细胞模型建立的指导原则和标准操作标准第一版.docx

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细胞模型建立的指导原则和标准操作标准第一版

细胞模型建立的指导原则和标准操作规范

沈阳军区总医院医学实验科

2012年6月15日

第一部分细胞模型建立的操作环境

1.细胞培养室结构布局的设计：

细胞培养室的结构布局必须合理，才能够使细胞培养工作顺利地进行，否则，则可能因为环境不符合要求而导致细胞培养经常出现问题，甚至失败。

细胞培养室的选址要选择建筑物中僻静，少尘，人流走动稀少的位置。

细胞培养室的结构应该包括细胞培养间、更衣间、缓冲间等。

细胞培养间内仪器设备的摆放要合理，总的原则是防止污染、方便实验。

部分结构布局参见GMP格局设计。

2.细胞培养室的空气净化和消毒：

细胞培养室的空气质量的优劣直接影响细胞培养的质量，有条件的单位应当安装空气净化设备，使细胞培养间的空气至少达到10万级，局部百级。

如果没有条件，细胞培养间的窗户应该密闭，以防止外界的灰尘进入。

细胞培养间应安装紫外线灯，在进行细胞培养前照射30分钟。

每周应用过氧乙酸或福尔马林熏蒸消毒以及其他化学消毒剂消毒和熏蒸（消毒和熏蒸方法见附件10）。

3.超净工作台和生物安全柜：

超净工作台和生物安全柜是细胞培养必须的设备，在超净工作台和生物安全柜中，可以保持空气的质量达到百级，在这样的局部环境中进行细胞培养操作，可以避免因为空气所导致的污染。

在使用前必须对超净工作台和生物安全柜进行一系列预处理，

（1）紫外线照射30分钟；

（2）打开风机，运行10～15分钟；（3）用75%医用酒精擦拭工作台面和内面四壁。

（4）退场时也要用75%医用酒精擦拭工作台面和内面四壁后撤场。

详细操作按《BSC-1500ⅡA2-X型生物安全柜操作规程》执行。

4.细胞培养室内温度和湿度的控制：

细胞培养室内温度和湿

度不合适，容易导致细菌霉菌生长，极易引起细胞污染，

因此，必须对细胞培养室内温度和湿度进行控制。

对温度

的控制一般使用空调，将室内温度控制在20-25℃之间。

湿度过大容易导致霉菌生长，温度及相对湿度标准：

温度

18～26℃，相对湿度45～65%。

详细内容见《洁净区压差

及温湿度监控规程》。

5．细胞培养室的定期清洁消毒：

细胞培养室的清洁消毒分为日清洁消毒、周清洁消毒和月清洁消毒。

日清洁：

每日工作完毕后，及时清扫细胞培养间，将实验用过的耗材、废液等移出细胞培养间，以75%医用酒精擦拭工作台面和各种仪器表面。

周清洁：

每周安排固定的时间对细胞培养间进行清扫，包括以75%医用酒精擦拭工作台面和各种仪器表面，以过氧乙酸或爱尔施消毒液擦拭地板，紫外灯空气消毒或过氧乙酸熏蒸空气消毒。

月清洁：

对细胞培养间进行一次彻底地大清扫，包括以75%医用酒精擦拭超净工作台和生物安全柜，以过氧乙酸或爱尔施消毒液擦拭工作台面和四壁、地板，以75%医用酒精擦拭各种仪器表面。

