HIV病毒检测方法及其检测试剂盒样本.docx

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HIV病毒检测方法及其检测试剂盒样本

（54）创造名称

HIV病毒RT-LAMP-LFD检测办法及其检测试剂盒

（57）摘要

本创造公开了一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒及其检测办法。

该检测办法是依照GenBank发布HIV病毒序列保守区域设计HIVRT-LAMP-LFD反映系统所需引物与探针;采用本创造人配制RNA提取试剂提取HIV病毒RNA，使用本创造建立RT-LAMP反映体系进行检测，根据反映体系加入检测探针，在反映结束后运用核酸迅速检测试纸鉴定成果。

同当前HIV病毒惯用检测技术相比，本创造有助于实现初期诊断，避免漏检，有助于提高检测敏捷性、缩短检测时间，是HIV诊断办法持续发展重要方向。

1.一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测办法，其特性在于涉及如下环节:

（HIV病毒）RNA提取:

（1）取20-35mg具有HIV病毒血液组织，加入300-500uL裂解液匀浆，离心;

（2）取环节

（1）离心所得上清液，与等体积70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻

璃纤维素膜结合;

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;

（4）用RNasefreewater洗脱玻璃纤维素膜上吸附RNA;

（5）配制预反映液，所述预反映液体积为15-20uL，涉及:

1.5-2.0mmol/L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol/L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.pH8.5-9.5Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%TritonX-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I.dNTP，1-3U逆转录酶AMV，5-15UBstDNA聚合酶大片段引物HIV-FIP序列见SEQIDN0:

1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:

2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:

3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:

4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:

（6）在16-25uL预反映液中加入4-10uL环节（4）所得RNA作为模板，控制反映体系总体积为20-25uL然后在温度为60-65°C，反映15-65min；

LFD试纸检测:

（7）取环节（6）所得LAMP扩增反映产物6-10uL滴到LFD试纸点样处，然后在

点样处前端滴上60-100uL缓冲液，5-20分钟后依照试纸条上显色带鉴定检测成果。

2.依照权利规定1所述（HIVRT-LAMP-LFD检测办法），其特性在于:

所述裂解液涉及浓度为30-60mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCl，浓度为3-6mol/L异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L.EDTA.

3.依照权利规定1所述（HIVRT-LAMP-LFD检测办法），其特性在于:

所述去蛋白液涉及浓度为10-50mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCl，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%无水乙醇。

4.依照权利规定1所述（HIVRT-LAMP-LFD检测办法），其特性在于:

所述漂洗液涉及浓度为10-50mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%无水乙醇。

5.依照权利规定1或2或3或4所述（HIVRT-LAMP-LFD检测办法），其特性在于:

引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针MIV-FITC-PROBE为5'端FITC标记探针:

6.一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特性在于：

涉及RT-LAMP扩增反映液，16-20uLRT-LAMP扩增反映液涉及：

引物HIV-FIP序列见SEQIDN0:

1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:

2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:

3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:

4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:

7.依照权利规定6所述HIVRT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特性在于：

引物HIV-FIP序列见SEQIDN0:

1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:

2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:

3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:

4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:

8.依照权利规定6所述HIVRT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特性在于:

HIV病毒LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用缓冲液为1xTAE缓冲液，阳性对照样品为HIV基因组病毒RNA，阴性对照样品为无核酸RNasefireewater

HIV病毒RT-LAMP-LFD检测办法及其检测试剂盒

技术领域

[000l]本创造涉及哺乳动物病毒检测领域，特别涉及一种人体HIV病毒RT-LAMP-LFD检测办法及其检测试剂盒。

背景技术

[0002]HIV即人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV），顾名思义它会导致人类免疫系统缺陷。

1981年，人类免疫缺陷病毒在美国初次发现。

它是一种感染人类免疫系统细胞慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒一种。

至今无有效疗法致命性传染病。

该病毒破坏人体免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）

[0003]研究表白，人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大体呈球形。

病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒蛋白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。

