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气相色谱分析论文
生物与化学工程学院
仪器分析实训报告
题目：
气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
Studyonthemethodologyinvestigationofdetecting
nicotinecontentbyGCinternalstandardmethod
专业：
应用化学
姓名：
栾节
学号：
105011440009
完成日期：
2012年6月2日
气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
【摘要】：
烟碱是烟叶中的主要成分。
本次试验以喹啉为内标物，烟碱为测定对象，考查及检测气相色谱法内标法测定烟碱含量的方法学。
试验中以有机溶剂萃取、填充气相色谱法测定对试验的重现性及精密度和线性关系进行进行了认真分析。
一定范围内，烟碱含量的峰高比及面积比呈现线性关系，重现性及精密度良好。
关键词：
气相色谱内标法烟碱方法学
TheresearchofthemethodinvestigationoftheGasChromatographicInternalStandardMethodofmeasuringNictonineContent
Abstract：
Nicotineisthemainingredientintobacco.Thetesttoquinolineasaninternalstandard,andnicotineforthedeterminationof,examineanddetectedbygaschromatographyinternalstandardmethodforthedeterminationofnicotinecontentmethodology.Organicsolventextractiontest,fillthegaschromatographymethodforthedeterminationofacarefulanalysisofthereproducibilityandprecisionofthetestandthelinearrelationship.Withinacertainrange,thepeakheightratioandareaofthenicotinecontentthanalinearrelationship,goodreproducibilityandprecision.
【关键词】：
Internalstandardmethodnicotinegaschromatographymethodology
1绪论5
1.1烟碱的结构与化学性质5
1.2烟碱的检测方法5
1.2.1非水滴定法检测烟碱含量5
1.2.2紫外线分光光度法检测烟碱含量6
1.2.3水蒸气蒸馏法检测烟碱含量6
1.2.4高效液相色谱法检测烟碱含量6
1.2.5气相色谱法检测烟碱含量6
1.2.5.1外标法检测烟碱含量7
1.2.5.2归一化法检测烟碱含量7
1.2.5.3内标法检测烟碱含量7
1.3检测方法学考察8
1.3.1线性关系的考察8
1.3.2精密度的考察9
1.3.3重现性实验的考察9
2实验部分10
2.1目的10
2.2材料和仪器11
2.2.1材料11
2.2.2仪器11
2.3色谱条件11
2.4实验设计及结果分析12
2.4.1线性关系实验的考察12
2.4.2精密度实验的考察13
2.4.3重现性实验的考察13
2.4.4结果分析13
参考文献14
气相色谱内标法检测烟碱含量方法学考察
1绪论
1.1烟碱的结构与化学质
烟碱化学式
一种吡啶型生物碱，分子式C10H14N2。
俗称尼古丁（nicotine）。
存在于烟草属经济植物中。
无色挥发性液体，有刺激性臭味，熔点—79C,沸点2
46.7°C（745毫米汞柱），相对密度1.0097（20/4C）,比旋光度—169°可
以水蒸气蒸馏。
在空气中易发生变质。
易溶于水、乙醇、乙醚、氯仿和石
油醚。
烟碱能与各种无机酸（如盐酸、硫酸）和有机酸（如酒石酸、苦味酸）生成结晶的单盐和双盐，其中双苦味酸盐的熔点278C，常用来鉴别
烟碱。
烟碱与二氧化汞生成结晶形复合物，此反应可用来纯化烟碱。
【1】
1.2烟碱的检测方法
1.2.1非水滴定法检测烟碱含量非水滴定法是在除水以外的溶剂中进行的滴定
分析方法。
因为有一些物质在水中不溶解，或者难溶于水。
非水滴定应用范围
非常广泛。
因此，已为各国药典和其他常规分析所采用。
非水溶液酸碱滴定
包括两类方法（两类系统）：
一类是碱量法，另一类是酸量法。
【2】...
