壳聚糖絮凝法精制川牛膝总多糖酶提取液的工艺研究.docx

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壳聚糖絮凝法精制川牛膝总多糖酶提取液的工艺研究

壳聚糖絮凝法精制川牛膝总多糖酶提取液的工艺研究

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壳聚糖絮凝法精制川牛膝总多糖酶提取液的工艺研究-机电论文

壳聚糖絮凝法精制川牛膝总多糖酶提取液的工艺研究

成悦刘傲霞夏玉婷谷旭晗韩伟

（华东理工大学中药现代化工程中心，上海200237）

摘要：

以壳聚糖为絮凝剂对川牛膝的总多糖进行了絮凝纯化研究。

通过单因素考察及正交试验得到优化的工艺条件为：

絮凝温度45℃、壳聚糖用量0.4mL/g生药量、絮凝时间2h、药液浓缩比1:

12、药液pH＝4。

此时，多糖保留率76.32%、脱蛋白率64.25%，与传统醇沉工艺相比，絮凝法得到的多糖保留率和纯度较高。

关键词：

壳聚糖；絮凝；川牛膝；总多糖；试剂

StudyontheFlocculatingPurificationProcessofTotalPolysaccharidesfromCyathulaOfficinalisKuanbyUsingChitosan

ChengYueLiuAoxiaXiaYutingGuXuhanHanWei

（EngineeringCenterforTraditionChineseMedicineModernization,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,

Shanghai200237）

Abstract：

Theessaywasaimedatstudyingflocculatingpurificationoftotalpolysaccharidesbyusingchitosan.Theoptimumconditionswereobtainedthroughsinglefactorandorthogonalexperiment.Theresultswereasfollows:

thetemperaturewas45℃,dosageofchitosanwas0.4mL/grawmaterial,flocculationtimewas2h,solutionconcentrationratiowas1:

12,pHofsolutionwas4.Underthiscondition,polysaccharidesretentionratewas76.32%,deproteinizingrateof64.25%.Comparedwiththetraditionalalcoholprecipitationprocess,theretentionrateandpurityofthepolysaccharideoftheflocculationpurificationprocessarehigher.

Keywords：

chitosan;flocculate;CyathulaofficinalisKuan;totalpolysaccharide;reagent

0引言

川牛膝为苋科植物川牛膝（CyathulaofficinaIisKuan）的干燥根，为著名川产药材，具有补肝肾、强筋骨、治疗腰膝酸麻及肝阳眩晕、散癖血、消肿痛等功效。

川牛膝多糖是从川牛膝根中提取的一种生物活性多糖，相对分子质量1000～2200，是高度分支的果聚糖。

现代药理研究表明，川牛膝多糖具有促进红细胞免疫、抗肿瘤、对抗环磷酰胺所致外周白细胞减少等疗效。

絮凝技术是一种简单有效的固液两相体系分离方法，壳聚糖作为一种天然的链状高分子絮凝剂，由葡萄糖胺通过β-1，4-糖苷键连接而成。

由于分子中含有氨基，使壳聚糖在酸性条件下带有正电荷，可发挥电中和与吸附架桥的双重絮凝作用，并具有安全、无毒、稳定的优点。

本文以多糖保留率和脱蛋白率为指标，考察壳聚糖对川牛膝总多糖酶提取液的絮凝纯化工艺，并通过数据分析优化工艺参数。

1材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1药材

川牛膝，产地为四川，购于上海雷允上药店。

将川牛膝粉碎过筛成干粉后进行预处理：

用10倍量的体积分数95%的工业乙醇回流1h，冷却至室温，取上清液回收乙醇，烘干药渣，装袋于阴凉处储存备用。

1.1.2主要试剂

纤维素酶，上海楷洋生物技术有限公司；95%工业乙醇；36%浓盐酸、氢氧化钠、5%苯酚溶液、98%浓硫酸等均为国产分析纯；葡萄糖为标准品（＞95%），上海凌峰化学试剂有限公司；牛血清白蛋白和考马斯亮蓝G-250均为分析纯，上海源聚生物科技有限公司；壳聚糖，上海伟康生物制品有限公司。

1.1.3主要仪器

UV1900PC紫外可见分光光度计，上海亚研电子科技有限公司；pHS-2C数字式pH计，上海雷磁仪器厂；AL204分析天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水真空泵，巩义市英峪予华仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市英峪予华仪器厂；RE-52C旋转蒸发器，上海予华仪器有限公司；RJ-TGL-16C台式高速离心机，无锡市瑞江分机仪器有限公司。

1.2样品及试剂的制备

1.2.1样品溶液的制备

（1）药材的预处理：

将川牛膝粉碎过筛成干粉后进行预处理，用10倍量的体积分数95%的工业乙醇回流1h，冷却至室温，回收乙醇，烘干药渣，装袋于阴凉处储存备用。

（2）样品溶液的制备：

称取20g已处理的药材和60mg纤维素酶，置于500mL的圆底烧瓶中；加入400mLpH＝5的去离子水，在45℃恒温水浴锅中酶解提取30min，再用电热套冷凝回流30min，室温冷却15min后，放入冷水中冷却（敞口）；冷却至室温后抽滤，收集滤液并量取其体积。

