浆血opn和tat水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义本科毕业设计.docx

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浆血opn和tat水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义本科毕业设计

宁夏医科大学

硕士研究生学位论文

血浆OPN和TAT水平检测

在非小细胞肺癌中的临床意义

NingxiaMedicaluniversity

ThesisforApplicationofMasterDegree

PlasmalevelsofTATandOPN

inNon-smallCellLungCancer

StudentName:

changxianghui

Director:

zhangjin

Specialty:

lungcancer

Major:

RespiratoryMedicine

FinishDate:

Apr.2010

中文摘要……………………………………………………………………………………

Abstract……………………………………………………………………………………

符号说明……………………………………………………………………………………

前言……………………………………………………………………………………

血浆OPN和TAT水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义……………………………

材料与方法……………………………………………………………………………………

结果……………………………………………………………………………………

结论……………………………………………………………………………………

讨论……………………………………………………………………………………

参考文献……………………………………………………………………………………

发表论文和参加科研情况说明……………………………………………………………

综述

血浆OPN和TAT水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义……………………………

综述参考文献……………………………………………………………………………

致谢…………………………………………………………………………………

血浆OPN和TAT水平检测在非小细胞肺癌中的临床意义

摘要

肺癌（Lungcancer）是全世界最常见的恶性肿瘤之一,其中以非小细胞肺癌（NSCLCNon-smallCellLungCancer）为主要病理类型，占到80%。

患者常伴有凝血异常，分期是判断预后的主要指标之一，研究表明，OPN（骨桥蛋白）在多种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等组织表达及血浆水平均有增高，并且对判断肿瘤的浸润、转移和预后，指导临床诊断和治疗有重要意义。

而被凝血酶裂解的OPN生物性能会有所改变，在肿瘤组织表达会更加明显。

上述报道大多局限在对肿瘤组织的研究，而联合检测外周血中OPN、TAT含量与肿瘤的关系，尤其在肺癌诊治中的应用研究报道较少。

而检测外周血中的OPN、TAT具有简单、快捷和无创的优点。

本研究通过检测外周血中的OPN、TAT水平，探讨两者在非小细胞肺癌的诊断、治疗、预后判断中的作用。

目的：

通过检测骨桥蛋白（OPN）、凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）在非小细胞肺癌（NSCLC）血浆中水平的并将二者进行相关性分析，探讨二者在非小细胞肺癌（NSCLC）临床意义。

方法：

:

收集临床确诊的46例NSCLC、22例肺部良性病变患者及20例健康体检者血浆，采用酶联免疫吸附测定法（ELASA）检测NSCLC患者及对照组的血浆OPN及TAT水平，并应用SPSS11.5统计学软件进行统计学分析，对各组数据进行差异性比较和相关性分析。

结果：

（1）OPN在NSCLC血浆水平明显高于肺部良性病变患者及健康体检者（p=0.017,t=7.376）;TAT在NSCLC血浆水平明显高于肺部良性病变患者及健康体检者（p=0.000,t=15.885）；

（2）OPN、TAT血浆水平在肺部良性病变患者及健康体检者之间对比,差异无统计学意义（P>0.05）；（3）OPN、TAT血浆水平与肺癌分期、远处转移明显相关，而与性别、年龄、病理类型无关；（4）NSCLC患者OPN、TAT血浆水平呈正相关（r=0.502，p<0.05）。

结论：

（1）外周血中OPN和TAT的含量能够反映NSCLC患者机体的肿瘤负荷状态；

（2）NSCLC患者外周血中OPN和的含量TAT与肺癌的浸润、转移相关；（3）OPN和TAT可能在NSCLC的发生、发展过程中起协同作用；（4）检测外周血中OPN、TAT，尤其是联合检测两者对NSCLC的诊断、治疗及预后判断有一定临床意义。

TAT、OPN可作为NSCLC分期及转移的指标。

且二者可能在NSCLC发生发展方面具有协同作用。

关键词凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）；骨桥蛋白（OPN）；血浆；非小细胞肺癌（NSCLC）；酶联免疫吸附法（ELASA）

PlasmalevelsofTATandOPNinNon-smallCellLungCancer

Abstract

Lungcancerisoneofthemostcommonmalignanttumorsintheworld.Amongthem,non-smallcelllungcancer（NSCLC）asthemainpathologicaltype.Patientsoftenaccompaniedbycoagulationabnormalities,stageisoneofthekeyindicatorsofprognosis.Studieshaveshownthat,OPN（osteopontin）inavarietyofmalignanttumorssuchasbreast,lung,prostatecancer,andgastriccancertissueexpressionandplasmalevelsareincreased,andtherighttodeterminetumorinvasion,metastasisandprognosis,toguideclinicaldiagnosisandtreatmentofsignificant.ThrombincleavageofOPNwerebiologicalpropertiesaresubjecttochange,expressedintumortissueswillbemoreapparent.Thereportismostlylimitedtothestudyoftumortissue,whilethecombineddetectionofperipheralbloodOPN,TATconcentrationandtherelationshipbetweenthetumor,especiallyinthestudyoflungcancerdiagnosisandtreatmentarelessreported.ThedetectionofperipheralbloodofOPN,TAThasasimple,fastandnon-invasiveadvantages.ThisstudywasdetectedinperipheralbloodOPN,TATlevel,toexplorebothinnon-smallcelllungcancerdiagnosis,treatment,prognosisrole.