将CO2培养箱底部的水抽干，用75%医用酒精擦拭CO2培养箱内壁和搁板，更换无菌的蒸馏水。

详细操作见《洁净区卫生清洁消毒规程》。

6.细胞培养室的各种仪器设备：

包括CO2培养箱、超净工作台和生物安全柜、低温离心机、倒置显微镜，冰箱等。

在使用前要对各种仪器的操作、清洁、保养制定规程，并反复地学习掌握这些规程，才能熟练地操作使用这些仪器设备。

细胞培养室的各种仪器设备的摆放要合理，有利于防止污染，方便实验。

如超净工作台或生物安全柜要摆放在细胞培养室远离门的地方，以免人员进出产生的空气流动会对超净工作台或生物安全柜内开放的细胞培养造成污染。

CO2钢瓶的压力表要定期记录，一旦气体压力不足，要及时更换。

要经常观察和记录CO2培养箱显示屏中的温度、C02浓度值，发现异常及时报告及修理。

超净工作台或生物安全柜使用一定时期后，根据产品说明书的要求，要及时更换空气滤芯。

参照《设备操作保养及清洁规程》中相应设备的操作、保养和清洁规程进行。

7.进出细胞培养室的要求：

细胞培养室对进出的人员要进行严格的规范。

在进入细胞培养室之前，要洗手，带上一次性口罩和帽子。

进入更衣室内，换拖鞋，更换专门的无菌衣，才能进入细胞培养室。

操作结束后，离开细胞培养室时，要对细胞培养室进行清扫，将细胞培养间的物品摆放整齐，以75%医用酒精擦拭工作台面和各种仪器表面，将实验用过的耗材、废液等物品带出细胞培养间。

第二部分细胞模型建立的试剂和耗材准备

一、材料和试剂的准备

根据实验要求，培养细胞种类对细胞模型建立进行材料和和试剂准备，主要参见《贴壁细胞冻存复苏、传代操作规程》和《悬浮细胞冻存复苏、传代操作规程》

二、细胞培养材料的清洗与灭菌

清洗与消毒是细胞（或组织）培养实验的第一步，是细胞（组织）培养中工作量最大，也是最基本的步骤。

体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。

细胞生长好坏与清洗有很大关系。

清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。

如有毒的化学物质，哪怕残留痕量，也能影响细胞生长。

灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。

假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也受到影响。

（一）清洗

1.新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸中，以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。

2.使用过的玻璃器皿的清洗

（1）使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。

（2）用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗内外7遍，倒置自然干燥。

（3）浸入清洁液（清洁液配制见附件）过夜。

（4）从清洁液捞出后自来水冲洗10～15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。

（5）包装（牛皮纸或吸管、平皿消毒不锈钢桶），外套包布，标明消毒日期。

（6）高压（15磅20min）或干热（160～180℃2h）灭菌。

（7）贮存备用，有效期15天。

3.胶塞的处理

（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2％NaOH煮沸10-20min。

（2）自来水清洗10次。

（3）再用1％稀盐酸浸泡30min。

（4）自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。

晾干，高压灭菌（见消毒与灭菌）。

旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，蒸馏水洗涤3次，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。

（二）灭菌

本节能独立掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。

1.高压蒸汽消毒：

高压蒸气灭菌法：

用高温加高压灭菌，不仅可杀死一般的细菌，对细菌芽胞也有杀灭效果，是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法。

主要用于能耐高温的物品，如金属器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡胶及一些药物的灭菌。

灭菌条件要求：

蒸气压力205.8kPa（2.1kg/cm2），温度达132℃以上并维持10分钟，即可杀死包括具有顽强抵抗力的细菌芽胞在内的一切微生物。

高压蒸汽要求：

①包裹不应过大、过紧，一般应小于30cm×30cm×50cm；②高压锅内的包裹之间不要排得太紧密，以免妨碍蒸气透入，影响灭菌效果；③压力、温度和时间达到要求时,指示带上和化学指示剂即应出现已灭菌的色泽或状态；④易燃，易爆物品，如碘仿，苯类等，禁用高压蒸气灭菌；⑤锐性器械，如刀、剪不宜用此法反复灭菌，以免变钝；⑥瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口；如有橡皮塞时，应插入针头排气；⑦应有专人负责，每次灭菌前，应检查安全阀的性能，以防压力过高发生爆炸，保证安全使用；⑧注明灭菌日期和物品保存时限，一般可保存l～2周。

