细胞常见污染情况分析.docx

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细胞常见污染情况分析

细胞培养常见污染的判别及应对措施

2011-01-0210:

19:

04|分类：

实验|标签：

污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅

一、避免细胞培养污染的措施：

污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！

决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！

操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！

注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：

1.每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！

2.滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。

3.凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。

4.提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！

还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。

5.注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。

6.操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。

7.使用完的东西尽快移出无菌台！

另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！

依污染可能程度依次向外摆。

二、常见的细胞培养污染：

下面是几种细胞培养过程中常见的污染：

1.支原体污染：

传说中的黑焦虫，长得暴快。

24小时就满视野都是了。

污染源大多数情况下是培养用血清。

图1支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）

图2支原体污染的光镜检测（×20倍）

图3支原体污染的荧光检测

图4支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）

图5支原体污染的电镜检测

2.念珠菌污染：

似乎无处不在，而且顽固得很。

长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。

培养液澄清。

低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。

图6念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）

图7念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）

图8念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）

图9念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）

这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。

既然已经污染了，就全部更换你的器皿。

培养箱的水没有必要用无菌水，但最起码要是蒸馏水。

3.霉菌污染

比较常见的一种污染，常常来源于污染的空气、水和器械。

图10霉菌污染的光镜检测（低倍）

图11霉菌污染的光镜检测

（典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。

400倍）

图12霉菌污染的光镜检测（树枝状，高倍）

图13霉菌污染的倒置显微镜检测（树枝状）

4.杆菌污染：

培养基中加入抗生素可以减少此种污染，但也不是绝对的。

图14杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，高倍）

图15杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，低倍）

细胞中的颗粒到底是怎么回事？

我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。

好像是细胞碎片一样。

是什么东西啊？

是支原体污染吗？

这可是我刚买回来的细胞啊!

我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么

是黑色的小碎片。

我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。

我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。

但是，是什么东西不清楚。

的确很常见

在以前帖子见到说是“黑焦虫”。

长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。

而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。

不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。

以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。

那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？

有谁知道？

我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。

我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。

国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长

我培养的细胞也有出现这中情况。

但是并不影响细胞生长。

应该不是支原体污染

最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了

细胞培养的细菌污染

我们新建的细胞室。

每周都会做清洁，用0。

2%新洁尔灭消毒，照紫外。

实验前也会照至少30分钟。

培养基中加青霉素，链霉素。

可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。

用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。

我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！

谢谢！

很可能是超净台无效了，，或者培养基？

其实严格操作箱污染都难

我们是新的超净台，不可能失效。

而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一瓶污染，

新传的很好。

所以我分析不出原因呀

那么假如把原始的那瓶换新瓶养可以么？

都污染了，我仍还来不及，那还敢换新瓶

染菌有很多原因，因为整个细胞操作过程均要求无菌，所以看看操作是否规范，例如戴手套等。

多半是环境因素，做点平板，操作时放在几个地方，培养后看看长菌情况。

消毒用新洁尔灭好象不是太有用。

人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩没有，其实，只要你操作的好，严格在靠近火的附近操作，污染的几率是很小的。

从你的描述中可以看出培养基应该没有问题，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不当引起的，还需要加强练手。

