不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响张力涛本科论文.docx
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不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响张力涛本科论文
本科毕业论文
题目不同方法对鳟鱼基因组DNA提取
效果的影响
学院动物科学技术学院
专业水产养殖学
毕业届别2011届
姓名张力涛
指导教师蔡原
职称副教授
甘肃农业大学教务处制
二〇一一年六月
目录
题目……………………………………………………………………2
摘要……………………………………………………………………2
1文献综述………………………………………………………………2
1.1甘肃省虹鳟鱼种质资源………………………………………2
1.2国内外虹鳟鱼分子水平研究进展……………………………2
1.3研究目的及意义……………………………………………………3
2材料与方法……………………………………………………………3
2.1实验材料……………………………………………………………3
2.1.1实验样品…………………………………………………………3
2.1.2主要仪器…………………………………………………………3
2.1.2主要试剂………………………………………………………4
2.1.4溶液配制………………………………………………………4
2.2基因组DNA提取方法………………………………………………5
2.3基因组DNA检测……………………………………………………6
2.3.1琼脂糖凝胶电泳检测…………………………………………6
2.3.2DNA纯度及浓度测定…………………………………………6
3结果与分析…………………………………………………………6
3.1琼脂糖凝胶电泳检测结果………………………………………6
3.2ND-1000型分光光度计检测结果…………………………………7
4讨论……………………………………………………………………9
5结果…………………………………………………………………10
参考文献………………………………………………………………11
摘要…………………………………………………………………13
致谢…………………………………………………………………14
不同方法对鳟鱼基因组DNA提取效果的影响
张力涛
（甘肃农业大学动物科学技术学院甘肃兰州730070）
摘要为虹鳟鱼遗传特征研究奠定基因组DNA提取的实验基础，本研究以虹鳟鱼肌肉组织为材料,按照常规的酚-氯仿抽提法和另外设计的一种不同方法进行基因组DNA提取并比较其效果。
结果表明,采用常规酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA受蛋白质污染小；而另一种未加蛋白酶K的DNA提取法由于蛋白质未被消化降解且抽提次数较少，虽提取的DNA浓度较高但蛋白质残留较为严重，这对于PCR扩增的影响较大。
因此，使用蛋白酶K的常规酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA适于PCR扩增等后续实验研究。
关键词鳟鱼；基因组DNA；提取；效果；比较
1文献综述
1.1甘肃省虹鳟鱼种质资源
虹鳟（Oncorhynchusmykiss）属鲱形目、鲑科,是我国淡水养殖的主要经济鱼类。
原产于美国加利福尼亚,1874年经人工迁徙驯化已在世界各地进行养殖,1959年从朝鲜移入我国黑龙江省,目前国内已有20多个省（市）开展了虹鳟养殖。
甘肃是国内引进虹鳟试养（1977年）较早的省份之一，在20世纪90年代初以冷水性鱼类虹鳟的突变体为材料选育成了甘肃金鳟新品系，2007年4月被农业部列为适宜在全国具冷水资源的地区养殖的优良品种。
其与目前国内外养殖的道氏虹鳟、日本金鳟相比，甘肃金鳟（Oncorhynchusmykissaguabonita）体色更艳丽，且性情温顺、生长速度快、抗病力强、个体大、耐低氧、肉质细嫩，具有很高的观赏价值和食用价值等特点，深受渔业生产者和消费者的青睐，在国内具有很强的市场竞争能力。