向内是由蛋白p17形成球形基质（Matrix），以及蛋白p24形成半锥形衣壳（Capsid），衣壳在电镜下呈高电子密度。

衣壳内具有病毒RNA基因组、酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）以及其她来自宿主细胞成分。

其序列已测定并在GenBank上登录（登录号分别为AY222839，AY222840）。

当前该病毒检测办法有电镜法、RT-PCR检测法、TAS-FLTSA检测法等，但在实际检测工作中，既有检测技术存在如下问题:

一是敏捷度小，无法检测到潜伏感毒样品;二是容易产生假阳性，对模板质量规定高;三是操作繁琐，对实验条件规定高。

[0004]RT-LAMP是一种新型核酸等温扩增检测技术，即根据环介导等温核酸扩增技术原理，针对靶基因特定区域设计4条特异性引物，运用一种具备链置换特性DNA聚合酶和AMV逆转录酶同步作用下，使RT和LAMP反映在同管中同步进行，简化了操作环节，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。

LAMP产物检测普通采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观测、荧光染料观测等办法。

[0005]侧向流层析试纸（lateralflowdipstick，LFD）是一种检测产物新办法，运用反映体系中FITC标记探针与生物素标记LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色人为目测差别以及由非特异性扩增导致假阳性问题.LFD检测相对于其她检测手段，有操作简便且安全特点。

LAMP-LFD反映成果可以直接肉眼观测。

LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显色表达阳性，只有质控带而检测带未显色表白检测成果为阴性。

该办法具备安个、快捷、高效、高敏捷度且无高实验条件规定，适合应用推广。

目

前，该技术在艾滋病病毒（HIV）检测中未见报道。

创造内容

[0006]本创造目在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸

来检测艾滋病病毒（HIV）办法，特异性强，敏感率高。

[0007]本创造另一目在于提供一种用于上述办法检测试剂盒，该试剂盒特异性强，

敏感率高，并且操作简便快捷，克服既有检测办法不能在检查中直接应用问题，适合艾滋病病毒（HIV）筛查与防止。

[0008]本创造解决其技术问题所采用技术方案是:

一种艾滋病病毒（HIV）RT-LAMP-LFD检测办法，涉及如下环节:

病毒RNA提取:

（1）取20-35mg具有HIV病毒血液组织，加入300-500裂解液匀浆，离心;

（2）取环节

（1）离心所得上清液，与等体积70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻

璃纤维素膜结合;

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;

（4）用RNasefreewater洗脱玻璃纤维素膜上吸附RNA;

所述预反映液体积为15-20uL，涉及:

1.5-2.0mmol/L引

物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol/L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L.pH8.5-9.5Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%TritonX-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I.dNTP，1-3U逆转录酶AMV，5-15UBstDNA聚合酶大片段引物HIV-FIP序列见SEQIDN0:

1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:

2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:

3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:

4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:

（6）在16-25uL预反映液中加入4-10uL环节（4）所得RNA作为模板，控制反映体系总体积为20-25uL然后在温度为60-65°C，反映15-65min；

LFD试纸检测:

（7）取环节（6）所得LAMP扩增反映产物6-10uL滴到LFD试纸点样处，然后在

点样处前端滴上60-100uL缓冲液，5-20分钟后依照试纸条上显色带鉴定检测成果。

[0009]本创造检测办法是依照GenHank发布艾滋病病毒（HIV）序列保守区域设计了HIV病毒RT-LAMP-LFD反映系统所需引物与探针;病毒RNA提取病毒RNA，使用本创造建立RT-LAMP-LFD反映体系进行检测，根据反映体系中加入检测探针，在反映结束后运用核酸迅速检测试纸鉴定成果，成果显示在61℃30min，HIV病毒RNA获得了高效特异性扩增。

同当前HIV病毒惯用检测技术相比，本创造有助于实现初期诊断，避免漏检，有助于提高检测敏捷性、缩短检测时间，是HIV诊断办法持续发展重要方向。

[0010]作为优选，所述裂解液涉及浓度为30-60mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCl，浓度为3-6mol/L异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L.EDTA.