求助！

关于细胞培养中的真菌污染！

感激！

先谢谢大家的帮助！

现在细胞培养基里出现了很多白色和黑色的小点，有好长的时间了！

细胞的形态看起来不太好，但是有些细胞也长的很好，如成纤维细胞，但是内皮细胞就差很多！

加大量的抗生素没有效果！

不知道是不是真菌污染，怎么鉴别！

因为培养了很长时间都没有出现真菌的菌丝，所以不能肯定是真菌！

那些白色的小圆点有点象白色链球菌或链珠菌，但是不能确定！

怎么样才能判断确定，改用什么办法解决！

谢谢大家的帮助！

杀灭真菌听说用两性霉素，但从没试过。

真菌污染是件很麻烦的事，可能重新复苏细胞是最好的办法。

同时该注意如何防止污染。

我觉得如果是真菌污染，培养基会浑浊，是肉眼可见的浑浊。

在这种情况下最好赶紧将该瓶细胞扔掉，免得引起培养箱中的大规摸污染。

在显微镜下，真菌是成念珠状的，这时细胞界限不清。

这可能是不规范操作引起的，安全起见还是将细胞室全面打扫一下，用新洁尔灭擦，紫外照！

谢谢大家的帮助，因为实验室以前从来就没有这样的污染，所以大家也没有经验！

现在就是不能确定是不是污染。

我不可能把实验室所有的细胞都扔掉，因为有好多人都在一起养不同类型的细胞！

现在确实是问题，培养基也没有浑浊，操作的时候已经十二分的小心了！

我想问一下，你看到的那些白色或黑色的圆点是在低倍还是高倍显微镜下？

若培养基不混浊，可能真的是细胞状态太差，没有贴壁还缩成球状。

难道你们实验室所有细胞都用一瓶培养基？

只要将污染的扔掉就行，没必要都扔掉！

两性霉素！

sigma在华美有分装！

但是浓度很小，关键还是环境问题！

黑白圆点在100倍显微镜下有多大，是不是酵母菌

小黑点和小白点是在200倍的显微镜下观察所见，大小可能是细胞核的1/5到1/4左右！

细胞状态不好是因为跟以前培养的细胞来比较所得，细胞能贴壁，能生长，但是没有以前的那么快，而且形态看的也不好！

另外问一下sleevexz，酵母菌是什么样的，怎么鉴别！

还有一个问题就是，实验室用的双抗是从Gibco公司买过来的直接使用的液体，具体规格是100ml一瓶，Pelicillin-Streptomycin一起，50倍的，要求储存在－20C，但是有效期只到2002年9月，现在都已经差不多过期半年了，但是实验室的老师都说没有问题，可以用，现在大家就都是一直用这样的抗生素在！

你们说会不会是抗生素的问题的！

养细胞经常无缘无辜的染菌？

烦烦烦！

！

！

！

我是一个新手，但已养细胞近半年，最近一段时间经常染菌，有时是培养基，有时连原因都找不到，在实验中我也非常小心，但结果总让我伤心。

现在都有点神经质了，请各位指点

你这个问题说大不大，说小也不小。

说不大呢，七个字就可以回答你：

严格按照无菌要求。

说不小呢，这无菌要求的话匣子一打开太大。

还是简要吧：

1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2.照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5％的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。

4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。

一下也想不了那么多，具体的你再问吧。

最好把你怎么操作的过程描述一遍，我们就好针对性的指出错误了。

建议你把细胞室，好好清理一下，污染是这样的，出现一次就比较麻烦，千万别急。

还有，你们的紫外灯没有问题吧？

非常感谢楼上的回信，在操作中我也严格按照无菌要求去做，因为操作台是公用的，而其它同学很少染菌，我想主要问题应在我身上，但是又找不到主要原因。

我一般是这样操作的：

紫外照后，用酒精棉檫拭手部开始操作，基本步骤是吸培养液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例传代，有时吸管头部碰在培养瓶口，有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用，有时原因都找不到，请各位指点。

戴手套试试巴

最好是涂片看看是什么菌？

注意操作，吸管碰别处立即更换。

污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟能生巧。

你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下，滴管不要反复用。

其实无菌操作第一重要的就是你的超净台是不是还能用，滤网要及时清洗的。

其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是否正确。

还有一点很重要，手一定不能在任何瓶口上方经过！

从你操作的步骤来看，你的细胞应该是很好操作的。

没看到你要用消化液，这就减少了污染的机会。

你用的吸管是自己做的吗？

经常练练，熟能生巧，时间长了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。

（用牙签或12号针头等工具来塞比较方便，塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌，这样就不会在上吸耳球的过程中，出现将棉花弄掉的情况），另外，你要勤剪指甲，不要戴首饰，吸管一周灭一次菌，不要没用完老用。

