4%的试剂盒在dsq-1000lDNA测序仪（岛津，东京，日本）上测序。

I

2.4比对和系统发育分析andphylogeneticanaly

用ClustalW1.6[11]版比对序列数据，然后将其转换为距离矩阵，再用邻位相连算法将距离矩阵构建为系统树。

然后在改正多个替换位置并排除空隙位置之后，将随机数生成的种子数和引导实验的种子数分别设置成111和1000。

另外将有空隙的位置排除后后，设定相同种子数使用2.3b3版本[12]的MOLPHY程序按照最大似然法进行了分析。

使用NucML计算最大似然距离矩阵，用MOLPHYpackage.的NJdist构建最初的邻位相连树。

根据HKY模型的R选项使用nucml建立最大似然树，根据重采样估计的自然对数方法估计局部的引导概率。

[13]

Fig.1.MaximumlikelihoodtreeoftheMicrocystisstrainsandrelatedorganisms.Analignmentof1328nucleotidesafterexcludingpositionswithgapswasused.Scalebar=1basesubstitutionper10nucleotidepositions.Localbootstrapprobabilities（forbranchesexceptthosewithintheMicrocystiscluster）areindicated

atnodes.Microcystis[I]representsMicrocystissp.4A3and4B3,andMicrocystis[II]representsM.viridisTAC17andTAC78,M.wesenbergiiTAC38,M.aeruginosaTAC71.`Outgroup'representsChromatiumtepidumandEscherichiacoli.AccessionnumbersintheDDBJ,EMBL,andGenBankdatabasesareMicrocystissp.4A3,AB012326;4B3,AB012327;T1-4,AB012329;T17-1,AB012330;M.viridisTAC17,AB012328;TAC78,AB012331;M.wesenbergiiTAC38,AB012334;TAC52,AB012335;M.aeruginosaTAC71,AB012332;TAC86，AB012333;TAC170,AB012340;M.novacekiiTAC20,AB012336;TAC65,AB012337;M.ichthyoblabeTAC48,AB012338;TAC91,AB012339;Mr.glaucaB1448-1,X94705;Synechocystissp.PCC6803,D90916;G.membranaceaPCC6501,X78680;Microcoleussp.PCC7420,X70770;T.tenue,AF013029;O.agardhiiCYA18,X84811;A.nidulansPCC6301,X03538;Synechococcussp.PCC7942,D88288;S.elongatus,D83715;C.tepidumM59150;andE.coli,E05133.

3.结果与讨论

根据Watanabe[3]的结果本文认为水华微囊藻是鱼害微囊藻的一种。

目前微囊藻属包括五种形态种，因此包含了大部分随处可见的在微囊藻中占主导地位的蓝藻。

对无菌和非无菌的菌株进行PCR扩增产物测序。

设计的引物能够帮我们将两条重叠的16SrDNA序列进行排序。

所有的微囊藻株在本研究中被证明具有相同的16SrDNA序列长度，即1457bp，对应于大肠杆菌的16SrDNA33-1542位置。

绿色微囊藻TAC17和TAC78，惠氏微囊藻TAC38，铜绿微囊藻TAC71，以及微囊藻属4A3和4B3均显示百分百的相似性。

在这些菌株中，所有菌株的DNA序列均显示出超过99%的较高相似性（表2）。

除却与铜绿微囊藻TAC86有99.5%的相似性之外，微囊藻T17-1与其他微囊藻有99.7%甚至更高的相似性。

铜绿微囊藻TAC86与鱼害微囊藻TAC48有99.8%的相似性，与微囊藻T17-1有99.7%的相似性。

这些结果表明，目前对现有的菌株，包括五个变种菌株和四株含有藻红蛋白的菌株还不能做出明确的分工。

这些菌株是否属于同一物种可以通过DNA-DNA杂交相结合的百分比鉴定。

在一个物种中%RB的值应大于70%。

Fox[15]等人通过利用芽孢杆菌证明如果16SrDNA的同源性是99%或更多，DNA-DNA杂交可能或也不可会记录此物种的存在。

平石与上田利用用红假单胞菌株[16]研究了16SrDNA序列相似性和基因组DNA同源性之间的关系。

这些结果表明，相似性大约为99.7%或者更高，大于或等于70%Rb。

不过将这种方法应用于微囊藻属还有待考察。

然而，至少结果显示本研究中使用的15菌株无论是形态还是藻胆色素成分都是密切相关的。

Fox等人认为如果16SrDNA序列是100%相同，那么根据DNA-DNA杂交准则几乎完全能证明这些菌株是同一物种。

虽然现在这些菌株的DNA-DNA杂交数据尚未公布，但极有可能有着相同的16SrDNA序列的惠氏微囊藻TAC38，铜绿微囊藻TAC71，以及绿色微囊藻TAC17和TAC78属于同一物种。

由于16SrDNA序列是高度保守的，因此通过它也并不能完全解释形态之间的区别和藻胆素的差异。

不过以可变区域的基因组为基础的系统发育分析可能会有助于说明这些表型品种。

构建的系统进化树，ML树（图1）和NJ树（未显示）表明所有的微囊藻株会形成一个轮廓清晰的群集，这个结果与Neilan等人的结果一致.Neilan[6]等人构建的树中包含的华美微囊藻NIES42和holsatica微囊藻NIES43并不在主要的微囊藻群内，而是与聚球藻pcc6301聚集在一起。

然而，根据Stanier等人[17]和上面引述的标准[1]，由于这两个物种没有气泡，所以目前应该不包括在微囊藻属内。

因为16SrDNA碱基的差异数太小，所以并没有足够的信息能说明微囊藻株之间的关系。

除了微囊藻群内的拓扑结构，这两棵树几乎是相同的，仅在阿氏颤藻的位置有区别。

根据遗传距离和树的拓扑结构表明，微囊藻属的遗传分化并没有发展到一个显著的程度。

在属中看不到明显的分隔。

通常蓝藻根据形态和生理特征分类。

然而，由于环境变化引起了形态特征的变异[18]，使得形态学标准在蓝藻分类中的应用仍然存在问题。

因此蓝藻的分类必须通过传统方法和分子方法的共同检验。

关于分子生物学研究，尤其是那些以16SrDNA为基础的研究，一些属的物种数量或许会减少，而另外一些属的物种数量也许会增加。

palinska等人[10]认为，自然界和（部分）文化中显示出的巨大的形态差异并不一定反映遗传多样性，并提出也许曾经发现过比基因型种类还多的ecophenic或表型形式。

就目前的研究来看这些微囊藻株可能是同种中的一员（基因型），不仅表现在有各种形态的表达，而且有两种藻胆色素。

这将有助于将微囊藻属内的表型变异视为种间差异。

总之，这15株由五个变种和四个具有藻红蛋白的变种组成的微囊藻株，它们的序列与16SrDNA序列有极高的相似性，并且据此构建的系统进化树在微囊藻群内也没有显示出明确的分隔。

以这些数据的为基础，那么目前研究中所用的所有菌株都可以被归并到到一个物种中，但它需要根据DNA-DNA杂交的Rb%是否超过70%来决定。

如果把基于DNA序列的系统发育分析法与基于形态和生理特征的传统方法结合使用，那么这将会是一个重要且有用的蓝藻分类方法。

目前为止微囊藻属的分类过于依赖形态特征，传统方法与分子方法的结合将会重新评估当前蓝藻的分类。

致谢

这项工作是在日本科学技术厅的帮助下完成。

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