高压蒸汽的物品含有一定的水分和蒸汽，因此需要在一定温度下进行烤干。

我们将高压灭菌后的物品放入干烤

箱中烤干，温度50℃～80℃5h。

2.干烤消毒：

该法利用热辐射和灭菌器内空气的对流来传递热量而使细菌的繁殖体因体内脱水而停止活动的一种方法。

由于干热空气的穿透力弱且不均匀、比热小、导热性差，故需时间长、温度高，才能达到灭菌目的。

一般需135-145℃/3-5小时、160-170℃/2-4小时、180-200℃/0.5-1小时；热原经250℃/30分钟或200℃/45分钟，可破坏。

本法适用于耐高温的玻璃、金属等用具，以及不允许湿气穿透的油脂类和耐高温的粉末化学药品如油、蜡及滑石粉等，但不适用橡胶、塑料及大部分药品。

如安瓿、输液瓶、西林瓶及注射用油宜用干热空气灭菌法灭菌。

3.紫外线消毒

杀毒机制

紫外线主要是通过对微生物（细菌、病毒、芽孢等病原体）的辐射损伤和破坏核酸的功能杀死微生物的，从而达到消毒的目的。

紫外线对核酸的作用可导致键和链的断裂、股间交联和形成光化产物等，从而改变了DNA的生物活性，使微生物自身不能复制，而产生致死性损伤。

要求用于消毒的紫外线灯在电压为220V、环境相对湿度为60%、温度为20℃时，253.7nm紫外线辐射强度不得低于7ouW/cm2（普通30W直管紫外线灯在距灯管1米处测定）。

使用方法

杀灭一般细菌繁殖体时，应使照射剂量达到10000uW.s/CM2；杀灭细菌芽胞时应达到100000uW.s/CM2；病毒对紫外线的抵抗力介于细菌繁殖体和芽胞之间；真菌孢子的抵抗力比细菌芽胞更强，有时需要照射应达到600000uW.s/CM2；在消毒的目标微生物不详时，照射剂量不应低于100000uW.s/CM2。

辐照剂量是所用紫外线灯在照射物品表面处的辐照强度和照射时间的乘积。

因此，根据紫外线光源的辐照强度，可以计算出需要照射的时间。

例如，用辐照强度为70uW/CM2的紫外线表面消毒器近距离照射物品表面；选择的辐照剂量是100000uW.s/CM2；

则需照射的时间是：

100000uW.s/CM2÷70uW/CM2=24分钟。

对室内空气的消毒

（1）间接照射法：

首选高强度紫外线空气消毒器，不仅消毒效果可靠，而且可在室内有人活动时使用，一般消毒30min即可达到消毒合格

（2）直接照射法：

在室内无人条件下，可采取紫外线灯悬吊式或移动式直接照射。

采用室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外线消毒灯（30W紫外线灯，在1.0米处的强度>70uW/cm2）的数量为平均每立方米不少于1.5W照射时间不少于30min。

注意事项

（1）在使用过程中，应保持紫外线灯表面的清洁，一般每两周用酒精棉球擦拭一次，发现灯管表面有灰尘、油污时，应随时擦拭。

（2）用紫外线灯消毒室内空气时。

房间内应保持清洁于燥，减少尘埃和水雾，温度低于20℃或高于40℃，相对湿℃大于60%时应适当延长照射时间。

（3）用紫外线消毒物品表面时，应使照射表面受到紫外线的直接照射，且应达到足够的照射剂量。

（4）不得使紫外线光源照射到人，以免引起损伤。

（5）紫外线强度计至少一年标定一次。

4.滤过除菌

用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的除菌。

采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。

滤器型号按直径大小划分。

如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90mm、100mm、142mm……等），配以过滤泵使用。

过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20mm、25mm等）。

滤膜孔径有0．60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.1μm等，以0.22μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。