操作是导致污染的最主要原因

根据本人的经验，操作是导致细菌污染的最主要原因。

本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过，那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的，更衣，换鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培养液中加双抗，所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40分钟后才允许进入。

但是，就是这样的条件，操作不好，一样要污染。

现在本人工作的实验室要求比那个实验室差的天远地远，但是只要操作仔细了，一样可以把最难养的细胞养好。

本人曾经参观过一些名人进行细胞操作，也就是换上拖鞋，连工作服都不换就进细胞室，细胞一样没有问题。

所以，最主要的是：

工作服，尤其是袖口，消毒情况如何，袖口是否能够扎紧。

如果不能保证，不如索性把袖口挽起来，把手臂用酒精擦一遍（其实我本人连擦都懒得擦，一样没事）。

操作时，滴管两头都要烧。

还有一点很重要，就是滴管头在加液体的时候，不要深入瓶口太多。

在倒培养液的时候，可以拿起培养瓶直接倒，但是注意要倒干净，瓶口沾的最后一滴液体千万不可回流倒瓶内。

还有一些基本的问题，比如瓶口要多烧一会，怀疑滴管有污染就一定要换。

一旦细胞出现污染的迹象了，就一定要扔掉。

如果实在想挽救，可以用一些高档抗生素（医院里给病人加药后的药瓶，用无菌盐水涮涮就能用，浓度足够），但要小心浓度太高细胞也会死亡。

对付霉菌通常用饱和的硫酸铜溶液，放在培养箱的装水盘中，细胞房的空调要用除湿的功能。

如果不幸染上，要用84液擦培养箱，再用75%酒精擦。

灭菌操作：

在无菌箱内每立方米用甲醛8—10毫升，高锰酸钾5克，熏蒸45分钟后接种

在无菌箱中每立方米用甲醛8－10毫升、高锰酸钾0.25千克，熏蒸45分钟后接种，栽培种接种量按每瓶二级种接30－40袋为宜。

（一）常用消毒剂

　　现将常用的消毒药品及其配制、使用方法，介绍如下：

1．35％甲醛水溶液（HCHO）：

又名福尔马林，使蛋白质变性。

用于培养室、无菌室的灭菌。

　　2．0.1％的升汞水（HgCL3）：

能使蛋白质变性，抑制酶类。

0.1％升汞配制方法是称取升汞0.1克，用少许酒精溶解，再加水至100毫升即成。

用于无菌箱、培养箱、培养皿四周表面以及手指的灭菌。

　　3．石炭酸（C6H5OH），5％浓度喷雾后，能使蛋白变性沉淀。

石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。

用于工作服、实验桌的灭菌。

杀菌效果同升汞。

　　4．高锰酸钾（KMnO4）：

氧化剂。

0.1％浓度能使蛋白质与氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或杀死杂菌。

　　5．乙醇（CH3CH3OH）：

又称酒精。

消毒以75％浓度的效果最好。

它能使蛋白质脱水变性。

高浓度酒精会使蛋白质很快脱水凝固，消毒作用反而减弱。

　　6．新洁尔灭：

0.25％新洁尔灭用于无菌箱、无菌室的灭菌。

一般新洁尔灭5％原液50毫升；加水950毫升配成。

　　7．漂白粉水：

取漂白粉10克，加水140毫升配成。

通常在使用前临时配制，静置1～2小时，取上清液喷射，进行室内消毒，每平方米用1升。

　　8．药皂：

煤酚皂、硼酸皂等各种药皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。

　　9．2％硫酸铜溶液：

用硫酸铜（胆矾）2克，加水至100毫升加热溶解配成。

用于床架、木架等各种菌种架的消毒。

还可用5％硫酸铜溶液。

　　10．0.5％波尔多液：

先用硫酸铜1斤，溶于100斤水，再用石灰1斤，加水100斤。

然后等量混合起来即成。

用于菌种架、段木的消毒。

　　11.多菌灵：

