生工生化实验讲义1112.docx
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生工生化实验讲义1112
生物化学实验讲义
实验一蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应
实验目的
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
4．加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
，
一、茚三酮反应
1.实验原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。
尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.材料、仪器与试剂
蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液
3.实验操作
①取2支试管分别加入鸡蛋清溶液和0.5%甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
二、黄色反应
1.实验原理
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液；大豆提取液（将大豆浸泡充分吸胀后，研磨成浆状用纱布过滤）；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液
3.实验操作
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
管号
1
2
3
4
5
6
7
材料
（滴）
鸡蛋清
溶液
4
大豆
提取液
4
指甲
少许
头发
少许
0.5%
苯酚
4
0.3%
色氨酸
4
0.3%
酪氨酸
4
浓硝酸/（滴）
2
4
40
40
4
4
4
现象
三、蛋白质沉淀反应
蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。
（一）蛋白质的盐析作用
1.实验原理
盐析现象是指—般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。
盐析作用与两种因素有关：
①蛋白质分子被浓盐脱水；②分子所带电荷被中和。
蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。
盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。
分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如清蛋白）易于析出。
球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；固体硫酸铵；饱和硫酸铵溶（称取377g硫酸铵溶于20℃500ml的蒸馏水中。
硫酸铵在20℃水中的溶解度为754g/L水。
配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶）。
3.实验操作
取鸡蛋清溶液约5ml于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。
将管内混合液过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
（二）重金属盐类沉淀蛋白质
1.实验原理
溶液pH在蛋白质等电点以上时，重金属盐类（如Pb2+、Cu2+、Hg2+及Ag+等）易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。
重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。
但应注意，在使用某些重金属盐（如硫酸铜或醋酸铅）沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；5％CuS04溶液；3％AgNO3溶液
3.实验操作
取试管2支各加蛋白质溶液1ml，向各管分别滴加2-3滴加5％CuS04溶液、3％AgNO3溶液，观察各管所生成的沉淀。
在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入5％CuS04溶液，观察沉淀的溶解。
（三）有机酸沉淀蛋白质
1.实验原理
生物碱是植物中具有显著生理作用的—类含氮的碱性物质。
凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。
如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。
当蛋白质溶液pH值低于其等电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成中性盐而沉淀。
溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质。
2.材料、仪器与试剂
鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；10％三氯醋酸溶液；
3.实验操作
取蛋白质溶液1ml于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。
思考题
1．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？
并说明原因。
2．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？
3．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？
实验二考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
【实验目的】
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
【实验原理】
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收
在595nm。
在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。
蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。
【实验试剂和器材】
1.仪器
电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721型分光光度剂
2.试剂
（1）标准蛋白质溶液：
称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成100μg/mL牛血清白蛋白溶液
（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90%乙醇中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
（3）鸡蛋清1ml定容至50mL
【实验步骤】
1、标准曲线绘制
取6支试管，按下表加入各试剂。
管号
试剂
0
1
2
3
4
5
100μg/mL牛血清白蛋白溶液／mL
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水／mL
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝液／mL
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
蛋白质含量/µg
0
20
40
60
80
100
加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。
以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
试管中加自制蛋白质样品1.0mL，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。
根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。
【实验结果】
