生化实验教案.docx

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生化实验教案

实验七、氨基酸的纸上电泳

徐州工程学院教案纸

六、实验结果

氨基酸纸层析图谱并分析结果。

七、思考题

如何采用氨基酸纸层析法分离多种氨基酸？

实验八动物肝脏中DNA的提取

一、目的

学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术

二、原理

核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其它能引起核酸降解的因素的作用。

全部操作过程应在低温下（4℃）进行，必要时还要加入酶抑制剂。

如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。

　　动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/LNaCl），但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度降低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿－异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。

向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。

三、实验器材

1． 猪肝。

2． 722型（或7220型）分光光度计。

3． 匀浆器4． 量筒50ml（×1）、10ml（×1）。

5． 离心机（5000r/min）。

6． 离心管。

7． 试管及试管架。

8． 吸管0.50ml（×2）、1.0ml（×2）、2.0ml（×2）、5.0ml（×1）。

四、实验试剂

1．0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠（pH6.8）。

2．0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液：

氯化钠0.828g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。

3．95％乙醇（A．Ｒ．）。

4．NaCl固体（A．Ｒ．）。

5．5％SDS溶液：

5gSDS溶于100ml水中。

6．氯仿（A．Ｒ．）。

7．V（氯仿）：

V（异戊醇）混合液20：

1。

五、操作

1． 称取猪肝8g，用匀浆器磨碎（冰浴），加入相当于2倍肝重的0.1mol/LNaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min；沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min离心20min；取沉淀。

2． 在上述沉淀中加入40ml0.1mol/LNaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3－异戊醇混合液、4ml5％SDS使其终浓度为0.41％，振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其浓度为1mol/L（约3.6g）。

将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。

3． 在上述水相溶液中加入等体积冷95％乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品。

用蒸馏水溶解并定容至50ml，用二苯胺法测定DNA含量。

4． 提纯将上述所得的DNA粗品置于20ml0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液中，加入1倍体积的氯仿－异戊醇混合液，振摇10min，离心（4000r/min，10min），倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5倍体积95％乙醇，DNA即沉淀析出。

离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。

最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。

四、实验结果

是否可见DNA？

颜色如何？

有无断裂现象？

实验九酵母RNA的提取和定性检测

【实验目的】

1．学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法

2.掌握RNA组分的鉴定方法

【实验原理】

酵母中含有丰富的RNA（可达酵母干重的2.62％～10％），是工业上大规模制备核酸和核苷酸的原料。

稀碱法是工业上常用的RNA提取方法，是用稀碱溶液使细胞裂解，使RNA释放到碱液中，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA；或用酸调整pH至2.5，利用等电点沉淀RNA。

RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基，各种成分以下列反应鉴定：

①磷酸：

用强酸使RNA中的有机磷消化成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵立即转变成蓝色的还原产物—钼蓝。

②核糖：

RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与苔黑酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下生成鲜绿色复合物。

③嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。

【器材与试剂、】

（一）器材

1.150ml锥形瓶

2.沸水浴

3.量筒

4.移液管

5.吸管及滴管

6.布氏漏斗和抽滤装置

7.试管、试管夹及试管架

8.离心机

9.滤纸

10.pH试纸

11.烧杯

12.天平

13.酵母粉

（二）试剂

1.0.2%NaOH溶液

2.95％乙醇

3.冰乙酸

4.无水乙醚

5.1.5mol/LH2SO4

6.浓氨水

7.5％AgNO3溶液

8.苔黑酚乙醇溶液

称取苔黑酚6g，溶解于95％乙醇100ml（冰箱中可保存1个月）。

9.FeCl3的浓盐酸溶液

取10％FeCl32ml，与浓盐酸400ml混合。

10.定磷试剂

（1）17％H2SO4溶液

（2）2.5％钼酸铵溶液

（3）10％抗坏血酸溶液（贮存于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1个月。

溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则已失效。

）

临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合（限当天使用）：

17%H2SO4:

2.5％钼酸铵:

水:

10％抗坏血酸=1:

1:

2:

1（V:

V）

【实验步骤】

（一）RNA的粗提取

1.取酵母粉5g，置于100ml烧杯中，加入0.2％NaOH溶液20ml，搅拌成悬浮液。

2.将悬浮液在沸水浴中加热30min，冷却至室温，分两管4000rpm离心10min。

3.将上清液缓缓倾入95%乙醇30ml中，注意边搅拌边缓缓倾入,用冰乙酸调pH值至2.5。

静置，待RNA沉淀完全后，3000rpm离心3min。

4.弃上清，以95％乙醇10ml洗涤沉淀，3000rpm离心3min。

再用95％乙醇10ml洗涤沉淀，并移入布氏漏斗中抽滤。

5.用无水乙醚洗涤沉淀2次，每次20ml，于布氏漏斗中抽滤至沉淀干燥。

（二）水解RNA

将提取的RNA加入5ml10%H2SO4中，沸水浴加热10min,使RNA水解。

（三）RNA组分鉴定

1.嘌呤碱：

取试管1支，加入水解液1ml，浓氨水2ml，5％的AgNO31ml，观察是否产生白色絮状嘌呤银化物沉淀（放置后可能变为棕黑色）。

2.戊糖：

取试管1支，加入水解液1ml，苔黑酚-FeCI3溶液1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。

3.磷酸：

取试管1支，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。

【要点提示】

1.苔黑酚（又名地衣酚,3,5甲苯二酚）鉴定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。

微量DNA无影响，较多DNA存在时有干扰作用，在试剂中加入适量CUCl2·2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。

2.苔黑酚鉴定戊糖时也可用下列配方：

（1）苔黑酚试剂：

FeCI30.1g溶于浓盐酸100ml，摇匀，贮存备用。

使用前加入苔黑酚0.476g。

（2）苔黑酚试剂：

苔黑酚0.1g溶于浓盐酸100ml中，再加FeCI30.1g（临用前配制）。

3．RNA中磷酸的鉴定方法有两种，原理如下：

（1）钼酸铵试剂鉴定：

钼酸铵试剂：

钼酸铵2g溶解于10％的硫酸100ml。

强酸使RNA分子中的有机磷消化成无机磷，使与钼酸铵试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（NH4）3PO4·12MoO3（黄色沉淀）。

PO43-+3NH4++12MOO42-+24H+=（NH4）3PO4·12MOO3·6H2O↓+6H2O

（2）定磷试剂鉴定：

上述反应当有还原剂存在时，MO6+被还原成MO4+，此Mo4+再与试剂中的其它MO42-结合成MO（MOO4）2或MO3O8,呈蓝色，称为钼蓝。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，因此也可用分光光度法定量测定RNA。

4.用乙醇沉淀RNA时，需用酸中和稀碱，可以加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（浓盐酸1ml加入乙醇100ml中）至溶液pH至2.5。

5.用AgNO3鉴定RNA中的嘌呤碱时，除了产生嘌呤银化物沉淀外，还会产生磷酸银沉淀，磷酸银沉淀可溶于氨水，而嘌呤银化物沉淀在浓氨水中溶解度很低，加入浓氨水可消除PO43+的干扰。

【思考题】

1.用苔黑酚鉴定RNA时加入Cu2+或Fe3+的目的是什么？

2.用AgNO3鉴定嘌呤碱基时加入浓氨水的目的是什么？