整理植物生理指标测定方法.docx
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整理植物生理指标测定方法
实验一植物叶绿素含量的测定（分光光度法）
（张宪政，1992）
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：
α比例常数。
当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
高等植物中叶绿素有两种：
叶绿素a和b，两者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用效率的大小，比值高则大，则反之。
二、材料、仪器设备及试剂
试剂：
1）95%乙醇（或80%丙酮）
三、实验步骤
称取剪碎的新鲜样品0.2～0.3g，加乙醇10ml，提取直至无绿色为止。
把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm和645nm下测定吸光度。
四、实验结果按计算
丙酮法（Arnon法）【可以用于丙酮乙醇混合法和80%丙酮提取法的计算】
叶绿素a的含量（mg/g）=（12.71⨯OD663 –2.59⨯OD645）V/1000*W
叶绿素b的含量（mg/g）=（22.88OD645 –4.67OD663）V/1000*W
叶绿素a、b的总含量（mg/g）=（8.04⨯OD663 +20.29⨯OD645）V/1000*W
按Inskeep公式
叶绿素a的含量（mg/g）=（12.63⨯OD663 –2.52⨯OD645）V/1000*W
叶绿素b的含量（mg/g）=（20.47OD645 –4.73OD663）V/1000*W
叶绿素a、b的总含量（mg/g）=（7.90⨯OD663 +17.95⨯OD645）V/1000*W
注：
1、叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用率
【1】比如阳生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较大
【2】阴生植物叶绿素a和叶绿素b的比值较小
2、丙酮-------熔点:
-94℃；沸点:
56.48℃；是一种无色透明液体，有特殊的辛辣气味易溶于水和甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等有机溶剂.
下一步实验方法比较
【1】95%乙醇直接提取（√）
【2】95%乙醇加热提取（冯瑞云，1985）
【3】无水酒精和80%丙酮等体积混合提取
实验二、不良环境对植物细胞膜的伤害（（张宪政，1992））
一、原理
植物组织在受到各种不利的环境条件（如干旱、低温、高温、盐渍和大气污染）危害时，细胞膜的结构和功能首先受到伤害，细胞膜透性增大。
若将受伤害的组织浸入无离子水中，其外渗液中电解质的含量比正常组织外渗液中含量增加，组织受伤害越严重，电解质含量增加越多。
用电导仪测定外渗液电导率的变化，可反映出质膜受伤害的程度。
在电解质外渗透的同时，细胞内可溶性有机物也随之渗出，引起外渗液可溶性糖、氨基酸、核苷酸等含量增加，氨基酸和核苷酸对紫外光有吸收，对紫外分光光度计测定受伤害组织外渗液消光值，同样可反映出质膜受伤害的程度。
用电导仪法和紫外法测定结果有很好的一致性。
二、方法步骤
1、取样及处理
采用电导法（张宪政，1992）：
将选取的幼嫩叶片和成熟叶片剪下，包在密封袋内置于冰盒中带回实验室。
将新鲜的叶样先用自来水轻轻冲洗叶片，除去表面沾污物，再用去离子水冲洗1~2次，用滤纸轻轻吸干叶片表面水分，称0.2～0.3g并剪成切段，放入50mL带塞试管中，加入20mL去离子H2O，浸没样品4~5h，各处理浸泡时间和测定温度一致，在室温下进行，用DDs−11型电导仪测其电导率，然后沸水浴15min，冷却至室温再测一次总电导率值。
以相对电导率表示细胞质膜透性大小。
2、计算：
植物组织浸泡的电导率，特称外渗电导率，此测定方法称外渗电导率法。
（1）外渗电导率
K（us/cm*g）=SQ=测定电导率/称取质量
或K（us/cm*g*ml）=SQ=测定电导率/称取质量*量取体积
（2）相对电解质渗出率.