Objective:

Todetectosteopontin（OPN）,thrombin-antithrombincomplex（TAT）innon-smallcelllungcancer（NSCLC）andplasmalevelsofbothcorrelationanalysistoexplorethetwoinnon-smallcelllungcancer（NSCLC）clinicalsignificance.Methods:

:

Collectionofclinicaldiagnosisin46patientswithNSCLC,22patientswithpulmonarybenigndiseasesand20healthyindividualsplasma,usingenzyme-linkedimmunosorbentassay（ELASA）DetectionofNSCLCpatientsandcontrolgroup,plasmaOPNandtheTATlevel,andApplicationSPSS11.5statisticalsoftwareforstatisticalanalysis,thedifferencebetweeneachgroupofdatacomparisonandcorrelationanalysis.Results:

（1）OPNplasmalevelsinNSCLCwassignificantlyhigherthanbenignlungdiseasepatientsandhealthysubjects（p=0.017,t=7.376）;TATplasmalevelsinNSCLCwassignificantlyhigherthaninpatientswithbenignpulmonarydiseasesandhealthysubjects（p=0.000,t=15.885）;

（2）OPN,TATplasmalevelsinpatientswithbenignlesionsinthelungsandthecontrastbetweenthehealthysubjects,nostatisticallysignificantdifference（P>0.05）;（3）OPN,TATplasmalevelsandlungcancerstaging,distantmetastasissignificantlyrelated,butnotrelatedwithgender,age,pathologicaltype;（4）NSCLCpatientswithOPN,TATplasmalevelswerepositivelycorrelated（r=0.502,p<0.05）.Conclusions:

（1）inperipheralbloodlevelsofOPNandtheTATtoreflectthebody'stumorburdeninpatientswithNSCLCstate;

（2）NSCLCpatientswithperipheralbloodlevelsofOPNandtheTATandgastriccancerinvasion,metastasis;（3）OPN,andTATNSCLCmaybetheoccurrenceanddevelopmentplayasynergisticroleintheprocess;（4）detectioninperipheralbloodOPN,TAT,inparticularthejointdetectionoftwopairsofNSCLCdiagnosis,treatmentandprognosishavesomeclinicalsignificance.TAT,OPNcanbeusedasindicatorsofNSCLCstagingandtransfer.AndthetwomayoccurinthedevelopmentofNSCLChasasynergisticeffect.

Keywordsthrombin-antithrombincomplex（TAT）;osteopontin（OPN）;plasma;non-smallcelllungcancer（NSCLC）;enzyme-linkedimmunosorbentassay（ELASA）

英文缩略词表

英文缩写英文全称中文全称

TATthrombin-antithrombincomplex凝血酶抗凝血酶复合物

OPNosteopontin骨桥蛋白

NSCLCNon-smallCellLungCancer非小细胞肺癌

ELASAenzyme一linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定

前言

近半个世纪以来，肺癌在恶性肿瘤中已居首位，统计显示，目前肺癌的发病率和死亡率在全球范围内均居首位，每年世界范围内诊断的新病例超过了50万例,其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的80%～85%。

患者5年生存率低于15%，早期发现难、恶性程度高、病程进展快。

卫生部2008年4月29日公布的第三次全国居民死亡原因调查结果显示，过去30年间，肺癌死亡率在中国上升了465%，肺癌已取代肝癌成为中国首位恶性肿瘤死亡原因。

加强肺癌的基础和临床研究，将有助于肺癌的预防和治疗，对降低其发病率和死亡率，提高人们的生活质量有重要的意义。

影响肺癌预后的因素多达百余种，在众多因素中有主要因素和次要因素，而肺癌的TNM分期其中一主要因素，近年来，对影响肺癌预后的单因素和多因素分析提示肺癌的TNM分期是影响预后的主要独立因素。

