酸奶微生物检验Word文档格式.doc

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月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

胰蛋白胨或胰酪胨2.0g

氯化钠0.5g

乳糖0.5g

磷酸氢二钾（K2HPO4）0.275g

磷酸二氢钾（KH2PO4）0.275g

月桂基硫酸钠0.01g

蒸馏水100mL

将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，煮沸溶解，调节pH，高压灭菌121℃，15min。

煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤

蛋白胨1g

乳糖1.0g

牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液20mL

0.1%煌绿水溶液1.33mL

蒸馏水80mL

pH7.2±

0.1

A.2.2制法

将蛋白胨、乳糖溶于约50mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液20mL（将2.0g脱水牛胆粉溶于20mL

蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液1.33mL，

用蒸馏水补足到100mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

7.5%氯化钠肉汤

蛋白胨2.25g

牛肉膏1.125g

氯化钠16.875g

蒸馏水225mL

pH7.4

将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。

Baird－Parker琼脂平板

胰蛋白胨0.5g

牛肉膏0.25g

酵母膏0.05g

丙酮酸钠0.5g

甘氨酸0.6g

氯化锂（LiCl·

6H2O）0.25g

琼脂1.0g

蒸馏水47.5mL

pH7.0±

0.2

增菌剂的配法

30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于冰箱内。

A.4.3制法

将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。

临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。

培养基应是致密不透明的。

使用前在冰箱储存不得超过48h。

二、指标

表3微生物限量

项目

采样方案a及限量（若非制定，均以CFU/g或CFU/ml表示）

检测方法

n

c

m

M

菌落总数

2

10000

100000

GB4789.2

大肠菌群

10

GB4789.3

MPN计数法

沙门氏菌

0/25g（ml）

-

GB4789.4

金黄色葡萄球菌

GB4789.10

定性检验

霉菌≤

90

GB4789.15

A：

样品的分析及处理按GB4789.1和GB4789.18执行。

B：

不适用于以发酵稀奶油为原料的产品。

表4乳酸菌数

项目

限量[CFU/g（mL）]

检验方法

乳酸菌数a≥

1×

106

GB4789.35

a发酵后经热处理的产品对乳酸菌数不作要求。

三、样品来源：

四、时间安排表

大肠杆菌

霉菌和酵母菌

乳酸菌

第1天

无菌器材准备

配置PCA

配置LST

配置孟加拉红

配置样液

无菌器材准备BPW

无菌器材配置MRS平板

第2天

制平板

接种LST

配置BGLB

配置样品液

划线接种到Baird－Parker氏培养基和血平板

配置样液制BS和XLD平板

第3天

培养（36℃）

观察LST产气情况，有产气的接种BGLB

培养（28℃）

革兰氏染色镜检

划线接种到BS和XLD平板

第4天

菌落计数

观察BGLB

观察XLD平板

第5天

报告

查MPN表

观察BS平板

五、样品配置及器材准备

无菌器材

样品液

培养皿

移液管1ml*3/10ml*1;

锥形瓶500ml*1/250ml*1;

烧杯*1

稀释度

配置

9

123

25g（ml）样品+225ml7.5%的生理盐水

大肠菌数

—

金黄色葡萄菌属

六、实验内容

（1）菌落总数

操作步骤

1、样品的稀释

1.1液体样品：

称取25g样品置盛有225mL生理盐水的无菌锥形瓶，摇匀，制成1:

10的样品匀液。

1.3用1mL无菌吸管吸取1:

10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:

100的样品匀液。

1.4另取1mL无菌吸管，按上述操作程序，制备1:

1000稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。

1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿20mL左右，并混合均匀，每个稀释度做两个平皿。

同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

1.6及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±

1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

2、培养

2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，置于36℃±

1℃恒温箱中培养48h±

2h。

3、菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。

3.1选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；

若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7结果与报告

4、菌落总数的计算方法

4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式

（1）计算：

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

4.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

5、菌落总数的报告

5.1菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

5.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；

也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

5.3若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

5.4若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

5.5称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

（2）大肠菌数

2.1样品的稀释

2.1.1固体和半固体样品：

称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,

8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋

中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:

2.1.2液体样品：

以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶

（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:

2.1.3样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。

2.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:

10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液

或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌

吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:

2.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释

1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。

2.2初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3

管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36

℃±

1℃培养24h±

2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±

2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续

培养至48h±

2h，产气者进行复发酵试验。

未产气者为大肠菌群阴性。

2.3复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±

℃培养48h±

2h，观察产气情况。

产气者，计为大肠菌群阳性管。

2.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

（3）霉菌和酵母菌

3.1样品的稀释

3.1.1固体和半固体样品：

称取25g样品至盛有225mL灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:

稀释液。

或放入盛有225mL无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:

10的样品匀

液。

3.1.2液体样品：

以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适

当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:

3.1.3取1mL1:

10稀释液注入含有9mL无菌水的试管中,另换一支1mL无菌吸管反复吹吸,此液为

1:

100稀释液。

3.1.4按5.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。

每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。

3.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），

在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液于2个无菌平皿内。

同时分别取1mL

样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。

5.1.6及时将15mL～20mL冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基（可放置于

46℃±

1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

3.2培养

待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±

1℃培养5d，观察并记录。

3.3菌落计数

肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。

以菌落形成单位（colony

formingunits，CFU）表示。

选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。

霉菌蔓延生长覆

盖整个平板的可记录为多不可计。

菌落数应采用两个平板的平均数。

（4）金黄色葡萄球菌

4.1样品的处理

称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，

8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨

大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。

若样品为液态，吸取25mL样品至盛有

225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃

珠）中，振荡混匀。

4.2增菌和分离培养

4.2.1将上述样品匀液于36℃±

1℃培养18h～24h。

金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生

长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。

4.2.2将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±

Baird-Parker平板36℃±

1℃培养18h～24h或45h～48h。

4.2.3金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为

淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。

用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇

到非脂肪溶解的类似菌落；

但无混浊带及透明圈。

长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌

落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。

在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、

金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。

挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固

酶试验。

4.3鉴定

4.3.1染色镜检：

金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm。

（5）沙门氏菌

BS

XLD（或HE、显色培养基）

挑取可疑菌落

TSI,赖氨酸，NA，靛基质，尿素（pH7.2），KCN

H2S+靛基质+

尿素-KCN-

赖氨酸+

H2S-靛基质-

赖氨酸+/-

反应结果与左侧描述不符

生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+

H2S+靛基质-

甘露醇+、山梨醇+

ONPG-

沙门氏菌，血清学试验

非沙门氏菌

42℃±

1℃，18h～24h

36℃±

1℃，40h～48h

检样

25g（ml）样品+225mlBPW

1ml+TTB10ml

1ml+SC10ml

1℃，8h～18h

（6）乳酸菌

6操作步骤

6.1样品制备

6.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。

6.1.2冷冻样品可先使其在2℃～5℃条件下解冻，时间不超过18h，也可在温度不超过45℃的条件解冻，时间不超过15min。

6.1.3固体和半固体食品：

以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:

10样品匀液；

或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:

6.1.4液体样品：

液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:

6.2步骤

6.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:

10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水

的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:

6.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。

6.2.3乳酸菌计数

6.2.3.1乳酸菌总数

根据待检样品活菌总数的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L形棒进行表面涂布。

1℃，厌氧培养48h±

2h后计数平板上的所有菌落数。

从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。

七、实验记录

1、细菌总数记录表

10-1

10-2

10-3

空白

菌落总数计算公式

N=∑C/（n1+0.1n2）d

2、大肠菌群计数记录表

稀释度

培养基

3支LST管肉汤管

3支BGLB肉汤管

3、霉菌总数计数记录表

霉菌总数计算公式

霉菌总数

八、附录：

1、大肠菌群最可能数（MPN）检索表

2、实验中国标参照食品微生物检验实验讲义