第二章基因工程习题答案.docx
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第二章基因工程习题答案
基因工程课程习题选择题
001基因工程操作的三大基本元件是【Ａ】
I供体II受体III载体IV抗体V配体
ＡI+II+III
ＢI+III+IV
ＣII+III+IV
ＤII+IV+V
ＥIII+IV+V
002根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【E】
I分离纯化基因II大量生产生物分子III构建新型物种IV提高基因重组效率
ＡI+II+III
ＢI+II+IV
ＣI+III+IV
ＤII+III+IV
ＥI+II+III+IV
003根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【A】
Ａ基因诱变
Ｂ分子克隆
ＣDNA重组
Ｄ遗传工程
Ｅ基因无性繁殖
004基因工程的单元操作顺序是【B】
Ａ增，转，检，切，接
Ｂ切，接，转，增，检
Ｃ接，转，增，检，切
Ｄ检，切，接，增，转
Ｅ切，接，增，转，检
005下列有关基因的叙述，错误的是【A】
Ａ蛋白质是基因表达的唯一产物
Ｂ基因是DNA链上具有编码功能的片段
Ｃ基因也可以是RNA
Ｄ基因突变不一定导致其表达产物改变结构
Ｅ基因具有方向性
006限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是【D】
Ａ修复自身的遗传缺陷
Ｂ促进自身的基因重组
Ｃ强化自身的核酸代谢
Ｄ提高自身的防御能力
Ｅ补充自身的核苷酸消耗
007天然PstI限制性内切酶的来源是【D】
ＡBacillusamyloliquefaciens
ＢEscherichiacoli
ＣHaemophilusinfluenzae
ＤProvidenciastuartii
ＥStreptomyceslividans
008T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起，其底物的关键基团是【D】
Ａ2'-OH和5'-P
Ｂ2'-OH和3'-P
Ｃ3'-OH和2'-P
Ｄ3'-OH和5'-P
Ｅ5'-OH和3'-P
009若载体DNA用M酶切开，则下列五种带有N酶粘性末端的外源DNA片段中，能直接与载体拼接的是【D】
M N
ＡA/AGCTTT/TCGAA
ＢC/CATGGACATG/T
ＣCCC/GGGG/GGCCC
ＤG/GATCCA/GATCT
ＥGAGCT/CG/AGCTC
010下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是【B】
Ａ质粒是共价环状的双链DNA分子
Ｂ天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列
Ｃ质粒在宿主细胞内能独立于染色体DNA自主复制
Ｄ松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增
Ｅ质粒并非其宿主细胞生长所必需
011带有多个不同种复制起始区的质粒是【A】
Ａ穿梭质粒
Ｂ表达质粒
Ｃ探针质粒
Ｄ整合质粒
Ｅ多拷贝质粒
012下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【A】
ＡCosmid>λ-DNA>Plasmid
Ｂλ-DNA>Cosmid>Plasmid
ＣPlasmid>λ-DNA>Cosmid
ＤCosmid>Plasmid>λ-DNA
Ｅλ-DNA>Plasmid>Cosmid
013目前在高等动物基因工程中广泛使用的载体是【C】
Ａ质粒DNA
Ｂ噬菌体DNA
Ｃ病毒DNA
Ｄ线粒体DNA
Ｅ叶绿体DNA
014若某质粒带有lacZ标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【D】
Ａ半乳糖
Ｂ葡萄糖
Ｃ蔗糖
Ｄ5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷（X-gal）
Ｅ异丙基巯基-b-半乳糖苷（IPTG）
015质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是【C】
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构很小
④蛋白质 ⑤环状RNA ⑥环状DNA
⑦能“友好”地“借居”
A①③⑤⑦
B②④⑥
C①③⑥⑦
D②③⑥⑦
016双脱氧末端终止法测定DNA序列是基于【A】
ＡDNA的聚合反应
ＢDNA的连接反应
ＣDNA的降解反应
Ｄ特殊的DNA连接酶
Ｅ聚合单体2'和5'位的脱氧
017下列三种方法中，能有效区分重组子与非重组子的是【E】
I限制性酶切IIPCR扩增III抗药性筛选
ＡI
ＢI+II
ＣI+III
ＤII+III