大部分肺癌患者死亡的原因并不是原发灶本身，而是肿瘤的浸润、转移和复发所致，原发灶转移一直是影响肿瘤临床疗效的主要因素。

近年来的分子生物学研究表明，肿瘤的侵袭、转移和复发也是一个多基因参与、多阶段演进的极其复杂的生物学过程。

这个过程包括癌组织在浸润转移前进行细胞自身的黏附解除，癌细胞黏附于基质，癌细胞释放蛋白水解酶降解基质，癌细胞移行，癌细胞浸入血管和淋巴管发生远处转移的步骤。

近年来，恶性肿瘤与止血凝血功能和纤溶活性的相互关系日益受到重视。

肿瘤细胞可直接或间接地影响血液凝固，导致血液凝固性增高或出血倾向，而止血凝血功能和纤溶活性的改变也可影响肿瘤细胞的表型和活性，从而使肿瘤细胞在局部增殖、浸润甚至向其他部位转移[1]。

凝血酶（thrombin）最为人们熟知的是它是一种重要的凝血因子，在血栓形成、血管损伤、炎症、组织损伤修复方面起重要作用;它还能够引起血小板聚集、内皮细胞分泌细胞因子、纤维母细胞和平滑肌细胞增殖等细胞反应。

此外，凝血酶还能够激活正常及恶性细胞的致瘤潜能，并能导致转移表型的出现[2]。

生理或病理情况下，凝血酶原裂解生成凝血酶，很快被抗凝血酶所中和，故很难直接检测凝血酶的含量，而凝血酶抗凝血酶复合物（TAT）可作为凝血酶早期形成的分子标志物之一。

骨桥蛋白（osteopotin,OPN），是一种分泌型磷酸化糖蛋白，它是细胞外基质（extracllullarmatrix,ECM）中的一种非胶原蛋白，能促进细胞的粘附、趋化和迁移，因而在骨组织矿化、细胞粘附、信号转导、细胞免疫、血管再塑等方面具有多种生物功能。

近年来的研究表明，多种类型的肿瘤细胞在体内、外均产生OPN参与肿瘤发展的多个环节,在不同的恶性肿瘤转移形成过程中发挥重要作用[3]。

OPN的受体家族包括整合素受体和CD44受体。

整合素受体包括avβ3、avβ5、a9β1、a4β1等。

正常情况下，OPN主要与CD44受体结合，通过与一些整合素受体和CD44受体结合，从而促进细胞的趋化、黏附和迁移，参与骨的吸收和形成[4]。

近年研究发现，OPN在许多肿瘤组织中高表达，如肝癌、肺癌、乳腺癌及头颈部肿瘤中等，其在原发肿瘤及其转移瘤组织中的均有表达上调，提示OPN在肿瘤的发生发展、侵袭转移、肿瘤血管生成及抑制凋亡中具有一定作用[5]。

研究发现，凝血酶与OPN的化学结构存在一定关系，不同OPN结构如全长OPN、被凝血酶裂解后的OPN、磷酸化或非磷酸化形式等使OPN功能不同。

经凝血酶裂解OPNN端片段与整合素结合能力比完整OPN强。

我们以此为依据，通过ELASA法观察二者在非小细胞肺癌发生发展中的作用。

材料与方法

1材料

1.1资料来源

1.1.1实验对象

NSCLC组:

收集2008年11月-2009年9月宁医附属医院胸外科及呼吸科经病理确诊的非小细胞肺癌患者共46例，鳞癌21例，腺癌25例，年龄20-76岁，男28例，女18例。

正常对照组:

来自宁医附属医院体检中心的健康查体者，共收集20例，其中男性5例，女性15例，平均年龄48士6（22一67）岁，且与NSCLC组在年龄及性别上差异无统计学意义。

良性肺部病变组22例良性肺部病变患者（4例结核球、4例支扩、4例错构瘤、3例肺囊肿、3例炎性假瘤、2例硬化性血管瘤、1例良性乳头瘤、1例平滑肌瘤），与NSCLC组在年龄及性别上差异无统计学意义。