1.2国内外虹鳟鱼分子水平研究进展
随着分子生物学的快速发展，国内外对虹鳟在分子水平上也展开了多方面的研究工作。
在Young等（1998）就建立了虹鳟二倍体的遗传连锁图谱[1],而后Sakamoto等（2000）又建立了微卫星相关的精细连锁图谱[2]。
功能基因研究方面，虹鳟生长激素基因的cDNA于1986年被克隆并在大肠杆菌中表达[3]，随后虹鳟生长激素基因的二种结构类型又被发现[4]。
近年来，虹鳟生长激素基因的内含子与激素调节、垂体表达关系等也有研究报道[5,6]；同时，利用基因型频率计算雌雄间遗传差异和亲子鉴别技术进行虹鳟鱼亲本的选择已有初步研究成果[7]。
在鳟鱼的遗传多样性及遗传资源研究方面，Robert（2003）和Riho等（2007）在分子水平上对虹鳟的遗传多样性及其遗传资源评价开展了卓有成效的研究[8]。
在国内，张艳萍等（2008）采用RAPD技术,对甘肃金鳟的人工繁殖群体进行了遗传多样性研究,并和日本金鳟、道氏虹鳟的遗传结构进行了比较[9，10]。
赵莹莹等（2006）利用微卫星标记对黑龙江水产研究所的6个虹鳟养殖群体进行了研究[11]，于冬梅等（2008）对黑龙江引进的虹鳟养殖群体遗传结构进行了研究[12]。
目前在分子水平上开展遗传多样性和遗传资源评价的技术相当成熟，并在许多动植物研究中取得了显著成果。
鳟鱼作为具有极高食用和观赏价值之一的物种，在分子水平上的研究相对较少，尤其是对甘肃金鳟和虹鳟鱼遗传资源的系统研究很少有报道，因此对其展开相关研究具有重要意义。
1.3研究目的及意义
随着分子生物学研究的迅速发展,基因组DNA（genomicDNA，gDNA）的提取已成为一项常规实验,是分子遗传学实验中最常用的基本操作之一,也是最关键的一步。
尽管有关提取DNA方法的报道很多,但针对不同的生物材料,一些细微的差别会影响DNA提取的效果，进而影响后续研究，如PCR扩增、限制性内切酶的酶切反应以及分子克隆、测序等实验环节。
因此，根据具体研究材料，选择简便、快速、优质高效的基因组DNA提取方法尤为重要。
为了获得较高质量的鳟鱼基因组DNA，为遗传多样性研究和遗传资源评价等奠定基础，本研究以常规酚-氯仿抽提法为基础，在个别步骤上设计不同处理进行甘肃鳟鱼基因组DNA提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度计进行提取效果检测，比较不同处理的基因组DNA提取效果。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1试验样品
本研究以虹鳟鱼肌肉组织为材料，来自甘肃省刘家峡养殖场。
2.1.2主要仪器
MILLIQ超纯水系统、TGL-16B型冷冻高速离心机、HH-S4型数显恒温水浴锅、电子天平、移液枪、DYY-6C型电泳仪、DYY-III型水平电泳槽、SIM-F124制冰机、YXQ-LS-30SII型立式压力蒸汽灭菌器、微波炉、凝胶成像分析系统（法国，Vilberlourmat）、超低温冰箱、ND-1000NanoDropSpectrophotometerv3.3DNA（NanoDropTechnologies,Inc）。
2.1.3主要试剂
Tris碱（三羟甲基氨基甲烷）、SDS（十二烷基硫酸钠）、EDTA（乙二胺四乙酸二钠）、琼脂糖、蛋白酶K。
无水乙醇、硼酸、氢氧化钠、冰乙酸、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、盐酸、醋酸钠均为国产分析纯。
2.1.4溶液配制
（1）1MTris.HCl（pH8.0）:
称取60.57gTris溶于400m1双蒸水中，加浓盐酸调pH至8.0，定容至500m1，高压灭菌，4℃保存。
（2）0.5MEDTA（pH8.0）:
称取18.61g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA.2H2O）溶于50m1双蒸水中，调节pH至8.0，定容至100m1，高压灭菌，4℃保存。
（3）10%SDS:
10gSDS溶于90m1水中，加热至68℃助溶，用HCI调pH值至7.2，定容至100mL。
（4）2MNaCI:
称取58.44gNaCI溶于500m1超纯水中，高压灭菌.
