最新宫颈癌Hela细胞株培养.docx
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最新宫颈癌Hela细胞株培养
宫颈癌Hela细胞株培养
本科学生综合性
实验报告
姓名：
学号：
学院：
专业、班级：
实验课程
指导教师及职称
开课学期至学年上学期
云南师范大学教务处编印
实验序号及名称：
实验二、宫颈癌HeLa细胞培养
实验时间：
2013.11.6—2013.11.20
实验室：
睿智三424
一、实验目的：
（一）细胞培养准备工作（清洗）
能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
（二）、培养基的配制
熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法
（三）、细胞传代培养
1、熟练掌握细胞传代培养的操作方法。
2、观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。
（四）、死活细胞的鉴别
掌握死活细胞的鉴别原理及方法。
二、仪器、材料和试剂
（一）细胞培养准备工作（清洗）
1、仪器
超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器
2、材料
紫外灯、微孔滤膜（直径25mm）：
孔径为0.22um
3、试剂
75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH等
（二）、培养基的配制
1、仪器
超净工作台、微孔过滤器（0.22um）、高压灭菌锅、蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、
超低温冰箱、二氧化碳培养箱
2、材料
细胞培养瓶、微量加样器、250ml和125ml试剂瓶、量筒、离心管、pH试纸、培养细胞
3、试剂
HCl、NaOH、酚红
RPMI1640干粉
小牛血清、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺
NaHCO3、胰酶
三蒸水
（三）、细胞传代培养
1、仪器
超净工作台、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱
2、材料
细胞培养瓶、滴管、培养细胞
（四）、死活细胞的鉴别
1、材料：
HeLa细胞株
2、试剂：
0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制why？
）
三、实验原理、装置示意图：
（一）细胞培养准备工作（清洗）
清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。
细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。
灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
（二）、培养基的配制
组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。
合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。
其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。
它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。
小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。
此外它还能中和有毒物质的毒性。
（三）、细胞传代培养
细胞传代培养：
当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后（一般形成致密单层），则需要再做培养。
即将培养的细胞分散后，以适当比例转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。
一般将传代培养的积累次数作为传代细胞的代数。
贴壁细胞指的是体外培养条件下，必须贴附于支持物表面才能生长的细胞，贴壁后一般呈纤维样细胞或上皮样细胞两种形态。
贴壁细胞在培养瓶长成致密单层厚，继续生长的空间不足，培养基中的营养成分也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，需进行分瓶培养，对细胞进行传代扩增。
对于贴壁不太紧的细胞如colo320，可以直接吹散后分瓶。
而对于贴壁较紧的细胞如HeLa、colo205贴壁细胞，则需要以细胞消化液消化后才能脱落和分散。
常用的消化液为胰蛋白酶。
胰酶消化的原理：
胰酶是一种蛋白酶，通过特定位置上降解蛋白，使细胞膜上和培养瓶壁结合处蛋白降解，致使两者分离。
这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力作用下成为球形。
细胞消化用胰蛋白酶常用的工作液浓度为0.25%，PH为7.2-7.4之间。
胰酶消化的程度是一个关键：
消化过度会对细胞活性损伤较大，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失，甚至造成细胞破碎；消化不足则细胞难于从瓶壁吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。
一般消化时间为1至3分钟，肉眼观察瓶壁由半透明转为点状透明时，弃去胰酶，并加入适量的有血清培养液终止消化，吹打分散。
（四）、死活细胞的鉴别
细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。
多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。
其原理是：
许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以此来区别死活细胞。
四、实验方法、步骤、现象及注意事项：
（一）细胞培养准备工作（清洗）
1、清洗
1）新玻璃器皿的清洗
先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。
2）使用过的玻璃器皿的清洗
（1）立即进入清水，避免干涸难洗；
（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；
（3）浸酸性洗液过夜；
（4）从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗3次，倒置烘干；
（5）包装（牛皮纸或不透水纸）；
（6）高压（15磅20min）或干热（160度2h）灭菌；
（7）备用。
2、胶塞处理
1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。
2）自来水清洗10次
3）用1%稀盐酸浸泡30min。
4）自来水清洗10次，蒸馏水刷洗10次。
晾干
5）旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装高压灭菌，可使用。
3、塑料制品的清洗
1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍
2）强（次强）酸洗液浸泡2~6h.