电解质渗出率（%）=L1（浸泡液电导率）/L2（煮沸后电导率）×100
电解质渗出率（%）=L1（浸泡液电导率）-本底电导率/[L2（煮沸后电导率）-本底电导率]×100
式中：
L1：
组织杀死前外渗液的电导值；L2组织杀死后外渗液的电导值。
注：
1、事先测定水的电导率
2、用吸水纸吸干探头的水分
实验三植物体内游离脯氨酸含量的测定
一、目的
在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨酸多。
因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。
另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。
在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。
二、原理
磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。
然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。
在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。
三、材料、仪器及试剂
1.试剂及配制：
（1）2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：
将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol·L－1磷酸中（原液稀释2.3倍），搅拌加热（70℃）溶解，贮于4℃冰箱中，2-3日有效。
（2）3％磺基水杨酸配配制：
3.496g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。
（3）10μg·ml-1脯氨酸标准母液配制：
精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg·ml－1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml，加蒸馏水稀释定容至100ml，即为10μg·ml-1脯氨酸标准液。
四、实验步骤
1、脯氨酸标准曲线的制作
1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～12μg的脯氨酸标准液。
加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。
取出冷却。
以去离子水溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
10μg·ml-1脯氨酸标准液（ml）
蒸馏水（ml）
冰醋酸（ml）
3%磺基水杨酸
2.5﹪酸性茚三酮（ml）
0
2
2
2
4
0.2
1.8
2
2
4
0.4
1.6
2
2
4
0.6
1.4
2
2
4
0.8
1.2
2
2
4
1.0
1.0
2
2
4
每管脯氨酸含量（μg）
0
2
4
6
8
10
1.3标准曲线的绘制
以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2.样品的测定
2.1脯氨酸的提取
称取0.2～0.3g叶片于20ml试管+10ml3％磺基水杨酸溶液→沸水浴10min（提取过程中要经常摇动）→冷却过滤于干净的试管中→脯氨酸提取液。
2.2测定
吸取酶提取液2ml+2mlH2O+2ml冰醋酸+4ml2.5﹪酸性茚三酮→沸水浴30min→溶液呈红色→冷却→取上层液于比色杯520mm处测定吸光度（A）值。
五、计算结果
从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
X×提取液总量（ml）
脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝———————————————————
样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）
公式中：
X－从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）
实验四植物体内丙二醛含量的测定
一、原理
丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。
它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。
测定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应，生成红棕色的三甲川（3、5、5－三甲基恶唑2、4－二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。
但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。
植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。
低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100－300μg·g－1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3＋的终浓度为0.5nmol·L－1。
在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。
二、实验步骤
（1）提取
采用硫代巴比妥酸显色法（赵世杰等，2002）。
称取0.2～0.3g样品，加10%三氯乙酸2mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml三氯乙酸进一步研磨，匀浆后4000rpm，离心10min。
（2）显色
取上清液5mL，加0.6%TBA5mL，混合后在100℃水浴上煮沸30min，迅速在冰浴上冷却后再离心一次。
分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值，
方法一：
MDA质量摩尔浓度（nmol/g）=（A532-A600）×VZ×V1/（0.155×W×V2）
式中：
VZ:
反应液总量（4mL）；V1:
提取液体积（10mL）；
V2:
测定用用提取液量（2mL）；W:
取样叶鲜重（g）
0.155:
为MDA的消光系数（nmol/l）
方法二：
方程组：
A450=（85.4×10－3）·C糖
（A532－A600）=（155×10－3）·CMDA+（7.4×10－3）·C糖
解得：
A450
C糖=——————=11.71A450（mmol·L－1）
85.4×10－3
CMDA=6.45（A532－A600）－0.56A450（μmol·L－1）
公式中：
A450—在450nm波长下测得的吸光度值
A532—在532nm波长下测得的吸光度值
A600—在600nm波长下测得的吸光度值
﹡—1.55×105为摩尔比吸收系数
C糖、CMDA分别是反应混合液中可溶性糖、MDA的浓度。
1. 按下式计算提取液中MDA浓度
反应液体积（ml）
CMDA×—————————
1000
提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）=———————————————
测定时提取液用量（ml）
2.按下式计算样品中MDA含量
提取液中MDA浓度（μmol·ml－1）×提取液总量（ml）
MDA含量（μmol·g－1Fw）=————————————————————————
植物组织鲜重（g）
试剂：
1、10％三氯乙酸：
称取三氯乙酸55.5556g加水溶解定容至500ml
2、0.6％硫代巴比妥酸（用10％三氯乙酸配制）：
称0.6707gTBA用少量1mol/L氢氧化钠溶解后加10％TCA溶解定容至100ml（4℃贮存）
实验五、SOD活力测定（NBT还原法）
植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2－、H2O2、OH.和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、原理
超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2-，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
二、试剂
（一）试剂
（1）0.2mol/LpH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液：
A液（0.2mol/LNaH2PO4溶液）：
准确称取NaH2PO4·2H2O（MW=156.01）15.715g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
4℃冰箱中保存备用。
B液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：
准确称取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）71.63g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
4℃冰箱中保存备用。
取上述A液34mL与B液366mL充分混匀后即为0.2mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液。
4℃冰箱中保存备用。
（2）0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液
取0.2mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液250mL，移入1000mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
4℃冰箱中保存备用。
（3）130mmol/L蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液
准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.9699g于小烧杯中，用少量0.05mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入50mL容量瓶中并用0.05mol/LpH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。
【溶于水，3.3g/100ml25℃，不溶于有机溶剂】4℃保存可用1～2d.
（4）750μmol/L氮蓝四唑溶液：
称取0.03066gNBT用磷酸缓冲液定容至50ml，避光4℃保存，先用现配.