（5）组织样解液：
1MTris.HCl（pH8.0）25ml，0.5MEDTA100mL、2MNaCI25ml，10%SDS50ml，加超纯水定容至500mL。
（6）蛋白酶K（20）mg/ml:
100mg蛋白酶K溶于5ml灭菌双蒸水，1mL管EP管分装，-20℃保存。
（7）TE缓冲液（pH8.0）:
1MTris-HCI（pH8.0）5mL、0.5MEDTA（pH8.0）1mL，加超纯水定容至500mL，高压灭菌。
（8）3MNaAc（pH5.2）:
称取12.305g无水NaAc加双蒸水溶解，定容至50m1,加冰乙酸调节pH至5.2，高压灭菌。
（9）氯仿/异戊醇（24:
1）:
将氯仿、异戊醇按24:
1体积充分混合后装入棕色瓶中，4℃保存。
（10）饱和酚/氯仿/异戊醇（25:
24:
1）:
将饱和酚、氯仿、异戊醇按25;24:
1体积充分混合后装入棕色瓶中，4℃保存。
（11）5×TBE缓冲液:
称取Tris碱54g,硼酸27.5g，加入20mL0.5MEDTA（pH8.0），加蒸馏水溶解，定容至1000mL，室温保存。
（12）1×TBE:
将5×TBE与蒸馏水按1:
4混合。
（13）1.0%的琼脂糖:
1.0g琼脂糖充分溶解于100m11×TBE缓冲液中。
2.2基因组DNA的提取方法
2.2.1采用常规酚-氯仿抽提法，参考《分子克隆试验指南》[13]。
（1）将鱼肉组织剪碎，取大约0.03g～0.05g装入1.5ml高压灭菌离心管中（注：
每一样品剪完所用镊子、手术剪刀用酒精棉球擦干净，除去残留的组织；酒精挥发干净）；
（2）向各个EP管中加入600μL组织裂解液，用封口膜封口后放入55℃恒温水浴箱中温浴3-4h；
（3）加入ProK（20mg/ml）溶液10μL，封口后55℃水浴锅消化12h（过夜，直到组织全部被消化）；
（4）将样品从水浴锅中取出，待冷却至室温后加入等体积约600μL的Tris饱和酚，将样品插入泡沫板后缓慢颠倒摇晃10min，使溶液的两相充分混匀，然后放入离心机在4℃12000rpm下离心10min；
（5）用剪好的蓝枪头吸取上清到另一1.5mlEP管中（用剪刀将1mL蓝枪头剪成直径大于3mm；吸取上清液时不要把上层那层乳白色的蛋白质吸上来，不要吸出两相界面）；
（6）往上清液中加入600μLTris饱和酚，摇动混匀10min，在4℃12000rpm下离心10min；
（7）吸取上层清液，加入等体积的酚：
氯仿：
异戊醇（25：
24：
1）混匀10min（300μL酚、300μL氯仿：
异戊醇），在4℃12000rpm下离心10min；
（8）取上清液加入等体积的氯仿：
异戊醇（24：
1）600μL，混匀10min，在4℃12000rpm下离心10min；
（9）取上清液加入60μL的3mol/LNaAc和-20℃充分预冷无水乙醇1000μL，盖上盖子轻摇即出现乳白色丝状DNA沉淀浮与液体中。
将样品置于冰中15min，取出4℃12000rpm下离心10min，使DNA沉于管底部；
（10）弃上清，加75％乙醇1000μL，混匀漂洗以除残留的盐；
（11）4℃，12000rpm离心2min，弃上清，加75％乙醇1000μL混匀漂洗DNA；
（12）4℃，12000rpm离心2min，小心倒掉乙醇，将离心管倒扣与滤纸上，置于室温下干燥；
（13）待乙醇完全挥发，加入200μLTE溶解DNA，放入-20℃冰箱中保存。
2.2.2对比方法的DNA提取方法
（1）将鱼肉组织剪碎，取大约0.03g～0.05g装入1.5ml高压灭菌离心管中；
（2）向各个EP管中加入300μL预冷TE（防止组织块凝固，尽可能制成细胞悬液），3000rpm离心5min；
（3）弃上清，加入1000μL组织裂解液，置于55℃水浴锅消化（约3h）至澄清；
（4）取上清液，往上清液中加入300μL和300μL氯仿抽提，缓慢摇动充分混合10min，13000rpm，离心10min；
（5）取上清液于另一EP管中，加入600μL氯仿抽提，充分混合10min，13000rpm，离心10min；
（6）取上清液于另一EP管中，加入1000μL无水乙醇沉淀DNA（轻轻摇动EP管，可见絮状沉淀产生），13000rpm，离心8min，弃上清；
（7）加入70%乙醇500μL，混匀，12000rpm，离心2min，弃上清；