①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0.22μm。

②用布包好，湿热灭菌后使用。

5．化学消毒法（配制方法见附件10）

常用的消毒液有如下几种：

（1）70％（或75％）酒精：

超净台里常备70％酒精（卫生级酒精）和纱布，用于手和一些金属器械、电动移液器或工作台面的消毒。

（2）0.1％新洁尔灭：

主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。

超净台旁应常备盛有0.1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。

（3）来苏儿水（煤酚皂溶液）：

主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。

使用浓度请按瓶上说明。

现在已经很少使用这类消毒剂。

（4）0.5％过氧乙酸：

是强效消毒剂，10min即可将芽孢菌杀死。

用于各种物品的表面消毒，用喷洒和擦拭方式进行。

（5）乳酸蒸气：

将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。

将门窗紧闭1～3d。

可将空气中漂浮的微生物杀死。

（6）37％甲醛加高锰酸钾：

使用前先紧闭门窗。

将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。

用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。

1～3d后方可达到消毒空气的目的。

6．煮沸消毒

急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。

清洗消毒注意事项

1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10～15次。

因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。

清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。

千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。

Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。

如没有洗净会影响下一次使用的效果。

2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。

当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。

器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能打开烤箱门。

金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。

3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装潮湿发霉。

4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压（除菌方法见附件9）。

5．除菌过滤

滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高压灭菌后才能使用。

滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。

过滤时压力不宜过大。

压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。

装滤膜时位置要准确。

另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。

6．化学消毒剂

使用化学消毒法时，配制70%-75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。

来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。

空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。

因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。

三、试剂的准备

（一）诱导细胞模型药物储液的配制及原则

详细阅读药物说明书，熟悉药物的溶解度和溶剂，掌握最大溶解度和储存温度和药物溶解前后的有效期。

如果药物包装小于或等于5mg，不进行电子天平的称重，直接在无菌条件下用相应的溶剂溶解，其原则：