[0011]作为优选，所述去蛋白液涉及浓度为10-50mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCl，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%无水乙醇。

[0012]作为优选，所述漂洗液涉及浓度为10-50mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%无水乙醇。

[0013]作为优选，引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针HIV-FTIC-PROBE为5'

端FTIC标记探针。

[0014]一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特性在于：

涉及RT-LAMP扩增反映液，16-20uLRT-LAMP扩增反映液涉及：

引物HIV-FIP序列见SEQIDN0:

1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:

2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:

3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:

4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:

[0015]作为优选，引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针HIV-FTIC-PROBE为5'端FTIC标记探针。

[0016]作为优选，HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用缓冲液为1xTAE缓冲液，阳性对照样品为HIV病毒基因组RNA，阴性对照样品为无核酸RNasefireewater

[0017]本创造有益效果是:

1、本创造所采用引物组是依照HIV衣壳蛋白基因六个不同区域设计，又有RNA特异性探针相结合，特异性比常规PCR强。

[0018]2、本创造检测试剂盒检测敏捷度高，是常规PCR102-103倍。

[0019]3、本创造检测试剂盒检测时间短，可以在30-60min内获得检测成果，比常规

PCR节约3.5-4.5小时。

[0020]4、本创造检测试剂盒对仪器设备规定低，不需要普通PCR所用PCR仪、凝胶电泳和成像系统。

[0021]5、本创造中病毒RNA提取办法简朴快捷，并且不用到氯仿、巯基乙醇等有害物质。

[0022]6、本创造检测试剂盒操作环节简朴，成果直观易鉴定。

[0023]7、本创造检测试剂盒对人和环境较安，整个过程不使用有毒物质。

[0024]附图阐明

[0025]图1为扩增温度对RT-LAMP反映影响图。

100bpDNALadderMarker（TaKaRa

公司）;泳道1:

61℃恒温条件下扩增成果;泳道2:

63℃温度条件下扩增成果;泳道3:

65℃温度条件下扩增成果。

[0026]图2为MrNVRT-LAMP特异性实验成果。

l00bpDNALadderMarker（TaKaRa

公.d）;泳道1:

罗氏沼虾野田村病毒;泳道2:

南美白对虾白斑综合症病毒（WSSV）;泳道3:

草鱼呼肠孤病毒（GORV};泳道4:

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV};泳道5:

对

虾桃拉病毒（TSV）;泳道6:

阴性对照。

[0027]图3为本创造检测办法检测感染MrNV样品实验成果图。

100bpDNAladder

Marker（TaKaRa公司）;左侧泳道1：

MrNV样品RT-LAMP反映:

30min。

检测成果;左侧泳道2:

MrNV样品RT-LAMP反映45min检测成果;NT:

为阴性对照样品检测成果:

右侧为LFD试纸检测显色成果。

[0028]图4为本创造检测办法检测MrNV敏捷度比较图和LFD试纸显色对比图。

M：

100bpDNAladderMarker（TaKaRa公司）;左侧泳道1-6:

模板分别为10-1,10-2,10-3,10-4,105,106倍稀释基因组RNA;泳道7:

无模板;右侧1-7:

为左侧实验成果LFD试纸检测图。

详细实行方式

[0029]下面通过详细实行例，并结合附图，对本创造技术方案作进一步详细阐明。

[0030]本创造中，若非特指，所采用原料和设备等均可从市场购得或是本领域惯用。

下述实行例中办法，如无特别阐明，均为本领域常规办法。

[0031]本创造实行如下:

一种艾滋病病毒HIV-RT-LAMP-LFD检测办法，涉及如下环节:

病毒RNA提取:

（1）取20-35mg具有HIV病毒血液组织，加入300-500uL裂解液匀浆，离心;

（1rpm离心1-2min）

[0032]所述裂解液涉及浓度为30-60mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCl，浓度为3-6mol/L异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L.EDTA.别的为RNasefreewater。

[0033]

（2）取环节

（1）离心所得上清液，与等体积70%无水乙醇混合均匀后，将混合液

与玻璃纤维素膜结合;将混合液与玻璃纤维素膜结合详细操作为:

将混合液转入带有玻璃

纤维素膜吸附柱中，1rpm离心1-2min,弃掉废液，这样混合液与玻璃纤维素膜就结

合。

[0034]（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜。

[0035]去蛋白液洗涤玻璃纤维素膜详细操作为:

向吸附柱中加入400-600uL去蛋白液，

室温静1-2min,1rpm离心30-60s，弃掉废液。

[0036]所述去蛋白液涉及浓度为10-50mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCl，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%无水乙醇。

[0037]漂洗液洗涤玻璃纤维素膜详细操作为:

向吸附柱中加入400-600uL漂洗液，1rpm离心30-60s，弃掉废液，重复该环节一次。

[0038]所述漂洗液涉及浓度为10-50mmol/LpH7.3-7.6Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%无水乙醇。

[0039]（4）用RNasefreewater洗脱玻璃纤维素膜上吸附RNA，详细操作为:

在吸附柱

中加入30-50uLRNasefreewater（市售），室温放置1-2min,1rpm离心1-2min重复该环节一次，增长RNA洗脱量。

[0040]RT-LAMP扩增反映:

（5）配制预反映液，所述预反映液体积为15-20uL，涉及:

1.5-2.0mmol/L引

[0041]引物HIV-FIP序列见SEQIDN0:

1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:

2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:

3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:

4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:

[0042]HIV-RT-LAMP引物、探针设计与筛选

本创造所述引物是依照GenBank发布RNA2序列，由在线软件PrimerExplorer

V4（http：

primerexplorer.jp/e/）设计和手工修改后获得，运用不同引物反映成果进行筛选，由其中选出两对引物和一条探针。

[0043]引物HIV-F3（SEQIDN0:

3）:

GATACAACAACTATTCCATTGATTG

[0044]引物HIV-B3（SEQIDN0:

4）TGTAGGATTAATTTGTGGCATG

[0045]引物HIV-FIP（SEQIDNO:

1）:

GCAAGAGGTAAAATACACCCTGTT-TACTATACTGGTCAAGATAAAGAGA

[0046]引物HIV-BIP（SEQIDNO:

2）:

AGTGGTGAAGCCATTACAAATGA-GAAAATCCACAGACCCAATC

[0047]探针HIV-FITC-PROBE（SEQIDN0:

5）:

CTCTTGCAAGTGACTACACTACTTAA

[0048]其中HIV-FIP为5'端生物素（biotin）标记引物;HIV-FITC-PROBE为5'端FITC

标记探针。

[0049]（6）在16-25uL预反映液中加入4-10uL环节（4）所得RNA作为模板，控制反映体系总体积为20-25uL然后在温度为60-65°C，反映15-65min；

[0050]LFD试纸检测:

（7）取环节（6）所得LAMP扩增反映产物6-10uL滴到LFD试纸点样处，然后在点样处前端滴上60-100uL缓冲液，5-20分钟后依照试纸条上显色带鉴定检测成果。

当仅浮现质控带时表白反映成果为阴性，当质控带和检测带同步浮现时，表白

反映成果为阳性。

[0051]一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特性在于：

涉及RT-LAMP扩增反映液，16-20uLRT-LAMP扩增反映液涉及：

[0052]引物HIV-FIP序列见SEQIDN0:

1，引物HIV-BIP序列见SEQIDN0:

2，引物HIV-F3序列见SEQIDN0:

3，引物HIV-B3序列见SEQIDNO:

4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQIDN0:

[0053]RT-LAMP扩增反映液装于RT-LAMP核酸反映管中，RT-LAMP核酸反映管中添加有稳定液，稳定液为液体石蜡油。

稳定液滴加在RT-LAMP核酸反映管中，用于液封，稳定液用量在5-10uL。

[0054]检测试剂盒还配有LFD试纸用缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD

试纸用缓冲液为1xTAE缓冲液，阳性对照样品为HIV病毒基因组RNA,阴性对照样品为无核酸RNasefreewater

[0055]本创造上述方案在其范畴内都是可以实行，如下以一种典型实行方案来详细

阐明本创造详细操作环节。

[0056]典型实行方案:

1、材料

被感染人体HIV病毒细胞采集自宁

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