酸奶微生物检验.docx
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酸奶微生物检验
《酸奶卫生标准》
编号:
GB19302—2010
一、准备内容:
1、无菌器材准备表:
仪器名称
数量
平板培养皿
12
1ml移液管
5
10ml移液管
1
玻璃棒
1
试管
25
烧杯
3
锥形瓶
3
2、培养基、试剂准备表:
名称
体积(ml)
BPW
225
LST
100
BGLB
100
氯化钠肉汤
225
B-P琼脂平板
50
平板计数琼脂培养基
150
生理盐水
225、100
备注:
无菌生理盐水
氯化钠2.5g蒸馏水300ml
平板计数琼脂
有现成的培养基,直接称取即可,配制120ml
月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
胰蛋白胨或胰酪胨2.0g
氯化钠0.5g
乳糖0.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4)0.275g
磷酸二氢钾(KH2PO4)0.275g
月桂基硫酸钠0.01g
蒸馏水100mL
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH,高压灭菌121℃,15min。
煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
蛋白胨1g
乳糖1.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液20mL
0.1%煌绿水溶液1.33mL
蒸馏水80mL
pH7.2±0.1
A.2.2制法
将蛋白胨、乳糖溶于约50mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液20mL(将2.0g脱水牛胆粉溶于20mL
蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调节pH,再加入0.1%煌绿水溶液1.33mL,
用蒸馏水补足到100mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
7.5%氯化钠肉汤
蛋白胨2.25g
牛肉膏1.125g
氯化钠16.875g
蒸馏水225mL
pH7.4
将上述成分加热溶解,调节pH,分装,每瓶225mL,121℃高压灭菌15min。
Baird-Parker琼脂平板
胰蛋白胨0.5g
牛肉膏0.25g
酵母膏0.05g
丙酮酸钠0.5g
甘氨酸0.6g
氯化锂(LiCl·6H2O)0.25g
琼脂1.0g
蒸馏水47.5mL
pH7.0±0.2
增菌剂的配法
30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合,保存于冰箱内。
A.4.3制法
将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节pH。
121℃高压灭菌15min。
临用时加热溶化琼脂,冷至50℃,每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。
培养基应是致密不透明的。
使用前在冰箱储存不得超过48h。
二、指标
表3微生物限量
项目
采样方案a及限量(若非制定,均以CFU/g或CFU/ml表示)
检测方法
n
c
m
M
菌落总数
5
2
10000
100000
GB4789.2
大肠菌群
5
2
10
100
GB4789.3
MPN计数法
沙门氏菌
5
0
0/25g(ml)
-
GB4789.4
金黄色葡萄球菌
5
1
10
100
GB4789.10
定性检验
霉菌≤
90
GB4789.15
A:
样品的分析及处理按GB4789.1和GB4789.18执行。
B:
不适用于以发酵稀奶油为原料的产品。
表4乳酸菌数
项目
限量[CFU/g(mL)]
检验方法
乳酸菌数a≥
1×106
GB4789.35
a发酵后经热处理的产品对乳酸菌数不作要求。
三、样品来源:
四、时间安排表
菌落总数
大肠杆菌
霉菌和酵母菌
金黄色葡萄球菌
沙门氏菌
乳酸菌
第1天
无菌器材准备
配置PCA
无菌器材准备
配置LST
无菌器材准备
配置孟加拉红
无菌器材准备
配置样液
无菌器材准备BPW
无菌器材配置MRS平板
第2天
配置样液
制平板
接种LST
配置BGLB
配置样品液
制平板
划线接种到Baird-Parker氏培养基和血平板
配置样液制BS和XLD平板
第3天
培养(36℃)
观察LST产气情况,有产气的接种BGLB
培养(28℃)
革兰氏染色镜检
划线接种到BS和XLD平板
第4天
菌落计数
观察BGLB
菌落计数
观察XLD平板
第5天
报告
查MPN表
报告
报告
报告
观察BS平板
五、样品配置及器材准备
无菌器材
样品液
培养皿
试管
移液管1ml*3/10ml*1;
锥形瓶500ml*1/250ml*1;
烧杯*1
稀释度
配置
菌落总数
9
2
123
25g(ml)样品+225ml7.5%的生理盐水
大肠菌数
—
10
123
霉菌和酵母菌
9
2
123
金黄色葡萄菌属
沙门氏菌
乳酸菌
六、实验内容
(1)菌落总数
操作步骤
1、样品的稀释
1.1液体样品:
称取25g样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶,摇匀,制成1:
10的样品匀液。
1.3用1mL无菌吸管吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
1.4另取1mL无菌吸管,按上述操作程序,制备1:
1000稀释样品匀液。
每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或吸头。
1.5根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释时,吸取1mL样品匀液于无菌平皿内,及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿20mL左右,并混合均匀,每个稀释度做两个平皿。
同时,分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
1.6及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
2、培养
2.1待琼脂凝固后,将平板翻转,置于36℃±1℃恒温箱中培养48h±2h。
3、菌落计数
可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
3.1选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
7结果与报告
4、菌落总数的计算方法
4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每g(mL)样品中菌落总数结果。
4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按公式
(1)计算:
式中:
N——样品中菌落数;
ΣC——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d——稀释因子(第一稀释度)。
4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
4.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5、菌落总数的报告
5.1菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
5.2菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
5.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。
5.4若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
5.5称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
(2)大肠菌数
操作步骤
操作步骤
2.1样品的稀释
2.1.1固体和半固体样品:
称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,
8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋
中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:
10的样品匀液。
2.1.2液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
2.1.3样品匀液的pH值应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