ＥI+II+III
018鸟枪法克隆目的基因的战略适用于【A】
Ａ原核细菌
Ｂ酵母菌
Ｃ丝状真菌
Ｄ植物
Ｅ人类
019cDNA第一链合成所需的引物是【D】
ＡPolyA
ＢPolyC
ＣPolyG
ＤPolyT
Ｅ发夹结构
020TaqDNA聚合酶的发现使得PCR技术的广泛运用成为可能，这是因为【D】
ＡTaqDNA聚合酶能有效地变性基因扩增产物
ＢTaqDNA聚合酶催化的聚和反应不需要引物
ＣTaqDNA聚合酶具有极强的聚和活性
ＤTaqDNA聚合酶能使多轮扩增反应连续化
ＥTaqDNA聚合酶能使扩增反应在DNA变性条件下进行
021为了利用PCR技术扩增下列染色体DNA片段上的虚线部分，应选用的引物顺序是【D】
ＡI+II
ＢI+III
ＣI+IV
ＤII+III
ＥII+IV
022构建基因文库一般使用的载体是【E】
I质粒IIλ-DNAIIICosmid
ＡI
ＢII
ＣIII
ＤII+III
ＥI+II+III
023强化基因转录的元件是【C】
Ａ密码子
Ｂ复制子
Ｃ启动子
Ｄ内含子
Ｅ外显子
024启动子的特征之一是【B】
ＡGC富积区
ＢTATABox
Ｃ转录起始位点
Ｄ长度平均1kb
Ｅ含有某些稀有碱基
025下列基因调控元件中属于反式调控元件的是【A】
Ａ阻遏蛋白
Ｂ启动子
Ｃ操作子
Ｄ终止子
Ｅ增强子
026包涵体是一种【E】
Ａ受体细胞中难溶于水的蛋白颗粒
Ｂ大肠杆菌的亚细胞结构
Ｃ噬菌体或病毒DNA的体外包装颗粒
Ｄ用于转化动物细胞的脂质体
Ｅ外源基因表达产物的混合物
027外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是【Ｅ】
I融合基因能稳定扩增II融合蛋白能抗蛋白酶的降解III表达产物易于亲和层析分离
ＡIII
ＢI+II
ＣI+III
ＤII+III
ＥI+II+III
028第二代基因工程是指【C】
Ａ途径工程
Ｂ代谢工程
Ｃ蛋白质工程
ＤRNA基因工程
Ｅ细胞器基因工程
029基因工程菌中重组质粒的丢失机制是【Ｃ】
Ａ重组质粒渗透至细胞外
Ｂ重组质粒被细胞内核酸酶降解
Ｃ重组质粒在细胞分裂时不均匀分配
Ｄ重组质粒杀死受体细胞
Ｅ重组质粒刺激受体细胞提高其通透性
030利用毛细管作用原理，将凝胶电泳分离后的DNA片段转移至硝酸纤维素膜上并根据核酸杂交原理进行分析的技术是【Ｄ】
ＡWestern印迹转移技术
ＢNorthern印迹转移技术
Ｃ基因的表现型分析法
ＤSouthern印迹转移技术
031在翻译过程中．mRNA必需首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。
在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码AUG，另一个是【Ｃ】
Ａ启动子
Ｂ调节基因
ＣSD序列
Ｄ终止子
二、填空题答案
1、Ⅱ型限制性内切酶可特异性地识别呈双重螺旋对称结构的特定双链DNA序列并进行切割。
如BstBⅠ（TTCGAA）消化可产生含5′CG3′的5′磷酰基端黏性末端末端，PstⅠ（CTGCAG）消化可产生5′TGCA3′的3′－OH端黏性末端，而SmaⅠ（CCCGGG）消化产生平末端。
2、识别顺序相同但切割位点不同者称同位酶，识别顺序与切割方式均相同者称同裂酶，来源与识别顺序均不同，但切割后形成的限制性片段有相同的粘性末端，称同尾酶。
3、受体细胞经过一些特殊方法（如：
CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过，这种细胞称为感受态细胞。
4、在翻译过程中，mRNA必需首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。
在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码AUG，另一个是SD序列。
5、在提取分离DNA的过程中，加入酚-氯仿、去垢剂或酶的目的是使蛋白质变性或水解，除去蛋白质，使用金属离子螯合剂如EDTA等的原因是细胞内有金属离子，如Mg2+，是酶活性的辅助因子，会使DNA被DNase分解，故除去使DNase活性的Mg2+以保护DNA不被变性或降解。
在小批量碱变性提取质粒过程中加入醇溶液的目的是是DNA变性沉淀，并除去蛋白质、糖类等其他水溶性杂质，使之分离，加入Rnase的目的是除去DNA沉淀中的RNA，是凝胶电泳检测时条带更明显。
6、PCR的全称是聚合酶链式反应，它是一种在体外模拟DNA复制方式选择性地扩增DNA特殊区域的技术。
它是在四种脱氧核苷三磷酸存在下，以寡聚核苷酸为引物及单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程，其基本反应步骤为高温变性、低温退火和适温延伸，并循环n次，达到扩增目的。