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（µg），按下式计算：
查得的蛋白质含量（µg）×提取液总体积（mL）
样品蛋白质含量（µg/g鲜重）=
样品鲜重（g）×测定时取用的提取液体积（mL）
【注意事项】
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
比色反应需在1h内完成。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。
测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验三糖的性质实验及总糖和还原糖含量测定
一.实验目的
1.加深对单糖、二糖、多糖化学性质的认识，进一步体会糖类化合物的分子结构与其化
学性质的关系。
2.了解3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖的基本原理。
3.区分还原糖和总糖测定过程的异同，掌握具体的操作方法。
二.实验原理
糖是多羟基醛、多羟基酮或它们的缩合物。
单糖及分子中含有半缩醛（酮）羟基的
二糖都具有还原性，能将班氏试剂还原成砖红色的Cu2O沉淀。
蔗糖等不含有半缩醛（酮）
羟基的糖则无还原性。
但蔗糖经水解生成了葡萄糖和果糖，因而水解液具有还原性。
多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，无还原性。
但多糖在酸存在下加热水解，可生成单糖，随之具有还原性。
淀粉为一多糖，经水解先生成糊精，再水解成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖，因此水解液也具有还原性，能与班氏试剂发生反应。
淀粉遇碘显蓝色，此反应很灵敏，常用于检验淀粉或碘。
糖在浓酸存在下，可与酚类化合物产生颜色反应。
糖在浓硫酸的作用下与α-萘酚反应
显紫色，常用于糖类化合物的检出。
己酮糖与间-苯二酚-盐酸试剂反应很快出现鲜红色，
而己醛糖显色缓慢，两分钟后可出现微弱的红色，因此常用于区别酮糖（果糖）和醛糖（葡
萄糖）。
还原糖是指含有自由醛基或酮基、具有还原性的糖类。
单糖都是还原糖。
3，5—二硝基水杨酸与还原糖共热后可生成棕红色氨基化合物，在一定范围内，该棕红色化合物颜色的深浅与还原糖的量呈正比关系，可用分光光度计进行比色测定。
因此3，5—二硝基水杨酸法可用于还原糖的测定，且具有快速、杂质干扰小的优点。
不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。
通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的总糖含量。
对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。
再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。
由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-
=0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。
三．试剂
（1）班氏试剂的配制：
称取柠檬酸钠20g，无水碳酸钠11.5g，溶于100ml热水中，
在不断搅拌下把含2g硫酸铜晶体的20ml水溶液慢慢加入。
溶液应澄清，否则需过滤。
（2）2%葡萄糖
（3）2%果糖
（4）2%麦芽糖
（5）2%蔗糖（所用蔗糖必须纯净）
（6）2%淀粉溶液：
将2g可溶性淀粉用10ml蒸馏水调成糊状，加入
90ml沸水中煮沸后冷却。
（7）3mol·Lˉ1H2SO4溶液
（8）10%Na2CO3溶液
（9）0.1%碘液：
在1g碘和5g碘化钾中，加入尽可能少的蒸馏水使其溶解，然后用蒸
馏水稀释为1000ml。
（10）浓盐酸
（11）α-萘酚试剂的配制：
将10gα-萘酚溶于95%乙醇中，再用同样的乙醇稀释至100ml，
贮于棕色瓶中，一般用前才配制。
（12）浓硫酸
（13）间-苯二酚-盐酸试剂的配制：
将0.05g间-苯二酚溶于50ml浓盐酸中，再用蒸馏
水稀释至100ml。
（14）3，5—二硝基水杨酸试剂（DNS）：
6.3gDNS和262mL2mol/LnaOH加入到500mL含有182g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加水定容至1000mL，贮存于棕色瓶中，7~10天后使用。
（15）葡萄糖标准溶液（300μg/mL）：
准确称取干燥恒重的葡萄糖0.3g，以蒸馏水定容至1000mL。
（16）6mol/L盐酸:
取500mL12NHCl，用水稀释至1000mL。
（17）10%NaOH
（18）6mol/LNaOH：
取240gNaOH，加水溶解，定容至1000mL。
（19）碘试剂：
称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。
（20）酚酞试剂:
称取0.1g酚酞，溶于250mL70%（V/V）的乙醇中。
四．实验方法和步骤
（一）糖的还原性：
取5支大试管，编号后各加入1ml班氏试剂，再分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%麦芽糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液各10滴。
振荡后，将试管用橡皮筋捆好放入沸水浴中，加热3～5分钟，观察那几个试管中生成砖红色沉淀。
（二）蔗糖的水解：
取2支大试管，各加入2%蔗糖溶液1ml，然后于一支试管中加入3mol·Lˉ1H2SO42滴，将此支试管置于沸水浴中加热5～10分钟，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止。
将两支试管各加入班氏试剂1ml，再在沸水浴中加热3～5分钟，观察并比较两管的结果。
（三）淀粉与碘的作用：
取1支大试管加10滴2%淀粉溶液和1滴0.1%碘液，观察呈现的颜色。
然后将此试管放入沸水浴中加热5～10分钟，观察有何现象。
取出试管，放置冷却，又有何变化，为什么？
（四）淀粉的水解：
取1支大试管，加2%淀粉溶液2ml,再加入浓盐酸3滴，在沸水浴中加热10～15分钟，加热时每隔1～2分钟取出1滴反应液，置于白瓷滴板上，加1滴碘液，注意观察其颜色的变化过程，直到无蓝色出现为止。
取出试管，冷却后，用10%Na2CO3中和，直到没有气泡发生为止，加入班氏试剂5～10滴，然后在沸水浴中加热3～5分钟，观察结果。
（五）糖的颜色反应
⒈α-萘酚反应：
取4支小试管，分别加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖和2%淀粉溶液1ml，然后各加入新配制的α-萘酚试剂2滴，混合均匀后，将试管倾斜沿管壁徐徐注入浓硫酸各1ml,切勿摇动。
然后竖起试管，静置10分钟，观察两液界面之间出现紫色环。
如无紫色环生成，可在水浴中温热后再进行观察。
⒉间-苯二酚反应：
取4支大试管，分别加入间-苯二酚-盐酸试剂1ml，然后在三支试管
中各加入2%葡萄糖、2%果糖、2%蔗糖溶液5滴，第4支试管留作对照。
将4支试管摇匀
后，同时放入水浴中加热2分钟，观察各管出现颜色的顺序。
（七）样品中总糖和还原糖的测定
1.还原糖的制备
准确称取1g玉米粉，放在100ml烧杯中，先以少量蒸馏水（约4ml）调成糊状，然后加入80ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。
过滤，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。
2．样品总糖的水解及提取
准确称取1g玉米粉，放在锥形瓶中，加入6mol/LHCl20ml，蒸馏水30ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。
如已水解完全，则不呈现蓝色。
水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6NNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤，取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。
3．葡萄糖标准曲线的制作及样品测定
（1）标准葡萄糖梯度溶液的配制：
取8支大试管，分别按下表加入试剂。
