生化实验二.docx

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生化实验二

实验二：

离子交换树脂

实验目的：

以阴离子DEAE-cellulose交换树脂管住层析法，将盐析透析后产物的更进一步纯化Þ-Amylase。

学习目标:

1学习IonExchanger原理，IonExchanger管柱制备。

2学习以IonExchanger管柱层析法进行样本蛋白质纯化。

3学习成析后管柱数据整理，图表制作，结果分析，判断纯化的效果。

4学习书面报告的撰写，报告投影片制作及口语表达。

基本原理：

离子交换法为absorption色层分析法，移动相为溶离缓冲溶液，固定相—固体介质表面的带电图。

分子会因：

a各种离子浓度的缓冲溶液溶离，b改变缓冲液的pH，而影响分子带电性及大小，使得样品中各成分与介质表面带电基团的亲和力大小不同，进而在洗脱过程中分离出来。

图一：

以阴离子交换树脂为例，树脂之带电为正电，吸引带负电的分子。

交换的机制由五个步骤组成：

1离子扩散到树脂表面

2离子通过树脂扩散到交换位置，此由树脂的带电基团及溶液的浓度所决定。

这个过程被认为是控制整个离子交换反应的关键。

3离子通过树脂到交换，此过程是一平衡过程，被交换的分子所带的电荷越多，其与树脂的结合越紧密，被取代也就越困难。

4被交换的离子通过树脂扩散到表面。

5用洗脱液将交换到的离子扩散到外部溶液中，因此离子树脂的交换反应是可逆的，遵循一般的化学平衡规律。

吸附过程中是由一定量的混合液通过交换柱，混合的离子不断的被交换，其浓

度逐渐减少，因而可全部或大部分被交换而吸附在树脂上，洗脱过程中是由连续

添加新的交换溶液，交换平衡不断的朝向正反应方向移动，直到完全，因而可将

大部分离子交换树脂上的离子全部或大部分洗脱下来。

图二：

蛋白质的静电荷与PI值得关系以及适于阳离子及阴离子交换剂的PH范围

离子交换管柱层析的特定技术是离子排斥和阻滞

用离子排斥从非电离物质或离子化程度不同的物质分出或分开离子化物质，如用阳离子交换树脂来加以说明，让一种含有A+的缓冲溶液通过这种树脂（该离子交换树脂预处理后仍处于完全离子化的溶液中），将一种含有不同阳离子（B+）的溶液嫁到柱上，那么有一部分A+将被B+所取代，直至达到平衡。

平衡时，相对组成取决于几个因素，如树脂`O···A+的浓度，B+的浓度以及离子交换树脂对A+和B+的相对亲和力。

随着含B+的溶液从柱子上流下来，反复的发生在这种平衡过程，B+可能几乎完全被结合到交换树脂中。

当正确的选择PH，离子强度，缓冲溶液流速，温度等条件，B+可以以一个很窄的区带被结合到树脂上。

为了从柱上洗脱阳离子B+，必须使用不同的缓冲液通过柱。

这可以是一种PH较低的缓冲液，既逐渐增加有效的H+浓度以取代B+离子，或者可以用一种PH相同的，但是增加了离子强度的缓冲液。

另一种情况，缓冲液可以有相同的PH值和离子强度，但是含有一种对离子交换树脂的亲和力比B+离子更强的阳离子。

如果被纯化的物质是一种像氨基酸分子，其分子上的静电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的PH值，那么在溶液低于PH值时，氨基酸分子带正电荷，他将结合到强酸性的阳离子交换树脂上。

如果通过柱的缓冲液的PH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗脱下来。

由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗脱。

首先被洗脱的是酸性氨基酸，如天门各氨酸和奎氨酸（在约PH3~4时），随后是中性氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸。