（8）将EP管倒置于干燥滤纸上，干燥后加入100μLTE溶解，放入-20℃冰箱中保存。
2.3基因组DNA检测
2.3.1琼脂糖凝胶电泳检测
取3ulDNA提取样品与0.5ul6×Buffer上样缓冲液混匀，加样于1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，100V电压下电泳20min于紫外灯下观察结果，并拍照。
2.3.2基因组DNA纯度及浓度检测
基因组DNA浓度及纯度的检测委托甘肃农业大学检测中心实验室工作人员完成。
3结果与分析
3.1琼脂糖凝胶电泳检测结果
提取的基因组DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1。
由图可见，对比方法提取的基因组DNA条带最亮，说明其浓度最高，酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA相对对比方法条带较暗，说明其浓度较低。
但从基因组DNA目的条带下方的拖带情况来看，同时能够说明酚-氯仿提取的基因组DNA降解程度非常低，对比方法提取的基因组DNA降解最为严重。
图1.基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果
3.2ND-1000型分光光度计检测结果
ND-1000型分光光度计测定鳟鱼基因组DNA的A260/A280值及浓度见表2。
A260/A280指基因组DNA溶液在波长260nm与280nm处的光吸收值的比值，该值可以反映基因组DNA
表2基因组DNA的A260/A280值及浓度测定结果
样品名称
A260/A280
浓度（ng/μL）
酚-氯仿
对比方法
酚-氯仿
对比方法
H1
2.00
1.72
39.43
72.23
H2
2.45
1.72
13.62
91.32
H3
2.14
1.68
45.15
80.71
H4
2.08
2.05
58.47
132.26
H5
2.06
1.81
67.80
162.92
H6
2.12
1.97
46.59
112.30
H7
2.01
1.72
51.48
126.84
H8
2.11
1.86
61.17
108.50
H9
2.00
1.88
29.13
98.66
H10
2.32
1.96
42.62
84.71
H11
2.16
2.00
55.31
105.64
H12
2.05
2.00
32.15
132.57
H13
2.13
1.73
24.98
151.49
H14
2.34
1.86
47.53
117.60
H15
2.24
1.93
60.43
88.64
H16
2.28
1.96
59.68
110.56
H17
2.08
2.05
41.49
94.61
H18
2.06
2.03
50.36
138.56
H19
2.17
1.84
47.70
121.05
H20
2.26
1.94
19.80
99.16
H21
2.30
1.92
51.67
128.46
H22
2.22
1.72
67.11
114.67
H23
2.04
1.80
39.41
91.16
H24
2.08
1.98
55.17
87.84
H25
2.10
1.90
45.12
138.18
H26
2.04
1.86
23.75
116.94
H27
2.32
1.73
34.18
111.73
H28
2.20
1.97
60.81
106.15
H29
2.18
2.01
27.16
98.16
溶液的纯度。
由表可以看出，酚-氯仿抽提法基因组DNA的A260/A280值均在2.0以上，对比方法的A260/A280值在1.68与2.05之间，对比方法提取的基因组DNA浓度最高，而酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA浓度稍低。
采用ND-1000型分光光度计检测基因组DNA的光吸收峰见图2。
由图可见，酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA最高吸收峰出现在260nm的波长处，而核酸的最大吸收波长正好是260nm，说明得到的DNA溶液纯度较好，受杂质影响较小；对比方法在260nm处没有较为理想的光吸收峰。