3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次
4）浸泡在70%乙醇0.5~1h,备用。
5）用前从乙醇中取出，在超级工作台内紫外线照射1h。
4、Tip和Tube的清洗
1）新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。
2）使用过的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/LNaOH或0.2mol/LHCl溶液中，清水洗过，自来水清洗10次晾干，进洗液2~24h。
晾干，放入饭盒高压灭菌，备用。
5、洗液的配制
常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。
洗液可根据需要配制不同的浓度（每4个同学配制120ml强洗液：
重铬酸钾6.3g、浓硫酸100ml、蒸馏水20ml）
成分
强酸洗液
强酸洗液
重铬酸钾
63g
3150g
120g
60006
浓硫酸
1000ml
50000ml
200ml
10000m
蒸馏水
200ml
10000ml
1000ml
50000ml
配制方法：
1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。
2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。
注意：
操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。
6、消毒和灭菌:
1）射线消毒灭菌
主要使用X、60Co进行消毒灭菌，用于牛血清或塑料制品。
2）紫外线消毒
一般用无臭氧型紫外灯。
一般20min，71%细菌消灭；40min后79%细菌消灭，60min后86%细菌消灭。
紫外线照射时间照射再长也不能100%灭菌，最多只能达到90%。
3）干热灭菌
主要用于玻璃器皿的灭菌。
将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160度，保温90~120min。
用于RNA提取实验的用品则需要180度，保温5~8h.
4）湿热灭菌
也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。
主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。
5）滤过灭菌
用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。
7、化学消毒法
1）70%（75%）酒精消毒
2）0.1%新洁尔灭消毒
3）来苏儿水消毒
4）0.5%过氧乙酸消毒
5）乳酸蒸汽消毒
6）37%甲醛加高锰酸钾消毒
7）煮沸消毒
（二）、培养基的配制
1、准备（清洗与灭菌）
2、合成培养基（RPMI1640）的配制
配制100mlRPMI1640母液：
1）每4小组合称RPMI1640干粉1.04g，溶于100ml的3DW。
2）置于搅拌器上搅拌40分钟，直到液体变为澄清为止。
3）通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。
4）溶好以后置于超净台中进行0.22um滤过除菌，分装至试剂瓶中。
5）瓶口封好，-20℃或4℃贮存。
3、小牛血清的处理
1）新买的新生小牛血清一定要灭活；
2）将新生小牛血清不开封置于56℃水浴锅中30min,期间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
3）已灭活的血清贮存于4℃。
4、生长培养基的配制
1）双抗：
（100000u/ml）
（1）160万单位青霉素/瓶+8ml3DW=20万单位/ml
（2）1g链霉素+5ml3DW=200000ug/ml
（3）各取以上的液体5ml混合，使其浓度为10万单位/ml，0.22um过滤至1.5ml离心管，-20℃贮存。
2）谷氨酰胺储备液（200mM）：
（1）1.5g的谷氨酰胺溶于50ml3DW中（30mg/ml=200mM）,0.22um过滤至1.5ml离心管中。
（2）-20℃贮存。
注：
200mM=200mmol/L（毫摩尔每升）
3）饱和NaHCO3的配制
（1）每组称取10g的NaHCO3溶于200ml3DW中，过滤除菌后分装于50ml试剂瓶。
（2）4℃保存
4）RPMI1640生长培养基的配制
50毫升
储备液浓度
终浓度
RPMI1640培养液
44
—
—
谷氨酰胺
0.5
30mg/ml
0.3mg/ml
双抗
双抗
100000u/ml
100u/ml
小牛血清
5
—
10%
NaHCO3调pH至7.0
（三）、细胞传代培养
1、RPMI1640生长培养基的配制
50毫升
储备液浓度
终浓度
RPMI1640培养液
44
—
—
谷氨酰胺
0.5
30mg/ml
0.3mg/ml
双抗
双抗
100000u/ml
100u/ml
小牛血清
5
—
10%
NaHCO3调pH至7.0
2、传代培养步骤（以下均为无菌操作）
从培养箱中取出原代培养细胞并置于超净工作台，弃去培养液，加入0.6ml的0.25%胰酶溶液，以使细胞贴壁面充分浸润，当见到细胞贴壁面的瓶壁出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量培养液终止消化，吹打分散。
细胞计数：
取5ul细胞悬浮液加入等量台盼蓝染液，混匀后用血球计数板计算细胞的成活率。
如果样本成活率高，无污染即可用于传代。
（计数结果：
4.5×106个/ml）。
将细胞分装至新鲜的培养液中，使细胞的最终数量调节至1×105～3×105个/mL。
置于37℃二氧化碳培养箱中继续培养。
具体操作：
每两个小组共用一个培养瓶配制100ml的生长培养基
每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内
向细胞培养瓶内接种400ul的HeLa细胞株原液
放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖
根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置
（四）、死活细胞的鉴别
将细胞悬液充分混匀后取20ul放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置2min。
取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。
注意滴液勿有气泡，也不能太多（约10ul），否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。
低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。
找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。
五、实验结果分析与讨论：
六、参考文献：
七、实验总结
九、教师评语及评分：
签名：
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