（1）配制药物储存液时，既要考虑药物实验浓度的要求、可稀释性和可取体积的准确性，还要考虑药物最大溶解度，以利于溶解后的药物保存时间更长。

一般情况下，药物储存液浓度越大其保存时间就越长。

（2）根据说明书选择药物的溶剂，如果可供选择的溶剂有多种，最好选择水溶剂（可用0.22μm滤器除菌后分装），其次是不容易挥发性的溶剂，再其次对细胞毒性小的溶剂。

（3）配制药物储存液时，要在生物安全柜或净化工作台中进行溶解和分装。

有些药物溶解较慢，要等待药物溶液澄清才认定为充分溶解

（4）药物包装比较大，需要称量部分药物，请严格按照《BT224S型Sartorius电子分析天平称量微量药品的操作规程》执行。

（5）药物在运输过程中，使得部分药粉黏贴在包装瓶壁或盖上，在加入溶剂溶解时，充分考虑到这些问题，以保证药物浓度的准确性。

（6）要根据预实验和正式试验的药物需要量，进行药物储存液的分装，一般略多于实际应用量。

如一次实验用药物储存液10μl，分装时，每管至少要分装体积12μl.。

（7）每次试验如果有剩余的药物储存液，应根据药物物理化学特性，决定是否可再次使用。

一般情况下不能再次冻融。

所以实验后剩余的药物储存液一般应该弃掉。

（8）严格药物要求的保存温度和有效期，实验用药物储存液一定在药物有效期内使用，超过有效期的诱导剂或干预药物储存液绝不再用。

（9）药物分装后，都要包裹锡箔纸以避光保存。

在锡箔纸外包裹标签，标明药物名称，摩尔浓度，分装日期和分装的体积/管。

（10）配制药物储存液的量要根据实验的次数，用量的要求配制，以免实验结束还有很多药物没有用完，造成浪费。

也要避免配制的药物储存液不够，而造成实验中途配制药物储存液，而造成批次实验的条件不一致。

（11）实验加药时，防止药物溶剂的挥发。

因此，要尽可能在准确吸取药物同时，缩短取药时间，并在每次取药液后及时盖严瓶盖。

（12）实验加药取药原则按照《微量加样器使用一般原则》执行，见附件7。

（二）药物浓度的计算和换算方法

实验工作中，试剂配制是一项重要内容。

工作人员必须熟练掌握配制方法、规程和要领；对于某些常用特殊试剂，也应了解试剂的理化性质、实验中的反应原理和配成后的质量性能，然后按照操作规程认真配制。

不正规的配制方法，常有很大的误差，如出现混浊、沉淀、变色而失效或者配制中途失效，甚至有时还发生危险事故。

特别是实验室的基准溶液、标准试剂等，如配制不当，则导致试验结果的系统误差。

常用溶液浓度公式及配制（见附件11）

1.常用试剂的配制方法

（1）标准溶液凡是用来配制标准溶液的物质必须具备以下条件：

①易于制纯、烘干，应符合GR或AR品级者。

②易于保存，配制后的溶液浓度稳定不变。

③使用中能按反应方程式所表示的结果进行，不得有副反应发生。

配制标准溶液时，取符合以上条件的物质，进行恒重后，直接称取规定的重量溶解在定量的溶剂中使用。

（2）一般溶液：

凡不是标准溶液，又不要求严格控制浓度的试剂，可直接配制。

根据要求可用实验天平，扭力天平，分析天平称重，玻璃量器可用量筒或容量瓶。

2．间接配制法

有些不易恒重的固体或含量不准的液体试剂，在需要配成浓度准确的标准溶液时，可采用间接配制法，即先配成近似浓度的溶液，再用标准液标定其准确的浓度。

如酸碱溶液、高锰酸钾溶液、硫代硫酸钠溶液的配制等。

3.常用试剂配制的要点

（1）以固体溶质配制试剂，一般都用称重法。

首先选取合格的溶质，必要时先进行烘烤处理。

然后在分析天平上称取规定的重量（配制标准溶液，十万分之一天平最小称重显示值0.1mg），放在洁净的烧杯中，加入适量溶剂溶解，如果溶质较难溶，可适当加热助溶；如果试剂为有机溶剂，欲加热助溶则需隔水加热。

待完全溶解置室温待冷，倒入容量瓶中，然后以溶剂补至接近刻度，待冷至20℃，再以溶剂补足至刻度，混合均匀，倒入试剂瓶中加塞保存备用，如果称量溶质量较小（mg），严格按照《BT224S型Sartorius电子分析天平称量微量药品的操作规程》执行。

（2）以流体溶质配制试剂，除特殊要求外，一般均用容量法，先取适量溶剂（约全量的一半）放入烧杯中，再量取规定量的溶质，并缓缓加入溶剂内，必要时需边加边搅拌均匀，然后倒入容量瓶内，再以溶剂补足至刻度，混合均匀，倒入试剂瓶中，密塞保存备用。

（3）某些试剂在配制过程中产生高热，配制时应缓缓操作，并且不断搅拌，必要时需设法降温。

配制成以后放室温冷却，待温度降到20℃左右，再倒入容量瓶，以溶剂补足至刻度，然后倒入试剂瓶保存备用。

（4）对于一些在配制过程中产生一系列化学反应的试剂，必须首先了解它的反应原理（目的），掌握它的关键要领，并严格按照操作规程进行操作，才能取得满意结果。

第三部分细胞培养操作技术

细胞培养技术是细胞模型建立的关键技术，为更好的操作细胞，我们对常用的细胞分别撰写了细胞的冻存，复苏和传代的操作规程，有关特殊细胞应用的培养体系谨遵所用细胞的冻存，复苏和传代操作规程执行。

