微生物菌种的扩大培养技术.docx
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微生物菌种的扩大培养技术
微生物菌种的扩大培养技术
菌种的扩大培育是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。
种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是，经过种子制备培育出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。
因此，如何供应发酵产量高、生产性能稳定、数量足够而且不被其他杂菌污染的生产菌种，是种子制备工艺的关键。
种子扩大培育的任务
工业生产规模越大，每次发酵所需的种子就越多。
要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必需具备数量巨大的微生物细胞才行。
菌种扩大培育的目的就是要为每次发酵罐的投料供应相当数量的代谢旺盛的种子。
由于发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。
将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于削减染菌的机会。
因此，种子扩大培育的任务，不但要得到纯而壮的菌体，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。
对于不同产品的发酵过程来说，必需依据菌种生长繁殖速度快慢打算种子扩大培育的级数，抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，经常采纳三级种子扩大培育。
一般50t发酵罐多采纳三级发酵，有的甚至采纳四级发酵，如链霉素生产。
有些酶制剂发酵生产也采纳三级发酵。
而谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采纳的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，一般采纳二级发酵。
种子制备的过程
细菌、酵母菌的种子制备就是一个细胞数量增加的过程。
细菌的斜面培育基多采纳碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。
细菌培育温度大多数为37℃，少数为28℃，细菌菌体培育时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培育5～10天。
霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培育基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培育基中生产大量菌丝的种子制备过程。
⒈孢子制备
孢子制备是种子制备的开头，是发酵生产的一个重要环节。
孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。
不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。
⑴放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培育一般采纳琼脂斜面培育基，培育基中含有一些适合产孢子的养分成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。
碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5％），碳源丰富简单造成生理酸性的养分环境，不利于放线菌孢子的形成，氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。
一般状况下，干燥和限制养分可直接或间接诱导孢子形成。
放线菌斜面的培育温度大多数为28℃，少数为37℃，培育时间为5～14天。
采纳哪一代的斜面孢子接入液体培育，视菌种特性而定。
采纳母斜面孢子接入液体培育基有利于防止菌种变异，采纳子斜面孢子接入液体培育基可节省菌种用量。
菌种进入种子罐有两种方法。
一种为孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐。
此方法可削减批与批之间的差异，具有操作便利、工艺过程简洁、便于掌握孢子质量等优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。
另一种方法为摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培育时间。
⑵霉菌孢子的制备 霉菌的孢子培育，一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等自然 农产品为培育基。
这是由于这些农产品中的养分成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且这类培育基的表面积较大，可获得大量的孢子。
霉菌的培育一般为25～28℃，培育时间为4～14天。
⒉种子制备
种子制备是将固体培育基上培育出的孢子或菌体转入到液体培育基中培育，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。
种子制备所使用的培育基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽、菌丝繁殖或菌体增殖。
⑴摇瓶种子制备 某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培育成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。
摇瓶相当于微缩了的种子罐，其培育基配方和培育条件与种子罐相像。
摇瓶种子进罐，常采纳母瓶、子瓶两级培育，有时母瓶种子也可以直接进罐。
种子培育基要求比较丰富和完全，并易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。