1.2.2试剂的制备

（1）葡萄糖标准溶液的制备：

精确称取105℃干燥至恒质量的葡萄糖50mg，加去离子水溶解并定容至500mL，即得0.10mg/mL的葡萄糖标准溶液。

（2）质量分数5%苯酚溶液的制备：

称取精制苯酚2.50g，加去离子水溶液并定容至50mL棕色容量瓶，配制成质量分数5%的苯酚溶液。

（3）蛋白质标准溶液的制备：

准确称取20mg结晶牛血清白蛋白，加水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容，配制成0.20mg/mL的蛋白质标准溶液。

（4）考马斯亮蓝G-250试剂的制备：

准确称取50mg的考马斯亮蓝G-250，将其溶解于25mL95%的乙醇，再加入50mL85%的磷酸，加水定容至500mL。

（5）壳聚糖絮凝剂的制备：

取10g醋酸（ρ=1.050，约为9.5mL）置于600mL大烧杯中，加入适量去离子水稀释；准确称取10.0g壳聚糖，分批多次加入大烧杯中，搅拌至完全溶解，转移至1000mL容量瓶，补充去离子水定容，即配制成1%的壳聚糖醋酸溶液，将其放置于冰箱内2～3天充分溶胀后备用。

1.3分析方法的建立及计算

1.3.1川牛膝总多糖含量的测定

精密吸取葡萄糖标准溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分别置于25mL具塞比色管中，补充去离子水至2.0mL。

加入质量分数5%的苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加入质量分数98%的H2SO45.0mL，摇匀，室温静置30min。

用紫外可见分光光度计分别在489nm波长处测定其吸光度。

以吸光度A为纵坐标、葡萄糖浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：

A＝12.04048C－0.02432，相关系数R＝0.99922。

准确移取2mL样品溶液，按相同的显色操作，测定吸光度，根据回归方程计算样品溶液中总多糖的浓度及多糖保留率。

1.3.2蛋白质含量的测定

分别称取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的蛋白质标准溶液置于25mL具塞比色管中，均补充去离子水至1.0mL，各加入考马斯亮蓝试剂5.0mL，立即摇匀，室温下静置5min，以1mL去离子水作空白对照，于595nm处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、标准品浓度C（mg/mL）为横坐标，绘制蛋白质标准曲线，得回归方程为：

A＝5.6808C－0.0587，相关系数R=0.99932。

取样品溶液1.0mL，按相同的显色操作，测定吸光度，根据回归方程计算样品中的蛋白质的含量及脱蛋白率。

1.4实验方法

移取一定浓缩比的药液20mL，在电磁搅拌状态下，缓慢加入一定量的壳聚糖1%的醋酸溶液，水浴保温搅拌一定时间后取出，离心分离，取上清液测定多糖和蛋白质的含量。

2结果与分析

2.1絮凝时间对絮凝纯化结果的影响

图1为絮凝时间对絮凝纯化结果的影响。

可以看出，多糖保留率随时间的增加而降低，在1.5～2h范围内下降迅速，超过2h后趋于稳定；而脱蛋白率随着时间的增加逐渐增大，并趋于稳定，但絮凝时间过长对提高絮凝效果的作用不大，且多糖的损失会增加。

综上，絮凝时间选取1.5h为宜。

2.2浓缩比对絮凝纯化结果的影响

药液浓缩比对絮凝纯化结果的影响如图2所示，可以看出，多糖保留率和脱蛋白率均随着浓缩比的增大而增大，在稀释到1:

10（g/mL）后，两者均有下降趋势，且脱蛋白率的下降趋势更为明显。

产生这一现象的原因是，当浓缩比合适时，药液能与絮凝剂充分结合，在分子间架桥并发挥絮凝作用。

药液浓度过小，溶液黏度较大，胶粒间距较小，不利于壳聚糖高分子链的分散，多糖易被包裹沉淀，造成多糖损失较大；药液浓度过大，壳聚糖浓度降低，不利于絮凝剂分子与杂质微粒的充分接触，导致脱蛋白率降低。

综上，浓缩比选取1:

10为宜。

2.3温度对絮凝纯化结果的影响

图3为絮凝温度对纯化结果的影响。

可以发现，随着絮凝温度的增加，多糖保留率逐渐下降，而脱蛋白率先上升后下降，在温度为45℃时，脱蛋白率达到最高。

这是因为温度升高，分子热运动较快，絮凝剂与杂质分子的碰撞几率增大，溶液在高温下黏度加大，胶体颗粒结合成的絮凝体也增大，因此加速了絮凝。

但温度过高，易使絮凝剂分子老化，阻碍絮凝。

综上，确定絮凝温度在45℃左右为宜。

2.4壳聚糖用量对絮凝纯化结果的影响

壳聚糖用量对絮凝纯化结果的影响如图4所示。

随着壳聚糖用量的增加，脱蛋白率增加，在0.8mL/g后增加趋势减缓，多糖保留率逐渐下降。

这是因为壳聚糖浓度较低时，絮凝剂分子与杂质微粒的碰撞几率小，进行电中和与吸附架桥的作用弱，不利于絮凝作用的发挥；随着壳聚糖用量增加，碰撞几率增大，除杂效果提升，但不利于架桥作用，使多糖保留率降低。

综上，壳聚糖用量选取0.4mL/g为宜。

2.5溶液pH对絮凝纯化结果的影响

图5为pH值对絮凝纯化结果的影响。

可以看出，随着药液pH的升高，多糖保留率迅速下降，在pH为6之后趋于平稳，而脱蛋白率先迅速上升，后逐渐下降，在pH为4时脱蛋白率最高。

产生这一现象的原因是，壳聚糖具有电中和与吸附交联作用，当pH较低时，蛋白质为阳离子型，使壳聚糖电中和效果降低，脱蛋白率下降，同时多糖损失较多。

当溶液pH较高时，体系中的负电荷增加，壳聚糖电中和负电荷增加，压缩双电层的效率降低，导致蛋白质去除率也下降。

综上，选取溶液pH＝4为宜。

3壳聚糖絮凝纯化正交试验

3.1因素与水平的确定

根据单因素实验结果，选取对川牛膝多糖保留率及脱蛋白率影响较大的因素：

壳聚糖用量（因素A）、浓缩比（因素B）、药液pH（因素C）、絮凝时间（因素D），设计L9（34）正交试验表，结果如表1所示。

3.2正交试验结果分析

现以多糖保留率、脱蛋白率为评价指标，根据L9（34）正交设计开展试验，实验结果与极差分析如表2所示，多糖保留率与脱蛋白率的方差分析分别如表3、表4所示。

由表2可知：

（1）以多糖保留率为评价指标，各因素对壳聚糖絮凝纯化工艺的影响大小依次为：

A＞B＞D＞C，最佳工艺条为A1B3C1D2；表3的方差分析结果表明：

壳聚糖用量、浓缩比、絮凝时间对多糖保留率均有显著影响。

（2）以脱蛋白率为评价指标，各因素对壳聚糖絮凝纯化工艺的影响大小依次为：

A＞C＞D＞B，最佳工艺条件为A2B3C3D3；表4的方差分析结果表明：

壳聚糖用量、药液pH、絮凝时间对脱蛋白率的影响显著。

综合上述分析结果，本研究主要根据脱蛋白率指标优选工艺条件，得到最佳工艺条件A2B3C3D3：

壳聚糖用量0.4mL/g生药量、浓缩比为1:

12、药液pH＝5、絮凝时间为120min，此时多糖保留率为76.32%、脱蛋白率为64.25%。

4结语

（1）以多糖保留率和脱蛋白率为指标，在单因素实验的基础上，选择浓缩比、絮凝时间、壳聚糖用量、药液pH这4个因素进行L9（34）正交设计实验，确定最优的工艺条件为：

壳聚糖用量0.4mL/g生药量、浓缩比为1:

12、溶剂pH＝5、絮凝时间为120min，此时，多糖保留率为76.32%，脱蛋白率为64.25%。

（2）利用统计学方法对正交实验结果进行显著性检验，确定各因素对多糖保留率影响大小的顺序为：

壳聚糖用量＞浓缩比＞药液pH＞絮凝时间，其中壳聚糖用量、浓缩比、絮凝时间都为显著影响因素；确定各因素对脱蛋白率影响大小的顺序为：

壳聚糖用量＞药液pH＞絮凝时间＞浓缩比，其中壳聚糖用量、药液pH、絮凝时间都为显著影响因素。

［参考文献］

[1]刘颖华.川牛膝多糖的制备、结构解析及其体外抗病毒活性的研究[D].北京：

中国科学院研究生院，2003.

[2]刘传敏，邵乐，李金贵，等.酶解超声法提取川牛膝多糖的正交试验研究[J].中兽医医药杂志，2009，28（5）.

[3]成庆利.壳聚糖的结构及抗菌作用研究进展[J].生物技术，2006，16（4）.

[4]F.Renault,B.Sancey,P.M.Badot,etal.Chitosanforcoagulation/flocculationprocessesanecofriendlyapproach[J].EuropeanPolymerJournal,2009（45）.

收稿日期：

2015-07-15

作者简介：

成悦（1992—），女，宁夏银川人，助理工程师，研究方向：

制药工程与技术。

通讯作者：

韩伟（1968—），男，江苏扬州人，博士，教授，从事中药制药工程、化工分离工程的研究工作。