1.2.2紫外分光光度法检测烟碱含量
是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立
起来的一种定性、定量和结构分析方法。
操作简单、准确度高、重现性好。
波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。
分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。
烟
碱（又名尼古丁）是烟草特有的植物碱，它给予吸烟者感官上感觉到劲头”而
满意,所以烟碱是烟草质量的重要化学成份之一•过去我们采用经典的硅钨
酸沉淀法测定，这个方法准确性虽高，但化费时间却很长，每作一个样品的测定需要30个小时，因此不能适应我国烟草工业形势发展的需要，现我们改用
紫外分光光度法来测定，其原理是烟碱溶液在特定波长的紫外光源通过时，
紫外光量的吸收与烟碱浓度成比例•一个样品仅需两小时就可完成测定【3】
1.2.3水蒸气蒸馏法检测烟碱含量在碱性条件下将烟草浸泡12h以
上用水蒸气蒸馏法收集700〜800mL蒸出液，即可收集到95%以上的烟碱.分别用酸碱滴定法和紫外光谱法测定其烟碱含量，
1.2.4高效液相色谱法检测烟碱含量高效液相色谱法是在经典色谱法
的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9'107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达
几万或几十万）;同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连
续检测。
1.2.5气相色谱法检测烟碱含量
气相色谱法中有外标法、归一化法、内标法三种。
125.1外标法外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正因子求
算法。
校正曲线法是用已知不同含量的标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，也就是校正曲线。
定量分析样品时，在测校正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面积，在从校正曲线查出样品的含量。
校正因子求算法时将标样多次分析后得到的响应信号与其含量求出它的绝对校正因子，再根据公式求出待测样品中的含量。
外标法适用
外标法适用于工厂中的常规分析，它用于痕量组分的分析也能得到满意的结果。
这个方法的精确度，在很大程度上取决于操作条件的控制。
样品分析的操作条件，必须严格控制于绘制校正曲线时的条件。
当峰高对操作条件的敏感性以及对拖尾峰、柱子超负荷和检测器有大的响应时，给出非线性的校正曲线，此时峰面积计算常常可以得到更好的结果。
不过，对重叠峰，难以准确的测量峰面积，必须提高分离度才能达到预期的效果。
对
于工厂的常规分析，使用外标法必须经常对校正曲线进行验证。
如果曲线外推通过坐标原点，验证时可以只取一个点（进一次标准样品）外标法误差的来源，除了分离条件的变化之外，就是进样的重复性。
使用注射器进样，外标法的误差大约在以上。
但是，使用定量进样阀可获得1%的精密
度；若同时小心控制分离参数，分析精密度可达±）.25%。
1.2.5.2归一化法把所有出峰的组分含量之和按100%十的定量方法，称为归一化法。
当样品中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都能产生信号的样品，可用归一化法定量，其中组分i的质量分数可按式（2-3-18）计算：
f\
叭_丁雹〕…x|（KKjf23
式中<一组分i的峥面枳：
’
—i坦分的胡量枝正刑于.
当厂，为樺尔校i卜闵广或休祀校世因产时・所冯站聲什別対「组分肿草尔门奇含毎或体枳百分数」
一化法的优点是简便、准确，特别是进样量不容易准确控制时，进样量的变化对定量结
果的影响很小。
其他操作条件，如流速、柱温等变化对定量结果的影响也很小。
归一化法定量的主要问题是校正因子的测定较为麻烦，虽然一些校正因子可以从文献中
查到或经过一些计算方法算出（本章第一节有介绍），但要得到准确的校正因子，还是需要
用每一组分的基准物质直接测定。
归一化法主要用于GC的定量测定。
!