1.1.2肺癌分期标准：

1997年国际抗癌联盟TNM分期

1.1.3病例纳入标准

（1）临床病理诊断明确的非小细胞癌患者

（2）良性病变组为外科手术病理学检查证实的患者

（3）年龄在20-80岁之间

1.1.4病例排除标准

（1）有严重的心、肝、肾功能障碍或其他重要脏器功能衰竭者

（2）血液系统疾病及血栓栓塞性疾病患者

（3）肾结石患者

（4）风湿性疾病及免疫性疾病

（5）孕妇

（6）已接受手术及放化疗和输血的患者

（7）不符合纳入标准，资料不全的患者

1.2实验仪器

SYNYO低温冰箱：

日本SYNYO公司；L05-2A型离心机：

北京产；WS2-261-73电热恒温隔水式培养箱：

上海产；EL-800酶标仪：

PE公司；打印机：

惠普公司；高精度加样器及吸头（1000，100，50）：

若干；37℃恒温箱;可调多道移液器（50一200pL）;供可调多道移液器使用的试剂存放槽

1.3实验试剂

OPNELASA试剂盒购于日本IBL公司，TATELASA试剂盒购于美国Assayproy公司。

2实验方法

2.1技术路线

技术路线

2.2标本采集

所有标本均于清晨空取空腹静脉血,与3.8%枸椽酸钠按9∶1比例混匀,1000r/min离心15分钟,吸出上层血浆，置于密封管中，取血浆-80度冰箱保存待测。

所有标本避免反复冻融。

2.3OPN、TAT检测

采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心ELASA进行检测，严格按照试剂盒说明进行操作。

2.3.1实验前准备：

（1）取出血浆本及试剂盒，平衡至室温。

（2）将浓缩洗涤液与医用蒸馏水按要求倍数稀释为应用洗涤液。

（3）浓缩样品稀释液用样品稀释液按照要求倍数稀释稀释成应用样品稀释液。

2.3.2OPN检测：

（1）取出酶标板，设空白孔，依照次序对应分别加入100ulOPN的标准品于空白微孔中（空白孔视为0号标准品，用稀释液替代），并标记样品编号，加入100ul的稀释样品（1：

6稀释）于空白微孔中;

（2）置于37℃温育60分钟;

（3）将酶标板板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤7次;

（4）在标准品孔和样品孔中加入100ul的示踪抗体，4℃孵育30分钟;

（5）将酶标板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤9次;

（6）每孔中加入100ul显色剂，轻轻振荡混匀;

（7）置于室温避光温育反应30分钟;

（8）每个微孔中加入100ul的终止液，轻轻振荡混匀;

（9）在酶标仪上，450nm处测定OD;显色后，15分钟内进行测定;

（10）计算机通过标准样品的浓度及光密度值绘制标准曲线，并通过样本的OD450

值自动读出其浓度。

2.3.3TAT检测：

（1）取出酶标板，设空白孔，依照次序对应分别加入50ulTAT的标准品于空白微孔中（空白孔视为0号标准品，用稀释液替代），并标记样品编号，加入50ul的稀释样品（1：

2稀释）于空白微孔中;

（2）置于37℃温育120分钟;

（3）将酶标板板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤5次;

（4）在标准品孔和样品孔中加入50ul的生物素化抗体，37℃孵育60分钟;

（5）将酶标板取出，甩尽板内液体，用洗涤液洗涤，并甩去水滴，在吸水纸上将酶标板拍干，重复上述步骤5次;

（6）在标准品孔和样品孔中加入50ul的SP结合物，37℃孵育30分钟

（7）重复洗板5次；

（8）每孔中加入50ul显色剂，轻轻振荡混匀;

（9）置于室温避光温育反应15分钟出现蓝色;

（10）每个微孔中加入50ul的终止液，轻轻振荡混匀;

（11）在酶标仪上，450nm处测定OD;显色后，15分钟内进行测定;

（12）计算机通过标准样品的浓度及光密度值绘制标准曲线，并通过样本的OD450值自动读出其浓度。

3统计学处理

采用SPSS11.5统计分析软件包进行数据分析,采用方差分析比较肺癌不同分期、对照组之间、有无远处转移各组数据之间关系；采用t检验比较良恶性组数据之间关系。

两变量间相关分析血浆OPN和TAT的相关性。

选定p<0.05为分析结果具有统计学意义。

结果

1肺癌组、肺部良性病变组及健康对照组外周血中OPN和TAT含量

46例肺癌组OPN和TAT含量（52.73士15.78，18.93士6.20），明显高于22例肺部良性病变组（33.15±10.05，3.80±1.41）和20例健康对照组（30.64±9.13，3.03±1.08），见图1、图2及表1。

肺部良性病变组与健康对照组二者含量比较P>0.05，见表2.

1

表1肺癌组、肺部良性病变组及健康对照组外周血中OPN和TAT含量比较

分组

OPN（ng/ml）

TAT（ng/ml）

肺癌组（n=46）

52.73±15.78

18.93±6.20

肺部良性病变组（n=22）

33.15±10.05▲

3.80±1.41▲

健康对照组（n=20）

30.64±9.13☆●

3.03±1.08☆●

▲肺癌组与肺部良性病变比较p=0.000（p<0.05）●肺癌组与健康对照组比较p=0.004（p<0.05）☆肺部良性病变与健康对照组比较p>0.05

表2肺部良性病变组及健康对照组外周血中OPN和TAT含量比较（

±s）

分组

TAT（ng/ml）

OPN（ng/ml）

健康体检组（n=20）

肺部良性病变组（n=22）

3.03士1.08

3.80士1.41▲

30.64士9.13

33.15士10.05●

●OPN在肺部良性病变组与健康对照组之间比较P>0.05；▲TAT在肺部良性病变组与健康对照组之间比较P>0.05。

2外周血中OPN和TAT与肺癌临床特征的关系

NSCLC患者外周血中OPN