7、采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子或其他生物样品有序地固化于支持物表面，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量的技术称为生物芯片技术，根据固定的探针不同，可分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片。
该技术具有高通量、快速高效、高度灵敏等特点。
8、根据Southernblot的结果可以说明被检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等，Northernblot则用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量，而Westernblot的结果可以明被检测基因在蛋白质水平上的表达状况。
9、基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系称为表达系统。
10、用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接送入完整的植物组织或者细胞中，这一方法称为基因枪法。
基因工程课程习题问答题
1、基因工程的操作过程的主要步骤包括哪些？
切、接、转、增、筛（检）
（1）切——获得DNA片段，取得目的基因；载体的选择与制备。
方法：
从生物基因组中分离得到——基因组DNA——>酶切产物
从总RNA中分离得到mRNA，再逆转录得到cDNA
人工合成——化学合成；PCR（聚合酶链式反应）
（2）接——DNA片段和载体DNA在体外连接，形成重组子。
（3）转——将重组的DNA引入宿主细胞
方式：
转化——某一基因型细胞从周围介质中吸收另一基因型细胞的DNA，而使其基因型和表型发生相应变化的现象；转染——除去蛋白质外壳的病毒核酸感染细胞或原生质体的过程；转导——用噬菌体做载体，将一个细胞的基因传递给另一个细胞的过程。
还有显微注射等。
（4）增——培养已转化细胞，使目的基因在其中进行复制、扩增，并将其整合到受体细胞的基因组中。
（5）筛、检——重组子的筛选与鉴定。
筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效表达的基因工程菌或细胞。
2、什么是限制性核酸内切酶？
第二型限制酶有何特点？
限制性核酸内切酶（限制酶，restrictionendonuclease）是一类能够识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的核酸内切酶。
第二型限制酶特点:
2亚基，单辅因子;识别序列是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定核苷酸序列，识别位点双重旋转对称结构，切割与识别位点相同或相近。
分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，不需ATP。
3、分析影响限制性内切酶酶切的因素有哪些？
（1）温度：
大部分限制性内切酶最适反应温度为37℃，少数酶高于或低于这个温度。
（2）时间：
合适，大多为1h，可过夜反应。
（3）溶液体系：
要求有稳定的pH环境。
标准的缓冲溶液中含有氯化钙、氯化镁或氯化钾、Tris-HCl、β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）以及牛血清蛋白质（BSA）和Mg2+，具有一定的酸碱值即pH值。
（4）盐离子浓度：
不同的限制性内切酶对盐离子强度（Na+）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。
Mg2+也是限制性内切酶酶切反应所需。
（5）反应体积和甘油浓度：
在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。
（6）DNA的纯度和结构：
DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应速度和酶切的完全度，酶切的底物一般是双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。
4、一个典型的原核表达质粒的主要元件有哪些？
《基因工程》P53
能在宿主细胞中自主复制的序列即复制子；控制转录的启动子如lac、trp等；选择标记的编码序列如各种抗生素抗性基因；多克隆位点（MCS）；转录调控序列，如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子ATG等。
5、以人工构建的pBR322质粒为例说明基因工程载体的特点。
v有多个限制性内切酶单一位点（EcoRⅠ，HindⅢ等）
v四环素抗性基因Tetr和氨苄青霉素抗性基因Ampr，且Tetr中有BamHI（G↓GATCC）切点，Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）和SalI切点（GTCGAC）。