2.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液
或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌
吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
2.1.5根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释
1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
2.2初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3
管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36
℃±1℃培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验,如未产气则继续
培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
2.3复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,36℃±1
℃培养48h±2h,观察产气情况。
产气者,计为大肠菌群阳性管。
2.4大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数,检索MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。
(3)霉菌和酵母菌
操作步骤
3.1样品的稀释
3.1.1固体和半固体样品:
称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中,充分振摇,即为1:
10
稀释液。
或放入盛有225mL无菌蒸馏水的均质袋中,用拍击式均质器拍打2min,制成1:
10的样品匀
液。
3.1.2液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶(可在瓶内预置适
当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
3.1.3取1mL1:
10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为
1:
100稀释液。
3.1.4按5.1.3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管。
3.1.5根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),
在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。
同时分别取1mL
样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。
5.1.6及时将15mL~20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于
46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。
3.2培养
待琼脂凝固后,将平板倒置,28℃±1℃培养5d,观察并记录。
3.3菌落计数
肉眼观察,必要时可用放大镜,记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。
以菌落形成单位(colony
formingunits,CFU)表示。
选取菌落数在10CFU~150CFU的平板,根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。
霉菌蔓延生长覆
盖整个平板的可记录为多不可计。
菌落数应采用两个平板的平均数。
(4)金黄色葡萄球菌
操作步骤
4.1样品的处理
称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内,
8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨
大豆肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min。
若样品为液态,吸取25mL样品至盛有
225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃
珠)中,振荡混匀。
4.2增菌和分离培养
4.2.1将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h~24h。
金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生
长,污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
4.2.2将上述培养物,分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板,血平板36℃±1℃培养18h~24h。
Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h~24h或45h~48h。
4.2.3金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上,菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为
淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。
用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度,偶然会遇
到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌
落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。
在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、
金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。
挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固
酶试验。
4.3鉴定
4.3.1染色镜检:
金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5μm~1μm。
(5)沙门氏菌
(6)乳酸菌
6操作步骤
6.1样品制备
6.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
6.1.2冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的条件解冻,时间不超过15min。
6.1.3固体和半固体食品:
以无菌操作称取25g样品,置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内,于8000r/min~10000r/min均质1min~2min,制成1:
10样品匀液;或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min制成1:
10的样品匀液。
6.1.4液体样品:
液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1:
10的样品匀液。
6.2步骤
6.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水
的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
6.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
6.2.3乳酸菌计数
6.2.3.1乳酸菌总数
根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板,使用L形棒进行表面涂布。
36℃±1℃,厌氧培养48h±2h后计数平板上的所有菌落数。
从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。
七、实验记录
1、细菌总数记录表
培养皿
10-1
10-2
10-3
空白
菌落总数计算公式
菌落总数
1
N=∑C/(n1+0.1n2)d
2
2、大肠菌群计数记录表
稀释度
培养基
10-1
10-2
10-3
空白
3支LST管肉汤管
3支BGLB肉汤管
3、霉菌总数计数记录表
培养皿
10-1
10-2
10-3
空白
霉菌总数计算公式
霉菌总数
1
N=∑C/(n1+0.1n2)d
2
八、附录:
1、大肠菌群最可能数(MPN)检索表
2、实验中国标参照食品微生物检验实验讲义