"的一些主要检测器（如FID和TCD对某些组分（如同系物）的校正因子相近或有一定的规律，从文献中可以查到或进行计算。
当校正因子
相近时，可直接用峰面积归一化进行定量。
例如，表2-3-14给出了C8芳烃异构体的GC分
子进行归一化法的定量结果和直接用峰面积进行归一化的定量结果。
比较两个结果，误差很
小，在这种情况下直接用峰面积归一是十分方便的，也是误差范围所允许的。
125.3内标法内标法internalstandardmethod是色谱分析中一种比较
准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。
内标
法是将一定重量的纯物质作为内标物（参见内标物条）加到一定量的被分
析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标
物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，按下列公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量：
按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物，分别配成溶液，
精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。
取一定量进样，记录色谱图。
用含对照品和内标物的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校正因子（f）：
f=（As/ms）/（Ar/mr）
其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别
为加入内标物和对照品的量。
再取各品种项下含有内标物的待测组分溶液进样，记录色谱图，再根
据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）:
mi=fXAi/（As/ms）
其中Ai和As分别为供试品和内标物的峰面积或峰高，ms为加入内标
物的量。
必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。
注意事项
当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的待测组分溶液使
用同一份内标物质溶液时，贝U配制内标物质溶液不必精密称（量）取。
采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。
理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的已知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质（如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等）、色谱行为
和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。
当然，在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。
需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化合物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，
他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化合物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。
【4】
1・3检测方法学考察
1.3.1线性关系的考察两个变量之间存在一次函数关系，就称它们之间存在线性关系。
正比例关系是线性关系中的特例，反比例关系不是线性关系。
更通俗一点讲，如果把这两个变量分别作为点的横坐标与纵坐标，其图象是平面上的一条直线，则这两个变量之间的关系就是线性关系。
即如果可以用一个二元一次方程来表达两个变量之间关系的话，这两个变量之间的关系称为线性关系
1.3.2精密度的考察要求所加工的零件的尺寸达到的准确程度也就是
容许误差的大小，容许误差大的精密度低，容许误差小的精密度高；简称精
度”常用标准偏差（standarddeviation，SD或S）；相对标准偏差（relativestandarddeviation，RSD）表示。
分析时，常用RSD表示精密度。
也可以简称为精度•描述测量数据的分散程度。
精密度是准确度得另一个组成部分，
而且是它的一个重要的组成部分。
精密度是在规定的条件下，独立测量结果间的一致程度。
对不同的规定条件，有不同的精密度的度量。
最重要的
精密度的度量是重复性和再现性
1.3.3重现性实验的考察在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。
当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。
例如，建立兽药典分析方法时应通过不同实验室的复核检验得出重现性结果，复核检验的目的、过程、重现性结果均应记载在起草说明中。
应注意重现性试验用的样品本身的质量均匀性和贮存运输中的环境影响因素，以免影响重现性结果
1.3.4回收率回收率包括绝对回收率和相对回收率。
绝对回收率考察的
是经过样品处理后能用于分析的药物的比例。
因为不论是生物基质还是制剂辅料中的药物，经过样品处理都有一定的损失。
做为一个分析方法，绝对回收率一般要求大于50%才行。
它是在空白基质中定量加入药物，经处理后与标准品的比值。
标准品为流动相直接稀释而来，而不是同样品一样处理。
若一样，只是不加基质来处理，可能会有很多影响因素被此屏蔽掉。
如全部转移有机相时只转移了98%等。
也就因此失去了绝对回收率的考察初
相对回收率严格来说有两种。
一种是回收试验法，一种是加样回收试验法。
前者是在空白基质中加入药品，标准曲线也是同此，这种测定用得较多，但有标准曲线重复测定的嫌疑。
第二种是在已知浓度样品中加入药物，来和标准曲线比，标准曲线也是在基质中加药物。
1.3.5验证性验证性实验是指对研究对象有了一定了解，并形成了一定认识或提出了某种假说，为验证这种认识或假说是否正确而进行的一种实验验证性实验强调演示和证明科学内容的活动，科学知识和科学过程分离，与
背景无关，注重探究的结果（事实,概念,理论）,而不是探究的过程.验证性实验传递了这样一种信息：
了解一个发现和如何把这个发现的结果应用到一个确定的问题上比直接学习如何发现要重要得多.验证性实验强调实验操作和观