可以通过AmprTets来筛选重组体。
——插入失活筛选原理。
v在细胞中是多拷贝的，是松弛型复制子。
v具有复制起始点（ori）。
v分子量较小，安全。
6、小批量碱变性提取质粒DNA的原理与基本过程如何？
碱变性法是常用的质粒抽提方法，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
小批量碱变性提取质粒DNA的基本过程为——
（1）酶或机械法等方法破坏细胞，释放出胞内物质；
（2）加碱使DNA与蛋白质变性，加中和液复性。
因为质粒DNA分子量小易复性，从而使得其与基因组DNA分离；
（3）在上清液中通过酚－氯仿抽提、去垢剂或酶使剩余蛋白质变性或水解，除去蛋白质；
（4）再加入醇溶液使质粒DNA变性沉淀而与其他水溶性物质分离；
（5）将沉淀溶解于有RNase的TE溶液中，温育降解RNA后电泳检测、-20℃保存。
7、什么是基因文库？
基因组文库与cDNA文库制备方法有何区别？
通过克隆技术将大分子DNA编码的全部或者绝大多数基因或基因组进行扩增后的DNA片段混合物，称为基因文库或DNA文库、克隆库。
分为基因组文库和cDNA文库两种。
基因组DNA文库的制备：
从生物组织细胞提取出全部DNA，用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将DNA降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或YAC载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体，就是基因组文库。
cDNA文库的制备：
提取出组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，许多细胞一起组成包含着某细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
8、PCR的定义、原理、方法？
在生命科学领域有何具体用途？
一种在体外模拟DNA复制方式选择性的扩增DNA特殊区域的技术，又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法。
是在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物及单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程。
原理与方法:
1.高温变性双链DNA在高温下解链（变性）变成单链的过程;
2.低温退火降温后变性的单链DNA可按照A=T,C三G特异性配对的原则重新结合恢复双链结构;同模板DNA特异性互补结合的引物的结合
3.适温延伸DNA聚合酶的酶促作用,即可沿引物DNA的5’向3’
末端合成、延长与模板互补的核苷酸链;
4.循环n次。
用途：
1.特异性扩增目的（模板）DNA。
2.特异性检测目的RNA（如表达水平）（通过反转录酶反应）
3.用于基因重组（扩增特定DNA片段）
4.制备特异性探针
5.用于DNA测序
6.用于基因定位分析
7.通过诱变寡核苷酸引物产生各种突变体
8.用于分析基因组DNA的多态性（RandomAmplifiedPoly-morphicDNA=RAPD）
9.构建cDNA或基因组DNA文库（从mRNA或基因组DNA中）
10.实时荧光定量PCR：
DNA或RNA的绝对定量分析
9、琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么？
琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。
具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子泳动速度不一样。
10、什么是原位杂交技术？
其基本过程如何？
根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组转化体菌落位置的技术。
基本过程：
（1）将硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上。
（2）取出滤膜，作溶菌、碱变性（0.5mol/LNaOH），酸中和（Tris.ClpH7.4）等处理后，转移到一张干的滤纸上，置于室温20~30min，使滤膜干燥。
将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱中于80℃烘烤2h，固定DNA。
（3）带有DNA印迹的滤膜同32P标记的适当探针杂交、以检测带有重组质粒（含有被研究的DNA插入片段）的阳性菌落。
（4）将放射自显影的X光底片同保留下来的原菌落平板对照，从中挑出阳性菌落供作进一步的分析研究
。
11、什么是启动子?