碱性氨基酸和精氨酸的离氨酸在PH很高的缓冲液中仍然带有正电荷，因此这些氨基酸将在大约PH10~11的缓冲液中方最后出现。

不同类型的离子交换剂洗脱能力的变化如下表。

离子交换剂

盐浓度

PH改变

被洗脱物质

阳离子交换剂

增加

升高

增加

阴离子交换剂

增加

降低

增加

传统的离子交换层析广泛应用于微生物发酵，医药，化工部门和水质的处理等，分离的对象多为一些小分子物质。

当离子交换层析和凝谬过滤相结合时，他的应用范围就可扩大到生物大分子，赋予了离子交换层析新的生命力，是目前国内外最广泛使用的一种分离分析手段。

如CM-SEPHADEXA50等类型的离子交换凝谬过滤层析，兼备了离子交换和凝谬过滤的特点，对分离纯化生物大分子及其有效。

离子交换树脂的结构和常用的离子交换剂

1离子交换树脂

最常见的离子交换剂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯-苯二乙烯是出苯乙烯和苯二乙烯进行聚合和交换反应反应生成的具有三维网状结构的高聚合物，其紧密程度是由交换剂苯二乙烯的相对数量决定的。

网状结构越紧密，空隙越小，固体树脂内部结合水和离子越差。

由于内部难于相互接近，固体树脂膨胀和收缩也少。

在他进行离子交换时，这常是一个优点；另一方面，他的单位重量只可以交换较少的离子，这又是一个缺点。

因此，对交换数目常取折衷方案，这取决于他的目的。

交换剂用量的多少称为交换度，常以符号“X”表示，他表明苯二乙烯的百分率数值。

因此，DOW化学公司生产树脂，DOWEX50X8的指示含8%苯二乙烯。

目前，根据离子交换树脂性能主要分为阳离子，阴离子交换树脂阳离子交换树脂。

它可以分为强酸型，中强酸型和弱酸型3类。

强酸型树脂含有横酸基团，中强酸型树脂含有磷酸根亚磷酸根或膦酸基，弱酸型树脂含有羧基或酚羟基。

上述交换树脂可进行如下反应：

三者中，以中强酸型树脂使用较少。

阴离子交换树脂

它也可以分为强碱性，中强碱性和弱碱型3类。

阴离子交换树脂都是含有氨基的。

如含四级铵盐为强碱性树脂；含三级氨，二级氨和一级氨类都属于弱碱型树脂；既含有强碱性基团，也含有弱碱型基团的，极为中强碱性树脂。

反应类型如下：

离子交换纤维素

实验证明，含有各种离子交换基团的纤维素对蛋白质和核酸纯化是极为有用的。

这些大分子因为它们不能渗入到交换的结构中，因此不能在一般的树脂上被分离。

这种纤维素纯化高分子量化合物的能力由于他具有松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过。

因此对生物大分子来说，它的交换容量比离子交换树脂大，同时纤维素的洗脱条件温和，回收率高。

较为普通的离子交换纤维有8种。

其中以二乙基氨基纤维素，即DEAE纤维素和梭甲基溶纤维素，即CM-纤维素最为普通。

前者是阴离子交换机，以2-氯N,N-二以基酸氨处理强碱性纤维素合成的。

后者是阳离子交换剂，它来自减膨胀纤维素与氯醋酸反应。

阳离子交换树脂：

介质--阴离子

阴离子交换树脂：

介质--阳离子

离子交换的进行，几乎可视为各种counterion,可对固体介质上带电基团的争夺。

离子竞争着占据固体介质上，而其竞争优势顺序如下：

a带电荷高者取代带电低者。

b电荷相同时，原子序大于优势。

c（浓度）可克服以上两种优势，高浓度的氢离子可取代大多数其他阳离子。

缓冲液的种类影响离子交换

1因离子交换介质多用Tris等带正电的缓冲液，因其共轭负离子（OH-）与其介质的结合力弱，干扰少。

2阳离子交换剂使用磷酸缓冲液效果较好，因其共轭正离子为（H+），很容易交换出来。

3缓冲液的PH值可定于sampleprotein之pI值之上或下一个PH单位。

期使sample分子pI值在0.5单位内时，protein开始溶离出来，在不影响protein和介质的结合下，尽量采用较高的浓度，通常在10~100mM之间。

·离子交换介质与蛋白质的结合量，称为交换介质的容量。

·稳定性：

一般而言阳离子的交换树脂较阴离子交换树脂稳定性好

在本实验中将以离子交换纤维素进行样本分析，现在就针对纤维素交换树脂做一些介绍。

离子交换纤维素的选择

类别的选择

首先必须考虑被分离的大分子保持其生物活性和可溶性的PH范围，然后根据其等电点和在上述PH范围内的带电情况，在此基础上选择合适的纤维素类别。

（1）已知等电点的物质，在高于其等电点的PH条件下，因带有负电荷而应采用阴离子交换纤维素；在低于其等电点的PH下，则用阳离子交换纤维素。

（2）未知等电点的物质，在一定PH条件下进行电泳，向阳极涌动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换纤维素吸附；向阴极涌动的物质可被阳离子交换纤维素吸附。

（3）用两种常用的交换剂实验，通常在低浓度下，用DEAE-纤维素或用CM-纤维素进行试验。

大多数蛋白质可被两者中之一或两者均吸附。

一经看到吸附之后，可改变PH条件是被分离物仍能有效的吸附，而亲蛋白质尽可能少地被吸附，同时所要分离的物质在被吸附的蛋白质中是吸附的最不牢的，便于下一步洗脱（当然，这样会降低了柱床对该蛋白质的吸附容量）。