察等个别智力技能，强调任何快速经济的获得生物化学知识•
2实验部分
2.1目的本次试验以喹啉为内标物，烟碱为测定对象，考查及检
测气相色谱法内标法测定烟碱含量的方法学。
学会气相色谱法的原理及应用，内标法的理解及实际操作，并检测出烟碱的含量。
学会线性关系，重现性，精密度，吸收率的验证实验的设计和结果分析。
22材料和仪器
2.2.1材料
98%烟碱（自制备）、喹啉（分析级别）、水（蒸馏水）、进样量为1ul、甲
醇（分析级别）
2.2.2仪器
气相色谱仪（7890U型上海天美公司）、毛细管柱（30mlengthTM—WAX
From20Cto260C）
2.3色谱条件
气体流速：
N230ml/minAir30ml/minH250ml/min
柱箱温度（OVEN）170C进样口温度（INJ）270C
检测器温度（DET）270C
2.4实验设计及结果分析
通过实验及对实验结果的分析得出以下结论。
2.4.1线性关系实验的考察
所用试剂：
100ug/mL烟碱甲醇溶液，100ug/mL喹啉甲醇溶液，甲醇（99%以上）
配制浓度分别为1、10、20、30、40、50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含
50ug/ml的喹啉，吸取1ul进样检测，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间的峰高比和面积比，结果见表1。
表1:
烟碱/喹啉的峰高比及面积比
Table1:
peakheightratioandarearatioofnicotine/quinoline
Testratio
No.n
uL
peakheightratioarea
icotine
quinoline
methylhydroxide
1
0
500
500
0
0
2
100
500
400
0.09597
0.14170
3
200
500
300
0.13854
0.11608
4
300
500
200
0.22009
0.11608
5
400
500
100
0.33751
0.30705
6
500
500
0
0.73471
0.70355
用Origin7.5软件处理数据，作图如下所示:
OH—RrxAY
0.2-
0.0
XAxisTitle
XAxisTitle
[2012/6/19:
57"/Graphl"（2456096）]
LinearRegressionforData1_B:
Y=A+B*X
Parameter
Value
Error
A-0.065510.08513
B0.01280.00281
R
SD
N
P
0.91553
0.11762
6
0.0104
图
1烟碱/喹啉的峰高比
Fig.1peakheightratioofnicotine/quinoline
以烟碱与喹啉的峰高比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归
方程分别为丫=0.01452X-0.07744（r=0.91723）由此可以看出烟碱含量在
0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰高比呈良好的线性
关系。
用Origin7.5软件处理数据作图如下:
[2012/6/20:
33"/Graphl"（2456096）]
LinearRegressionforData1_B:
Y=A+B*X
ParameterValueError
A-0.043570.08548
B0.011840.00282
RSDNP
0.902610.1181160.01377
图2烟碱与喹啉的面积比
Fig.2arearatioofnicotine/quinoline
以烟碱与喹啉的面积比为Y轴，以烟碱含量（单位ug）为X轴的回归
方程分别为丫=0.01078X-0.04125（r=0.90261）由此可以看出烟碱含量在0—50ug/ml范围内，采用气相色谱法测定时其浓度与峰面积比呈良好的线性关系。
线性关系试验中，t检验峰值比的t=4.19365>tO.O1,面积比的
t=>tO.O1，查表to.oi=4.604，说明线性关系较好。
2.4.2
精密度实验的考察
配制浓度为50ug/ml的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL的喹啉，取同一支
试管中的试液连续进5针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它
们之间的峰高比和面积比，
结果见表
2。
表2：
精密度试验
Table2
:
precision
Test
uL
peakheightratio
arearatio
No.
nicotine
quinoline
1
500
500
0.75310
0.76268
2
500
500
0.68143
0.64020
3
500
500
0.78535
0.82686
4
500
500
0.77907
0.75307
峰高比
S=0.04763
RSD%=6.35288%
面积比
S=0.07759
RSD%=10.40476%
2.4.3
重现性实验的考察
配制浓度为50ug/ml
的烟碱甲醇溶液，内含50ug/mL
的喹啉，5支试管
中的试液各进
1针，并记录烟碱和喹啉的峰面积及峰高，计算出它们之间
的峰高比和面积比，结果见表3。
表3:
重现性试验
Table3:
reproducibility
Test
uL
quinoline
peakheightratio
arearatio
No.
nicotine
1
500
500
0.70190
0.67504
2
500
500
0.63073
0.61668
3
500
500
0.77297
0.68683
4
500
500
0.39201
0.39169
峰高比S=0.14329
RSD%=22.94792%
线性关系实验中，t值检验证明，线性关系极显著，表明此种实验条件下，在0-50卩g/ml范围内，烟碱峰高比和峰面积高有较好的线性关系。
精密度实验中，RSD%较大，分析为进样过程出现了问题。
进样应该快速，准确。
重现性实验中，RSD%较小，证明精密度较好，此操作较准确。
通过对线性关系、精密度和重现性实验的考察，说明用气相色谱内标法检测烟碱含量的方法学是合理正确的。
参考文献
【1】《化学实验设计》,郑州大学出版社20066
【2】《仪器分析》南京大学出版社1999年
【3】《分析仪器》1995年第四期
【4】GBT9722-2006化学试剂气相色谱法通则
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