原则上各种养分成分不宜过浓，子瓶培育基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培育基配方。
⑵种子罐种子制备 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。
孢子（或摇瓶菌丝）被接入到体积较小的种子罐中，经培育后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子，把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。
假如将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培育形成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子，将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。
同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
种子罐的级数主要打算于菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用。
种子制备的目的是要形成肯定数量和质量的菌体。
孢子发芽和菌体开头繁殖时，菌体量很少，在小型罐内即可进行。
发酵的目的是获得大量的发酵产物。
产物是在菌体大量形成并达到肯定生长阶段后形成的，需要在大型发酵罐内才能进行。
同时若干发酵产物的产生菌，其不同生长阶段对养分和培育条件的要求有差异。
因此，将两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的铺张。
种子罐级数削减，有利于生产过程的简化及发酵过程的掌握，可以削减因种子生长特别而造成发酵的波动。
种子培育
种子培育要求肯定量的种子，在相宜的培育基中，掌握肯定的培育条件和培育方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培育法分为静置培育和通气培育两大类型，静置培育法即将培育基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培育。
而通气培育法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必需供应空气，以维持肯定的溶解氧水平，使菌体快速生长和发酵，又称为好气性培育。
⒈表面培育法
表面培育法是一种好氧静置培育法。
针对容器内培育基物态又分为液态表面培育和固体表面培育。
相对于容器内培育基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面对培育基内传递。
这种方法菌的生长速度与培育基的深度有关，单位体积的表面积越大，生长速度越快。
⒉固体培育法
固体培育又分为浅盘固体培育和深层固体培育，统称为曲法培育。
它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。
其最大特点是固体曲的酶活力高。
⒊液体深层培育
液体深层种子罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。
这种由罐底部通气搅拌的培育方法，相对于由气液界面靠自然集中使氧溶解的表面培育法来讲，称为深层培育法。
其特点是简单根据生产菌种对于代谢的养分要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度与培育基中氢离子浓度等条件，选择最佳培育条件。
⑴深层培育基本操作的三个掌握点
①灭菌 发酵工业要求纯培育，因此在种子培育前必需对培育基进行加热灭菌。
所以种子罐具有蒸汽夹套，以便将培育基和种子罐进行加热灭菌，或者将培育基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于种子罐内。
②温度掌握 培育基灭菌后，冷却至培育温度进行种子培育，由于随着微生物的生长和繁殖会产生热量，搅拌也会产生热量，所以要维持温度恒定，需在夹套中或盘管中通冷却水循环。
③通气、搅拌 空气进入种子罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。
为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。
搅拌的目的除增加溶解氧以外，可使培育液中的微生物匀称地分散在种子罐内，促进热传递，以及pH均充，并使加入的酸和碱匀称分散等。
⑵几种深层培育法
①掌握培育法 依据罐内部的变化状况，把握短临时间内状态变量的变化以及可能测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，并以此为基础进行掌握培育，以达到产物的最优培育条件。
为此，用测定状态变量的传感器取得数据，经电子计算机进行综合分析，再将其结果作为反馈调整的信号，将环境（培育条件）掌握于给定的基准内。
这就叫做电子计算机掌握培育。
目前已大量用于露天大罐啤酒发酵。
②载体培育法 载体培育法脱胎于曲法培育，同时又汲取了液体培育的优点，是近年来新进展的一种培育方法。
特征是以自然 或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固体基质作为微生物的载体，养分成分可以严格掌握。
发酵结束，只要将菌体和培育基挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。
③两步法 在酶制剂的两步法液体深层培育中，每一步菌体相同而培育条件不同，由于微生物生长与产酶的最适条件有很大的差异。
例如往培育基中添加葡萄糖能大大增加菌体或菌丝的生长，然而却严峻阻碍很多种酶的合成。
加强培育液的通气虽然能促进微生物的生长，可是在多数场合下反而抑制酶的合成。
为了取得最大的高活力酶，必需制定一种调整方法，既要求细胞的单位酶活力高，又要求细胞数量多，也就是说，给菌体在各种生理时期制造不同的条件。
两步法液体深层培育就是实现这种调整的详细措施之一。
酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件（生长期）与产酶条件（生产期）区分开来。
菌体先在丰富的培育基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后再转入添加诱导物的产酶培育基，在此期间，菌体积累大量的酶，一般不再繁殖，养分成分或诱导物得到充分的利用。
种子质量的掌握
种子质量是影响发酵生产水平的重要因素。
种子质量的优劣，主要取决于菌种本身的遗传特性和培育条件两个方面。
这就是说既要有优良的菌种，又要有良好的培育条件才能获得高质量的种子。
㈠影响孢子质量的因素及其掌握
孢子质量与培育基、培育温度、湿度、培育时间、接种量等有关，这些因素相互联系、相互影响，因此必需全面考虑各种因素，仔细加以掌握。
⒈培育基
构成孢子培育基的原材料，其产地、品种、加工方法和用量对孢子质量都有肯定的影响。
生产过程中孢子质量不稳定的现象，经常是原材料质量不稳定所造成的。
原材料产地、品种和加工方法的不同，会导致培育基中的微量元素和其他养分成分含量的变化。
例如，由于生产蛋白胨所用的原材料及生产工艺的不同，蛋白胨的微量元素含量、磷含量、氨基酸组分均有所不同，而这些养分成分对于菌体生长和孢子形成有重要作用。
琼脂的牌号不同，对孢子质量也有影响，这是由于不同牌号的琼脂含有不同的无机离子造成的。
此外，水质的影响也不能忽视。
地区的不同、季节的变化和水源的污染，均可成为水质波动的缘由。
为了避开水质波动对孢子质量的影响，可在蒸馏水或无盐水中加入适量的无机盐，供配制培育基使用。
例如在配制生产四环素的斜面培育基时，有时在无盐水内加入0.03％（NH4）2HPO4，0.028％KH2PO4及0.01％MgSO4，确保孢子质量，提高四环素发酵产量。
为了保证孢子培育基的质量，斜面培育基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格后才能使用。
制备培育基时要严格掌握灭菌后的培育基质量。
斜面培育基使用前，需在适当温度下放置肯定的时间，使斜面无冷凝水呈现，水分适中有利于孢子生长。
配制孢子培育基还应当考虑不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择。
菌种在固体培育基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，各种氨基酸对菌落的表现不同。
氮源品种越多，消失的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
斜面培育基上用较单一的氮源，可抑制某些不正常型菌落的消失；而对分别筛选的平板培育基则需加入较简单的氮源，使其多种菌落类型充分表现，以利筛选。
因此在制备固体培育基时有两条阅历：
①供生产用的孢子培育基或作为制备砂土孢子或传代所用的培育基要用比较单一的氮源，以便保持正常菌落类型的优势；②作为选种或分别用的平板培育基，则需采纳较简单的有机氮源，目的是便于选择特别代谢的菌落。
⒉培育温度和湿度
微生物在一个较宽的温度范围内生长。
但是，要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。
一般来说，提高培育温度，可使菌体代谢活动加快，缩短培育时间，但是，菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类，对温度的敏感性是不同的。
因此，培育温度不同，菌的生理状态也不同，假如不是用最适温度培育的孢子，其生产力量就会下降。
不同的菌株要求的最适温度不同，需经实践考察确定。
例如，龟裂链霉菌斜面最适温度为36.5～37℃，假如高于37℃，则孢子成熟早，易老化，接入发酵罐后，就会消失菌丝对糖、氮利用缓慢，氨基氮回升提前，发酵产量降低等现象。
培育温度掌握低一些，则有利于孢子的形成。
龟裂链霉菌斜面先放在36.5℃培育3天，再放在28.5℃培育1天，所得的孢子数量比在36.5℃培育4天所得的孢子数量增加3～7倍。
斜面孢子培育时，培育室的相对湿度对孢子形成的速度、数量和质量有很大影响。
空气中相对湿度高时，培育基内的水分蒸发少；相对湿度低时，培育基内的水分蒸发多。
例如，在我国北方干燥地区，冬季由于气候干燥，空气相对湿度偏低，斜面培育基内的水分蒸发的快，致使斜面下部含有肯定水分，而上部易干瘪，这时孢子长得快，且从斜面下部向上长。
夏季时空气相对湿度高，斜面内水分蒸发得慢，这时斜面孢子从上部往下长，下部常因积存冷凝水，致使孢子生长得慢或孢子不能生长。
试验表明，在肯定条件下培育斜面孢子时，在北方相对湿度掌握在40％～45％，而在南方相对湿度掌握在35％～42％，所得孢子质量较好。
一般来说，真菌对湿度要求偏高，而放线菌对湿度要求偏低。
在培育箱培育时，假如相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高培育箱内的相对湿度，为了保证新奇空气的交换，培育箱每天宜开启几次，以利于孢子生长。
现代化的培育箱是恒温、恒湿，并可换气，不用人工掌握。
最适培育温度和湿度是相对的，例如相对湿度、培育基组分不同，对微生物的最适温度会有影响。
培育温度、培育基组分不同也会影响到微生物培育的最适相对湿度。
⒊培育时间和冷藏时间
丝状菌在斜面培育基上的生长发育过程可分为五个阶段：
①孢子发芽和基内菌丝生长阶段；②气生菌丝生长阶段；③孢子形成阶段；④孢子成熟阶段；⑤斜面年轻菌丝自溶阶段。
⑴孢子的培育时间 基内菌丝和气生菌丝内部的核物质和细胞质处于流淌状态，假如把菌丝断开，各菌丝片断之间的内容是不同的，有的片断中含有核粒，有的片断中没有核粒，而核粒的多少亦不匀称，该阶段的菌丝不相宜于菌种保存和传代。
而孢子本身是一个单独的遗传体，其遗传物质比较完整，因此孢子用于传代和保存均能保持原始菌种的基本特征。
但是孢子本身亦有年轻与年轻的区分。
一般来说年轻的孢子不如年轻孢子，由于年轻的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。
孢子的培育工艺一般选择在孢子成熟阶段时终止培育，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散孢子，假如连续培育，则进入斜面年轻菌丝自溶阶段，表现为斜面外观变色、发暗或黄、菌层下陷、有时消失白色斑点或发黑。