管号
操作
空白
标准葡萄糖浓度梯度
样品
0
1
2
3
4
5
Ⅰ
Ⅱ
葡萄糖标准液（mL）
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
样品待测液（mL）
1.0
1.0
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
1.0
1.0
DNS试剂（mL）
各2.0
反应
各管混匀，沸水浴5分钟
比色
以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光度
记录吸光度（A540）
（2）绘制标准曲线
由0～5号管的数据，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线，从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量（mg）；按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量：
还原糖（%）=糖量（mg）×样品稀释倍数×100/样品量（mg）
总糖（%）=糖量（mg）×样品稀释倍数×100/样品量（mg）×0.9
思考题
1.糖都包括哪些化合物？
2.为保证样品中糖测定的准确性.，应注意哪些操作事项？
3.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？
实验四氨基酸的分离鉴定－纸层析法
【实验目的】
通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
【实验原理】
层析法又称色谱法。
1903年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。
此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。
虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。
层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。
一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。
分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。
通常用α表示分配系数。
α=
一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。
纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。
流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。
显然两个物质的分配系数差得越大，则越易分开。
纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。
这种操作常称单向层析。
为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。
即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层
物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用Rf表示。
Rf=
每一物质的Rf值决定于该物质在两相间的分配系数（α）和两相的体积比（AS/AL）。
这两种相即是水（固定相）和有机溶剂（流动相）。
两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以Rf值的主要决定因素是分配系数（α）。
对于某一物质在一条件下的α值是固定的。
因此Rf值为其特征常数。
现将影响Rf值的因素概括如下：
1、物质结构的影响：
极性物质是易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。
例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf低于后者。
—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的Rf值：
甘氨酸＜丙氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。
极性基团的位置不同也会引起Rf变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨酸的Rf值大于β-丙氨酸。
2、溶剂的影响：
同一物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当Rf值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的Rf至少差别为0.05才能彼此分开。
溶剂的极性大小也影响物质的Rf值。
在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。
3、pH的影响：
溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式，例如氨基酸在酸性或碱性溶剂中变化如下：
对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。
带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性中大。
而碱性氨基酸则与此相反。
借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。
溶剂的pH还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。
对于极性物质如（氨基酸）来说Rf值增加，非极性物质则减少。
若pH不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。
因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。
4、滤纸的影响：
层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01mol·L—1或0.4mol·L—1HCl）洗涤滤纸除去之。
5、温度的影响：
温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。
温度变化对Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5℃。
除上述因素影响Rf值外。
样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。
无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常用茚三酮或吲哚醌作显色剂。
茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。
样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。
铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。
用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。
【实验器材及试剂】
1．器材：
①层析缸②毛细管③喷雾器④培养皿⑤层析滤纸
2．试剂：
①扩展剂：
4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。
将20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。
取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
②氨基酸溶液：
0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组份浓度均为0.5%）。
③显色剂：
0.1%水合茚三酮丙酮溶液。
【操
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