（5）100μmol/LEDTA－Na2溶液：
称取0.03721gEDTA－Na2用水定容至1000ml【称取7.442gEDTA－Na2用水定容至200ml，吸取1ml用水定容1000ml】
（6）20μmol/L核黄素溶液：
称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存【称取1.8825g核黄素用少量NaOH溶解并用蒸馏水定容至25ml，吸取1ml用水定容1000ml】。
4℃保存8—10天。
三、实验步骤
1.酶液提取
取植物叶片0.2g～0.3g于预冷的研钵中，加2ml预冷的0.05mol/LpH7.8磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。
于4000rpm下离心15min，上清液即为SOD粗提液。
2.显色反应
取试管3支，1支为测定管，另2支为对照管，按下列加入一依次加入各溶液：
名称
样品管
对照管1
对照管2
50mmol/L磷酸缓冲液（ml）
5.0
5.0
5.0
130mmol/LMet溶液（ml）
0.3
0.3
0.3
750μmol/LNBT溶液（ml）
0.3
0.3
0.3
100μmol/LEDTA－Na2液（ml）
1.0
1.0
1.0
去离子水（ml）
2.0
2.0
2.0
20μmol/L核黄素（ml）
0.3
0.3
0.3
0.3（酶液）
0.3（缓冲液）
0.3（缓冲液）
混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min，然后立即遮光，以遮光管为对照调零，于560nm下测定光密度。
（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
3.SOD活性测定与计算
至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。
四、结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性＝（Ack－AE）×V/（Ack×0.5×W×Vt）
=（Ack－AE）/（Ack×0.015×W）
SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量
上式中：
SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；SOD比活力：
单位以酶单位／mg蛋白表示
Ack：
照光对照管的吸光度AE：
样品管的吸光度
V：
样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）
实验六、过氧化物酶活性测定
一、试验目的：
过氧化物酶是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，他与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有密切关系。
在植物生长发育过程中他的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法——愈创木酚法。
二、实验原理：
在过氧化物酶催化下，双氧水将愈创木酚氧化成茶褐色产物，此产物在λ470nm处有最大吸收峰，故可以通过测其吸光度的变化测定过氧化物酶的活性。
三、实验试剂
1、0.05mol/LPH7.0的磷酸缓冲液：
0.2MA液（Na2HPO4）61ml和0.2MB液（NaH2PO4）39ml混合100ml，用去离子水定容400ml
2、0.05mol/L愈创木酚溶液：
取0.6207g定容100ml
1%愈创木酚溶液：
吸取1毫升愈创木酚，加入少量95%酒精溶解，用水定容100ml，放于棕色试剂瓶中保存备用
3、2%双氧水溶液:
：
取30%H2O210ml用去离子水定容150ml
4.、反应混合液
取50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）30mL，2%过氧化氢10mL，1%愈创木酚10mL混合。
四、操作步骤
1．酶液提取：
清洗干净叶片擦干，称取0.2～0.3g叶片，剪成小片，放入研钵加入适量10%PVPP（除去酚类物质）、石英沙、及2ml50mmol的PH7.0（5.5-7.5）的磷酸缓冲液PBS（0.02-0.1mmol）进行研磨，磨碎后在加入8mlPBS溶液洗涤研钵一并装入离心管内，4℃下4000rmin-1离心15min，收集上清液4℃保存备用。
2．显色反应
类别
对照管
样品管
反应液
3.0mL
温度
25℃
缓冲液0.5mL
酶液0.5mL
测定波长
470nm
五、计算
过氧化物酶活性（△OD470/（min.g））=（△A470×VT）/（W×VS×0.01×t）
式中：
△A470为反应时间内吸光度的变化，W为叶片鲜重g，t为反应时间min，Vt为提取酶液总体积ml，Vs为测定时取用的酶液体积ml。
实验19植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
Ⅰ考马斯亮蓝G–250染色法
一、原理
考马斯亮蓝G–250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）试剂
1.标准蛋白质溶液（100μg/mL牛血清白蛋白）：
称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。
2.考马斯亮蓝试剂：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入100mL85％（W/V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。
常温下可保存一个月。
三、实验步骤
1.标准曲线的绘制
取6支试管，按表26–1加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。
以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试剂
管号
0
1
2
3
4
5
标准蛋白质（mL）
0
0.20
0.40
环境影响的经济损益分析，也称环境影响的经济评价，即估算某一项目、规划或政策所引起的环境影响的经济价值，并将环境影响的经济价值纳入项目、规划或政策的经济费用效益分析中去，以判断这些环境影响对该项目：
规划或政策的可行性会产生多大的影响。
对负面的环境影响估算出的是环境费用，对正面的环境影响估算出的是环境效益。
0.60
0.80
1.00
蒸馏水量（mL）
1.00
0.80
综合性规划
（1）土地利用的有关规划；0.60
1）规划实施可能对相关区域、流域、海域生态系统产生的整体影响。
0.40
0.20
综合性规划
（1）土地利用的有关规划；0
（1）内涵资产定价法蛋白质含量（μg）
0
（二）环境保护法律法规体系20
40
三、环境影响的经济损益分析60
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