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间接ELISA检测抗血清效价

姓名：

王贤臣学号：

1125400080

（成都医学院医学检验成都610500）

【摘要】目的：

通过实验掌握间接酶联免疫吸附测定技术（ELISA）的原理及

操作过程及间接ELISA检测抗血清效价的实验条件优化及效价的确定。

方法：

间接ELISA双抗体夹心法对包被抗原及酶标抗体工作浓度进行探索。

结果：

经过预实验初步确定抗人白蛋白血清包被浓度和一二抗的浓度，然后在正式实验确定其浓度，从而再进行研究。

讨论：

间接ELISA检测抗血清效价的影响因素。

并将预实验方法的结果与确定实验的结果进行对比，和分析在实验过程中的注意事项。

【关键词】抗人白蛋白ABLELISA

前言：

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展为体液标本中微量物质的测定方法。

之一方法的基本原理是：

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持器免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原后抗体即保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大的放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

实验方法：

预实验设计方案：

1、材料与方法

1.1仪器：

洗板机（BIO-RADMODEL1575）

SM自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所BIO-RAD

680）

电热恒温箱（上海恒科技仪器有限公司）移液枪（上海求精生化试剂仪器有限公司）微孔反应板刻度吸管（5ml、1ml）

吸耳球试管架塑料试管封口纸烧杯

1.2试剂：

人ALB标准品（SIGMA:

A1653SIZE:

250MGstorage:

2-8C）

PBS缓冲液：

0.1MpH7.4（PBS1L配方pH7.4:

磷酸二氢钾

（KH2PO4）0.2g,十二水水磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）3.58g氯化钠（NaCI）8.0g，氯化钾（KCI）0.2g，加水至1000mL）包被液：

0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液

洗涤液：

0.05%Tween-PBS即卩PBST）（0.05%Tween-PBS1000mlPBS加500ul吐温）

封闭液：

1斯酪素-PBST（1%酪蛋白溶液lOOmIPBS加1g干酪素）显色液（A液、B液Cat:

ME002可溶性TMB显色液）

终止液：

2MH2SO4

酶标抗体（兔抗羊--HRP，武汉博士德生物工程有限公司）

1.3待测标本：

羊抗人ALB（效价1:

70批号：

201106贮存于4-20C，有

效期：

2年）

1.4方法：

①预实验

包被抗原（100ul/孑L）

J4C过夜或37C2h洗涤3次拍干

加封闭液（300ul/孑孑）

J4C过夜或37T2h洗涤3次拍干

加入标本（100ul/孑孑）

J37T1h洗涤5次拍干

加入酶标抗体（100ul/孔）拍干

J37T1h洗涤5次

加入显色剂A、B液各50ul/孔

J37T15-20min

加入终止液（100ul/孔）

检测

表1:

包被抗体和酶标记抗体棋盘滴定

羊抗人ALB血清

兔抗

兔

1：

羊

■

抗

■

•

IgG-

羊

IgG

-HR

人

000

羊抗人ALB血清

兔抗

兔

羊

■

抗

■

•

igG-

羊

IgG

-HR

人

1600

000

（1）将人ALB用包被液稀释为:

0.01ug/ml0.1ug/ml1ug/ml10ug/ml

（2）酶标结合物（兔抗羊IgG-HRP稀释为：

5001:

20001:

80001:

16000

（3）抗人白蛋白血清（羊抗人ALB血清）稀释为:

101:

401:

1601:

6401:

2560

在初步结果的基础上继续细化工作浓度，重新检测以确定最终最适包被抗原和酶标抗体的最终工作浓度，即建立间接

ELISA法检测抗人白蛋白血效价。

②正式

包被抗原（100ul/孔）

J4C过夜或37C2h洗涤3次

加封闭液（300ul/孔）

J4C过夜或37E2h洗涤3次

加入标本（100ul/孔）

J37Elh洗涤5次拍干加入酶标抗体（100ul/孔）拍干

J37Elh洗涤5次

加入显色剂AB液各50ul/孔

J37°C15-20min

加入终止液（100ul/孔）

检测

表2:

包被抗体和酶标记抗体棋盘滴定

包被抗原的浓度为0.1ug/ml0.01ug/ml

OD值

拍干

，每个浓度做三排，共做六排，测出

羊抗人ALB血清

兔

抗

羊

IgG

-H

000

600

兔抗羊

igG-H

000

600

人ALB:

0.1ug/ml

羊抗人ALB血清

40166425

0060

1040

2496

人ALB:

0.01ug/ml

2、结果

①预实验：

表3:

我们组预实验结果

25-13

2.351

2.2^2

2-417

1903

1.0S9

2095

20B3

2.111

2.07-1

2.517

2001

r»

Z珂

1.895

2.1E7

2.252

2.296

1229

1.619

2.338

2^00

2㉑4

2.322

1.542

2391

2.383

2一4鹃

2.323

2152

0却

2371

2269

2.107

2'.123

1.6&6

0.339

2.301

2.181

2.200

2.361

1.713

0.200

1114

2.140

2.157

1,610

1.666

U.2G4

2.579

2.^07

1.8E&

2.315

Z.302

1.017

2.4引

2.^00

2.42^

134

2.357

2.2别

2.532

2.539

2^10

2.331

2.100

L002

1.999

2.235

2328

2226

2.0^1

1.483

2.470

2AU

2.159

1.939

0.241

1,658

2,151

2.105

L275

1.275

0.467

2.253

2.193

1.B51

1南9

1.029

0.153

2.239

2.023

1.6K

0.733

0L536

U.188

确定最适抗原浓度取每个区域中二抗浓度同一行的五个数据进行分析，共得

出20张线性关系图，取R值最大且稀释比例最大的区域为最适抗原浓度

确定二抗浓度在确定包被抗原浓度后取该区域中二抗浓度同一行的五个

数据进行分析共得出4张线性关系图，取R值最大0D值最大不超过2且稀释比例最大的区域为最适二抗浓度

人ALB1ug/ml

人ALB0.1ug/ml

人ALB0.01ug/ml

羊抗人ALBM清稀释浓度

注：

1、系列1、2、3、4分别为兔抗羊IgG-HRP1:

500、1:

2000、1:

8000、1:

16000稀释与不同羊抗人血清稀释浓度（1:

10、1：

40、1：

160、1：

640、1：

2560）对应所得的吸光度图像

2、X轴1、2、3、4、5分别对应羊抗人血清稀释浓度1:

10、1：

40、1：

160、1：

640、1：

2560由上述四图得：

包被抗原浓度在10ug/ml1ug/ml0.1ug/ml时数据跳动大对结

果意义不大。

而包被抗原浓度在0.1ug/ml时跳动稍小。

因此的包被抗原浓度在

0.1~1ug/ml二抗浓度在1/8000~1/16000最适。

2正式：

表4:

我们组正式实验结果跳动很大不成线性关系无分析意义我们以第四组的正

式实验结果进行分析

1、

0htM

（JbHH

0654

IJ14

fl977

063

ID4ll

（i

HG7

039Z

04li

1J27

OD6

0766

0760

0612

「＜3

1Vi1.

236

1074

0B6S

71n

）173

f091

]130

0702

1US

0Si3Q斗9j

注：

H、G、F、E、D、C、B、A分别对应羊抗人ALB血清稀释浓度1:

、1:

40、1:

160、1:

640、1:

2560、1:

10240、1:

40960、

PBS

1、2、3、4、5、6分别对应兔抗羊IgG-HRP稀释浓度1:

8000、1:

10000、1:

16000、1:

8000、1:

10000、1:

16000

将人ALB:

0.1ug/ml0.01ug/ml条件下兔抗羊IgG-HRP稀释浓度1:

8000、1:

10000、1:

16000、1:

8000、1:

10000、1:

16000同一行的7个数据进行分析，共得出6张线性关系图，取OD值最大不超过2且吸光度随稀释倍数的增加呈线性变化的曲线所对应的数值作为正式实验结果分析的依据得出效价

210

度光吸

人ALB0.1ug/ml

234567

羊抗人ALBM清稀释浓度

人ALB0.01ug/ml

■+系列1-■—系列2—系歹U3

羊抗人ALB&清稀释浓度

5150a度光吸

注：

系列1、2、3分别对应兔抗羊

IgG-HRP稀

释浓度1:

8000、1:

10000、1:

16000

X轴1、2、3、4、5、6、7分别对应羊抗人血清稀释浓度1:

10、1:

40、1:

160、1:

640、1:

2560、1:

10240、1:

40960

取OD值最大不超过2且吸光度随稀释倍数的增加呈线性变化的曲线所对应的数值作为正式实验结果分析的依据得出效价

由上两图六张曲线的对比在人ALB:

0.1ug/ml兔抗羊IgG-HRP稀释浓度1:

8000条件下吸光度随稀释倍数的增加呈线性变化最为明显，所以本次实验应以该组实验数据来计算抗血清效价。

101:

401:

1601:

6401:

25601:

102401:

40960阴性对照

1.711.3311.0461.0630.6840.7020.4510.798

COV=0.1+OD阴性对照

COV=0.1+0.798=0.898

阳性：

0D样品》COV

阴性：

OD样品vCOV

所以抗血清效价为1:

640

3、讨论

在本次实验中我们组顺利测出预实验结果数据，正式实验未能准确的测量到位，可能原因有

1在实验加样过程中，溶液加样量不均；

2当再加入显色液A、显色液B时在孵育过程中对于颜色变化没有掌握好从而导致颜色过深无法检测其吸光度；

3在加二抗孵育结束后再洗完板后由于时间关系必须得等几天才能继续试验，但在保存过程中没有将板拍干，从而会使结果偏差；

4在实验时，拍板未能拍干；

同时在用间接酶联免疫吸附测定技术ELISA的双抗体夹心法测定抗血清效价中影响实验结果的因素有：

（1）实验是由多个人进行操作个人手法不一样很容易引起误差；

（2）包被抗原时，因为试剂没有配够，整块板子的抗原前后配制了3次，浓度误差大大增加，对结果造成影响；

（3）加入封闭液后放入冰箱内隔了好几天才拿出来进行洗板，拿出来时看到板子的底部有很多白色的沉淀物，很有可能是滋生了很多杂菌，污染了抗原；

（4）第一次预实验的封闭过程进行了三天，极有可能是造成背景过高的首要原因；

（5）加入显色液后看到显色梯度但是没有立即加入终止液导致测量结果没有出现理想值。

而且大家由于操作不熟练加液速度非常慢，也可能影响显色进而影响结果；

（6）在加一抗和二抗时用手指放在反应板上，手上很多杂质比如蛋白质，汗液污染了板，继而影响了板底得抗原或者一抗二抗等物质。

4、结论

在本次实验中我们组顺利测出预实验结果数据，正式实验未能准确的测量到位。

根据数据得出包被抗原最适浓度在0.01ug/ml-0.1ug/ml，二抗最适比例在

1：

8000及1：

16000。

在正式实验时数据跳动大没有多大的实际参考价值。

但测得第四组的结果效价为1：

640

参考文献：

[1李宏杰，方磊，程家坤，祖华.ELISA（双抗体夹心法）共系统检测抗-HBe与HBeAg结果分析.[J]中国现代医生，2007.10

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