用于杀灭真菌、半知茵。

1：

800倍拌料或1：

500倍喷洒均可。

（二）无菌箱及无菌室的消毒灭菌

　　无菌箱的消毒灭菌，可采取以下几种方法：

　　l．用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：

一般每平方米需40％甲醛10毫升、高锰酸钾8毫升，进行熏蒸。

使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，关紧房门，熏蒸20—30分钟即可。

　　2．0.1％升汞水消毒：

用0.1％升汞水浸过的纱布或海绵进行指擦，或用喷雾器喷雾灭菌，使箱内的上下左右都沾上升汞水，手也可用升汞水消毒，并把袖子卷起来。

喷雾后20～30分钟，箱内的杂菌和雾滴一起落到箱底被杀死，内部的空气就变得很清洁。

　　3．紫外线照射灭菌：

在无菌箱中装一支200伏、3O瓦的紫外线灯管；每次开20～30分钟，就能达到空间杀菌的目的。

照射结束后，罩黑布半小时，以增强杀菌效果。

　　4．石炭酸喷雾：

在每次接种之前，用5％石炭酸溶液喷雾，可促使空气中的微粒和杂菌沉降，防止桌面微尘飞扬，并有杀菌作用。

　　5．石灰揩擦：

经常用药物熏蒸，易造成酸性环境，特别用甲醛和高锰酸钾熏蒸长久，污染往往越来越严重，预防办法可把各种药品交替使用，过一段时间（约五周）用石灰擦洗一遍。

实践证明，这样做效果很好。

无菌室消毒同无菌箱。

　　（三）无菌室的使用规程

　　无菌室无固定程序，但按一般操作应遵循如下规程：

　　1．接种室内和缓冲室内使用前，用5％石炭酸溶液喷雾。

把所需要的器材搬入缓冲室清洗，等晒干后搬入接种室，打开紫外线灯，照射杀菌。

　　2．穿上工作服及无菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2分钟。

进人接种室后，查验器械是否放在一定位置。

然后用5％石炭酸溶液重点在工作台的上方和附近的地面上喷雾。

然后退回缓冲室。

还可给接种室门口地面洒一层石灰，进门时踩石灰可使鞋底保持无杂菌状态。

　　3．接种操作前，用70％的酒精棉球擦手。

进行无菌操作时，要严格认真，动作轻捷，尽量减少空气流动。

　　4．工作结束后，立即将台面收拾干净，不留残物。

然后用5％石炭酸全面喷洒。

　　5．操作时，注意安全。

如棉塞着火，用手紧握即可熄灭。

如打破菌瓶，可用抹布沾5％石炭酸，收拾到废物桶内。

每次的污染物应小心放在盘内，盖严拿出室外深埋或烧掉。

　　（四）无菌室空气污染情况的检验

　　定期检验无菌室空气污染情况，对改进灭菌措施，提高成品率是非常必要的。

常用方法步骤如下：

　　1．平板检验法：

用常规培养基，倒成平板，收入接种室。

在事先熏蒸好的接种室，使用前半小时或1小时把供试的培养皿或试管打开，按预定时间盖好培养皿或试管。

留对照皿不打开。

然后一起放入30℃的温箱中培养48小时，检查有无菌殖生长，并由菌落形态，判断杂菌种类。

一般要求平板培养基开盖5分钟，菌落不超过3个；叙面培养基开塞30分钟者，以不出现菌落为合格。

　　2．斜面检验法：

将常用的琼脂斜面培养基各取二管，放入接种室，按无菌操作各将其中的一管的棉塞取出，放在灭菌的培养皿内。

经过一定时间后，再将棉塞通过火焰，塞回试管，连同对照一起培养。

经48小时后，检验无杂菌生长。

和上边方法同。

　　3．空气污染情况检验：

在接种过程中，人员的出过、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成空气污染，检验方法是在准备工作结束后，接种操作开始时，按上述方法打开培养皿盖子或试管塞，经5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内，空气污染的程度。

　　如霉菌较多时；可先用5％石炭酸全面喷射后，再用甲醛熏蒸。

如细菌较多时，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的办法加以杀灭。