什么是SD序列？
启动子（promoter，P）：
是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列（40bp-60bp）。
富含A-T碱基对，具有保守序列：
-10区（pribnowbox）：
TATAAT；-35区：
不同的启动子的效率不同，强启动子指导产生较多量的mRNA，弱启动子指导下转录合成的mRNA很少。
启动子的强度主要决定于启动子的结构。
原核生物RNA聚合酶不能识别真核细胞启动子，因此真核基因在原核生物表达时，应将真核基因置于原核生物强启动子下，以实现高效转录。
在原核生物中，mRNA起始密码子AUG上游3-11bp处一段能与16SrRNA3’端序列互补的富含嘌呤的碱基序列称为SD序列（SDsequence）。
mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码AUG，另一个是起始密码AUG上游处的一段的序列．后者称为SD序列。
12、什么是操纵子？
请用简图表示操纵子的基本结构并以乳糖操纵子负调控系统（阻遏蛋白调控作用）为例说明其功能。
操纵子是原核生物转录单位。
操纵子组成为结构基因连同其上游的调控序列（启动子promotorP、操纵基因operatorO、其他调节序列）共同构成一个操纵子。
无诱导物（乳糖）时，阻遏物基因I产生的阻遏蛋白与操纵基因结合，位点关闭，RNA多聚酶通不过，转录不进行，基因关闭；
有诱导物（乳糖）时，诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白失活，从o点脱离，o位点打开，RNA多聚酶通过，Z、Y、A转录。
即基因表达。
13、为什么用原核表达系统表达真核生物的蛋白质时，克隆的真核基因不能来自基因组文库？
真核基因应如何获得？
对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
因为原核细胞不具有mRNA转录后加工系统，不能进行剪接、去除内含子等操作，所以
用原核表达系统表达真核生物的蛋白质时，克隆的真核基因不能来自基因组文库，应从cDNA文库中获得，或者通过提取mRNA后RT-PCR方法获得。
14、如何提高真核基因在原核宿主中的表达效率？
（1）选择合适载体，提高翻译水平
⏹强启动子——提高转录水平
⏹核糖体结合位点（ATG-SD）距离合适
在基因重组过程中应将结构基因接于SD序列之后．以便为mRNA提供核糖体结合位点，提高真核基因表达效率。
⏹避免产物降解：
分泌/融合表达；（融合蛋白表达后再去除原核肽段）
（2）选择合适宿主（如Lac启动子——LacI菌；PL/PR——CI857溶源菌）
（3）调节宿主细胞代谢
为保持宿主正常生长速度及重组转化体稳定性，维持产物的高效表达，必需采用适当方法，调节细胞代谢。
目前，调节细胞代谢方法很多。
如营养物浓度控制、产物诱导表达、载体诱导复制及促进产物分泌等。
15、什么是基因诊断？
基因诊断中常用的方法有哪些？
试简述其中一种方法的原理。
基因诊断是指用分子生物学的技术对引起疾病的原因——遗传基因、致病微生物和寄生虫,以及某些恶性肿瘤在基因水平上进行病原学和细胞遗传基因的检测和分析。
基因诊断中常用的方法有核酸分子杂交、PCR、DNA芯片技术、限制酶酶谱分析和DNA序列测定等。
核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。
它的基本原理是：
互补的核酸单链能够在一定条件下结
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