一、贴壁细胞系的传代和培养

（一）传代前准备：

1.预热培养用液：

把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热；

2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台面及四壁和双手。

3.正确摆放使用的器械：

保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

4.点燃酒精灯或红外灭菌器：

如果用酒精灯，注意火焰不能太小（不得小于1公分高度）

5.取出已经预热好的培养用液，用75%酒精纱布擦拭后方能

放入超净台内。

6.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精纱布擦拭显微镜的台面，再观察细胞。

7.将各瓶口一一打开，同时将瓶口在酒精灯火上或红外灭菌器灼烧消毒。

（二）胰蛋白酶消化；

1.选择融合率长达80%左右的细胞进行传代；

先用PBS洗2次；加入消化液：

小心吸出培养液，并移入到一50ml锥形离心管中，用PBS清洗（25cm2培养瓶用5ml冲洗，75cm2培养瓶用10ml冲洗），洗掉更多的血清，用滴管将PBS洗液移入同一50ml锥形离心管中（注意吸净PBS），加入适量0.25%胰蛋白酶消化液（25cm2培养瓶用1ml，75cm2培养瓶用2ml），注意消化液要全部覆盖单层细胞，置37℃培养箱中消化。

2.显微镜下观察细胞：

倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度（一般3～5min）。

3.将50ml锥形离心管中的培养液加入培养瓶中，终止消化。

4.用弯头滴管将细胞吹打成单个细胞悬液。

5.将细胞悬液移入50ml离心管中。

6.离心1500转/分钟离心5分钟。

7.弃去上清液，轻叩管底，使细胞松散，加入10ml10%小牛血清1640，用滴管轻轻吹打细胞制成单细胞悬。

（三）传代细胞：

1.取100μl左右体积的细胞悬液，行台盼蓝拒染计数。

根据细胞操作规程要求的细胞传代密度传代细胞。

2.注意密度过小会影响传代细胞的生长。

最后要做好标记。

3.用酒精纱布擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。

传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。

注：

有的细胞需要胰蛋白酶与EDTA混合消化。

EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。

EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方见附件1。

二、悬浮细胞系的传代和培养

（一）传代前准备：

1.预热培养用液：

把已经配制好的装有培养液、PBS液放入37℃水浴锅内预热。

2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台面及四壁和双手。

3.正确摆放使用的器械：

保证足够的操作空间，不仅便于操作而且

减少污染。

4.点燃酒精灯或红外灭菌器，红外灭菌器使用按《HOPE-MED 8073A型 红外线灭菌器操作规程》执行。

如果使用酒精灯，注意火焰不能太小（不得小于1公分高度）。

5.取出已经预热好的培养用液，用75%酒精纱布擦拭后方能放入超净台内。

6.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精纱布擦拭显微镜的台面，再观察细胞。

7.将各瓶口一一打开，同时将瓶口在酒精灯火上或红外灭菌器灼烧消毒。

（二）观察

1.肉眼观察：

培养基浅黄色，澄清透明，此时需要半换液或全换液。

如果培养基为其它颜色则细胞生长不是很好（见附件13.（细胞生长状态及形态学特征观察）表7.2/2表注的描述）。

2.显微镜下观察细胞：

倒置显微镜下观察细胞的生长状态，细胞折光性好，细胞大小基本一致，细胞质均匀细腻，无粗大颗粒。

细胞膜完整无固缩。

细胞均匀分布或呈簇和较大团块（如葡萄样）悬浮生长，根据细胞来源及细胞株特点呈现均匀悬浮、呈簇悬浮和团块悬浮生长特性。

3.将细胞悬液用10ml刻度吸管转移至50ml锥形离心管中。

4.离心1500转/分钟离心5分钟室温。

5.将上清倒入废液缸中，此步骤，不要甩弃动作，只做2～3秒钟的停留，翻转管，轻叩管底，使细胞松散，准确加入无血清RPMI-1640，用滴管轻轻吹打细胞制成单细胞悬液。

取100μl左右体积的细胞悬液后，立即在加入的无血清培养基中添加小牛血清，使成10%小牛血清RPMI-1640培养基重悬的细胞悬液。

（三）传代细胞：

1.取100μl左右体积的细胞悬液，行台盼蓝拒染计数。

根据各细胞冻存，复苏和传代操作规程要求的传代密度传代细胞。

如果现培养的细胞没有建立冻存，复苏和传代