图2-1酚-氯仿抽提法的基因组DNA光吸收峰
图2-2对比方法的基因组DNA光吸收峰
4讨论
提取动物基因组DNA的方法较多，大致有以下几种：
酚-氯仿法、试剂盒法、甲酰胺法、缠绕DNA法等。
但各方法中最为关键的一点是消除蛋白质、RNA以及提取过程中试剂残留物等杂质污染，同时也尽可能降低DNA降解程度。
如果提取的DNA中含上述物质的污染，将直接影响后续PCR扩增等实验环节[14，15]，因此DNA的纯化程度对后续实验的成功与否起着关键性的作用。
酚-氯仿法提取基因组DNA通常是采用SDS和蛋白酶K来消化处理样品。
SDS能溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，而使细胞膜被破坏，解离细胞中的核蛋白；蛋白酶K能水解消化白质，特别是与DNA结合的组蛋白，蛋白质被消化降解后与其他细胞组分一同被酚和氯仿等有机溶剂抽提出来，再用醋酸钠沉淀，最后经乙醇洗涤得到较高质量的DNA。
酚-氯仿抽提法是提取动物基因组DNA最常用的方法。
提取动物基因组DNA一般常用以下组织:
鳍条、毛发、血液、肝、肾和肌肉等。
本研究以肌肉组织为材料进行DNA提取，其取材容易,易于剪碎、消化,操作简单。
本研究提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测发现,对比方法的DNA条带最亮，其原因主要是在DNA提取过程中未加Tris饱和酚，抽提次数少，DNA损失小，浓度高，故条带亮。
但对比方法的DNA有拖带现象，可能是降解的DNA或是RNA。
酚-氯仿抽提法提取的DNA条带清晰，没有拖带现象，但比起对比方法的条带较暗，因为DNA提取时抽提的次数较方法2多了两次，DNA损失大，浓度低。
核酸具有紫外吸收特性，一般最大吸收波长为260nm。
DNA的纯度通过A260/A280反应出来，一般来说，该值在1.8左右，说明DNA溶液受蛋白质、RNA和其他有机质等小分子物质污染较小；比值高于1.8说明有RNA及小分子物质存在；低于1.8，说明有蛋白质和酚等物质污染，尤其是270nm为最高峰吸收时[16]。
唐恩洁等（1997）认为用于PCR扩增模板的A260/A280的比值应大于1.8（DNA）或2.0（RNA）,方能获得良好的PCR扩增结果[17]。
谢友菊等（1990）研究发现质量较好的DNA其A260/A280值应在1.7～2.0之间，若大于2.0则说明RNA尚未除净，小于1.7则说明样品有蛋白或酚[18]。
李明云等（2002）用试剂盒法提取的大黄鱼基因组DNA的A260/A280值在1.75～1.90之间[19]。
刘臻等（2004）利用酚-氯仿法提取的鲫鱼基因组DNA的A260/A280值在1.66～1.87之间[20]。
从DNA的A260/A280值和DNA光吸收峰来看，本研究方法1的基因组DNAA260/A280值均在2.0以上，且DNA最高吸收峰在260nm处，分析其原因主要是由于组织中蛋白质被蛋白酶K消化后而被抽提出来，而对其中的RNA未作降解处理，其中存在一定的RNA。
方法2DNA的A260/A280值在1.68～2.05之间，且没有形成理想的光吸收峰，提取效果不稳定，原因是DNA提取操作过程中抽提次数较少且未用蛋白酶K处理，DNA中蛋白质和酚等杂质较多。
方法3提取的基因组DNAA260/A280值处于1.69～1.83之间，光吸收最高峰在270nm波长处，可能也是因为蛋白质抽提不彻底。
从以上分析来看，方法1提取的基因组DNA蛋白质含量低而RNA含量高，方法2和方法3提取的DNA蛋白质和RNA的含量都比较高，由于蛋白质对PCR扩增的影响较大而RNA易降解对PCR扩增影响不大，因此，方法1提取的基因组DNA质量好，适于PCR扩增等后续实验研究。
5结论
采用常规酚-氯仿抽提法由于蛋白酶K的作用在提取的基因组DNA中蛋白质污染较小，而在不加蛋白酶K的提取方法中由于蛋白质残留较为严重，但由于抽提次数较少，提取的DNA浓度较高。
由于蛋白质对PCR扩增的影响较大而RNA易降解对PCR扩增影响不大，因此，使用蛋白酶K的常规酚-氯仿抽提法提取的基因组DNA质量好，更适于PCR扩增等后续实验研究。
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