如果蛋白质可被两种吸附剂所吸附，则两种均可用于分离，这样与其他亲蛋白质分离的机会也就更多了。

如果均不被吸附，可再降低盐的浓度至几乎近于零。

有时仍不能达到目的，则可改变交换容量较小的吸附剂。

应用最广的就是DEAE-纤维素，首先用他来试验，可能成功的机会更多，对碱性蛋白质则应首选用CM-纤维素试验。

颗粒大小的选择

通常采用100-325网目的颗粒，最常用的为100-230目。

纤维素颗粒大小的选择对吸附容量的影响不显著，主要影响分辨率和流速。

粗颗粒装住不够紧密，间隙大，容易引起区域扩散，同时在相同的吸附容量下粗颗粒所占有的柱床体积大，从而使形成的峰加宽，所以其分辨率低。

但颗粒粗的流速大。

细颗粒能形成十分细密的吸附床，分辨率高，缺点是流速低。

要求高流速时，例如为保持酶的活性，要在较短的时间内完成色层分析；或洗脱时区域宽一些也没有多大的妨碍时，可用粗粒子。

如欲得到高分辨率，应采用与所要求的流速不想矛盾的最细微的颗粒。

另外，粗的颗粒难以满意的填装直径1cm以下的小住，这样的小住应用230-325网目或更细的颗粒来填装。

缓冲液的选择

（1）缓冲溶液PH的选择，决定于被分离物质的等电点，稳定性和溶解度，也要根据交换纤维素解离基团的PK值。

用阴离子交换纤维素的时候要选用低于PK值得缓冲液，用阳离子交换纤维素是要选用高于PK值得缓冲液。

若分离目的物属于酸性物质，用阴离子交换剂时，缓冲液要用该物质等电点的PH值；目的物质属于碱性物质，用阳离子交换剂时，则缓冲溶液用于低于该物质等电点的PH值

（2）因为纤维素的交换容量小，为了降低盐离子的竞争，起始溶液的浓度要尽可能的低，当确认该物质可以被吸附的时候，可提高离子浓度，以保持较高的缓冲能力。

（3）缓冲液离子应不影响被分离物质或干扰其活性的测定，例如用紫外吸收法测样品，应为紫外吸收物质。

（4）缓冲液离子应不影响被测物质的溶解度或与一些必要的保护剂发生沉淀。

（5）洗脱液的梯度可以单纯的增加缓冲液的离子浓度，这样便于控制PH值，特别是当采用PH梯度时，由于远离其PH值以至于缓冲能力降低时，加大浓度可以提高缓冲力。

当缓冲溶液离子的溶解度有限或价格昂贵或有毒副作用时，可以加入非缓冲液。

（6）层析时间较长或温度较高时，容易染菌，可加入少量甲苯作为防腐剂。

三材料的预处理

离子交换纤维素的常规操作与离子交换剂相同，在此仅会介绍值得注意的地方

（1）为了除去杂质和使纤维素膨胀，在使用前，应相继用碱和酸洗涤，洗涤和过滤一般在耐酸漏斗中进行。

将干净纤维素粉末倾洒在溶液中，自然下沉，这样可以防止气泡产生。

浸放一段时间，过滤，碱液如果变黄应该重复洗至无黄色为止，再用水充分洗净NaOH

（2）离子交换纤维素使用前必须平衡至所需的PH和离子强度。

可直接用起始缓冲液充分洗涤，以达到所要求的PH和盐浓度，以免在盐析中发生PH变化，但是这样要消耗大量的缓冲液，时间也长。

最好先经过初调，将交换剂放到起始溶液中，使之平衡。

本次实验：

以DEAE-Cellulose（阴离子交换树脂）

原理：

同前介绍。

唯带电图为DEAE，基质为Cellulose

材料：

1Elutionbuffer:

sodiumphosphatebuffer（0.01M,ph=7.0）

ABuffer:

Elutionbuffercontain0MNaCL

BBuffer:

Elutionbuffercontain0.1MNaCL

CBuffer:

Elutionbuffercontain0.2MNaCL

DBuffer:

Elutionbuffercontain0.3MNaCL

EBuffer:

Elutionbuffercontain0.4MNaCL

FBuffer:

Elutionbuffercontain0.5MNaCL

GBuffer:

Elutionbuffercontain0.6MNaCL

HBuffer:

Elutionbuffercontain0.8MNaCL

IBuffer:

Elutionbuffercontain1.0MNaCL

JBuffer:

Elutionbuffercontain2.0MNaCL

2DEAE-cellulose

处理步骤

将DEAE-cellulose100g轻倒于500ml0.5MHCL

静置约两个小时，倒去上清液

以大量的蒸馏水洗去过多的HCL（两次）

加入0.5NNaOH500ml

静置两小时，倒去上清液

以大量的蒸馏水洗去过多的HCL（两次）

以0.01Mphosphatebuffer（PH=7.0）1000ml浸泡

每30分钟换一次phosphatebuffer

以PH试纸测其PH值，直到PH值为7为止

3DEAE-Cellulose管柱制备

1以0.01MHCL浸泡ClassEcono-Columns1小时。

2使用大量的清水冲洗。

3最后一次使用蒸馏水清洗后，倒置干凉备用

DEAE-Cellulose填充管柱

先以清洗好的GlassEcono-Columns15公分处作一横线记号

GlassEcono-Columns先连接好三向控制阀

固定在铁架上

从三向阀侧边入口打入5ml缓冲液，夹住出水口

将已处好的DEAE-cellulose悬浮液倒入中管柱中

（50%，DEAE-cellulose需先悬浮起来）

开始控制流速（1ml/min）

持续慢慢加入DEAE-cellulose悬浮液

直到高度为15公分高

停止填充DEAE-Cellulose但继续加入phosphatebuffer（PH=7.0）

直到流出的液体为PH7.0

样本进入DEAE-Cellulose管柱：

将液体降到，加入样本溶液1ml

打开出水口开始每1.5ml收集一管

知道样本进入液体面下开始加入不含盐的缓冲溶液5ml（持续收集流出液）

齐胶体面后加入5mlA缓冲液（持续收集流出液），待齐胶体面时换B缓冲液。

如此一次加入A~J缓冲液各加入5ml（持续收集流出液）直至管柱流不出为止

直接以波长为280nm定量蛋白质

收集液进行Lowrymethod蛋白质浓度测定（必要时需进行稀释）

收集液做Þ-amylase活性测定（必要时进行稀释）

分析后的图形选择适合区域进行浓缩，进行下一个单元的测试，去少量分析

结果：

1就收集的体积各管进行蛋白质浓度的测定及酵素活性分析。

2针对蛋白质浓度，酵素活性与回收体积列表，作图。

3针对回收体积，专一活性作图。

4计算回收率

5由结果针对蛋白质纯化的目标讨论此步骤是否有纯化的效果。

6请决定哪些回收液进行下个实验单元。