白斑表示孢子发芽长出其次代菌丝，黑色显示菌丝自溶。
孢子的培育时间对孢子质量有重要影响，过于年轻的孢子经不起冷藏，如土霉素菌种斜面培育4.5天，孢子尚未完全成熟，冷藏7～8天菌丝即开头自溶。
而培育时间延长半天（即培育5天），孢子完全成熟，可冷藏20天也不自溶。
过于年轻的孢子会导致生产力量下降，孢子的培育时间应掌握在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培育。
⑵孢子的冷藏时间 斜面孢子的冷藏时间，对孢子质量也有影响，其影响随菌种不同而异，总的原则是冷藏时间宜短不宜长。
曾有报道，在链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏2个月后的发酵单位比冷藏1个月的低18％，冷藏3个月后则降低35％。
⒋接种量
制备孢子时的接种量要适中，接种量过大或过小均对孢子质量产生影响。
由于接种量的大小影响到在肯定量培育基中孢子的个体数量的多少，进而影响到菌体的生理状态。
凡接种后菌落匀称分布整个斜面，模糊可分菌落者为正常接种。
接种量过小则斜面上长出的菌落稀疏，接种量过大则斜面上菌落密集一片。
一般传代用的斜面孢子要求菌落分布较稀，适于选择单个菌落进行传代培育。
接种摇瓶或进罐的斜面孢子，要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求标准。
一般一支高度为20cm、直径为3cm的试管斜面，丝状菌孢子数要求达到107以上。
接入种子罐的孢子接种量对发酵生产也有影响。
例如，青霉素产生菌之一的球状菌的孢子数量对青霉素发酵产量影响极大，若孢子数量过少，则进罐后长出的球状体过大，影响通气效果；若孢子数量过多，则进罐后不能很好地维持球状体。
除了以上几个因素需加以掌握之外，要获得高质量的孢子，还需要对菌种质量加以掌握。
用各种方法保存的菌种每过1年都应进行1次自然分别，从中选出形态、生产性能好的单菌落接种孢子培育基。
制备好的斜面孢子，要经过摇瓶发酵试验，合格后才能用于发酵生产。
㈡影响种子质量的因素及其掌握
种子质量主要受孢子质量、培育基、培育条件、种龄和接种量等因素的影响。
摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏度以及糖氮代谢、pH值变化等为指标，符合要求方可进罐。
种子的质量是发酵能否正常进行的重要因素之一。
种子制备不仅是要供应肯定数量的菌体，更为重要的是要为发酵生产供应适合发酵、具有肯定生理状态的菌体。
种子质量的掌握，将以此为动身点。
⒈培育基
种子培育基的原材料质量的掌握类似于孢子培育基原材料质量的掌握。
种子培育基的养分成分应适合种子培育的需要，一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培育基，在养分上易于被菌体直接汲取和利用，养分成分要适当地丰富和完全，氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗大并具有较强的活力。
另一方面，培育基的养分成分要尽可能地和发酵培育基接近，以适合发酵的需要，这样的种子一旦移入发酵罐后也能比较简单适应发酵罐的培育条件。
发酵的目的是为了获得尽可能多的发酵产物，其培育基一般比较浓，而种子培育基以略淡薄为宜。
种子培育基的pH值要比较稳定，以适合菌的生长和发育。
pH值的变化会引起各种酶活力的转变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。
例如，种子培育基的pH值掌握对四环素发酵有显著影响。
⒉培育条件
种子培育应选择最适温度，前面已有叙述。
培育过程中通气搅拌的掌握很重要，各级种子罐或者同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，应区分掌握，一般前期需氧量较少，后期需氧量较多，应适当增大供氧量。
在青霉素生产的种子制备过程中，充分的通气量可以提高种子质量。
例如，将通气充分和通气不足两种状况下得到的种子都接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。
但是，在土霉素发酵生产中，一级种子罐的通气量小一些却对发酵有利。
通气搅拌不足可引起菌丝结团、菌丝粘壁等特别现象。
生产过程中，有时种子培育会产生大量泡沫而影响正常的通气搅拌，此时应严格掌握，甚至可考虑转变培育基配方，以削减发泡。
对青霉素生产的小罐种子，可采纳补料工艺来提高种子质量，即在种子罐培育肯定时间后，补入肯定量的种子培育基，结果种子罐放罐体积增加，种子质量也有所提高，菌丝团明显削减，菌丝内积蓄物增多，菌丝粗大，发酵单位增高。
⒊种龄
种子培育时间称为种龄。
在种子罐内，随着培育时间延长，菌体量渐渐增加。
但是菌体繁殖到肯定程度，由于养分物质消耗和代谢产物积累，菌体量不再连续增加，而是渐渐趋于老化。
由于菌体在生长发育过程中，不同生长阶段的菌体的生理活性差别很大，接种种龄的掌握就显得特别重要。
在工业发酵生产中，一般都选在生命力极为旺盛的对数生长期，菌体量尚未达到最高峰时移种。
此时的种子能很快适应环境，生长繁殖快，可大大缩短在发酵罐中的迟滞期（调整期），缩短在发酵罐中的非产物合成时间，提高发酵罐的利用率，节约动力消耗。
假如种龄掌握不适当，种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会消失前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起特别发酵等等；而种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产力量衰退。
在土霉素生产中，一级种子的种龄相差2～3h，转入发酵罐后，菌体的代谢就会有明显的差异。
最适种龄因菌种不同而有很大的差异。
细菌的种龄一般为7～24h，霉菌种龄一般为16～50h，放线菌种龄一般为21～64h。
同一菌种的不同罐批培育相同的时间，得到的种子质量也不完全全都，因此最适的种龄应通过多次试验，特殊要依据本批种子质量来确定。
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