异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠影响.docx

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异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠影响

异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠的影响

南方医科大学级硕士学位论文

异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠的影响●■●●

●●课题来源:

国家重点基础研究规划项目

编号:

国家自然科学基金青年面上项目

编号:

业称

专名人体解剖与组织胚胎学

学位申请人

指导教师

答辩委员会主席汪华侨教授

.

答辩委员会成员徐杰教授

何宏文教授

郭国庆教授

贺振泉教授

黄泳教授

初国良

论文评阅人教授

安

靓教授

年月日广州质疏松大鼠的影响

硕士研究生:

陶晖

指导教师:

原林教授

摘要

背景

骨质疏松是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征,导致骨脆性增加和易

于骨折的代谢性疾病。

随着骨质疏松患者不断增多,研究如何有效预防和治疗

骨质疏松具有非常重要的临床价值。

原林教授提出的“筋膜学假说认为人体

是由尚未分化的非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该

支架支持与包绕的已分化为各种功能细胞构成的功能系统共同组成。

功能系统

是建立在各种功能细胞的专能特化的基础上,而支持与储备系统是以筋膜支架

中未分化的干细胞为核心。

支持与储备系统中未分化干细胞通过分化为各种定

向干细胞,能够为功能系统中各种功能细胞的更新提供源源不断的细胞源泉,

并为功能系统中各种功能细胞的代谢提供营养物质,维持内环境的稳定。

因此,

功能系统只有在支持与储备系统的支持下才能维持结构和功能的稳定,而一旦

某种功能细胞在代谢过程中不能及时得到新细胞的补充,机体就会出现相应的

病变。

骨质疏松正是由于骨组织吸收后,筋膜支架中未分化的干细胞未能充分

向成骨细胞分化骨形成不足而致的一种疾病。

因此,当骨代谢过程中出现负平

衡后,如何有效增加筋膜支架中尚未分化的千细胞,使成骨细胞得到有效的补

充促进骨形成重建正平衡是治疗骨质疏松的关键。

脂肪组织是支持与储备系统中重要组成部分,其中分离出的脂肪源干细胞

?

是筋膜支架中未分化干细胞的一种重要储摘要

备形式。

目前脂肪源干细胞的研究已成为干细胞研究的热点之一。

研究表明,

脂肪源干细胞易分离培养:

具有多种分化潜能,甚至能够跨胚层分化,在特定

的环境中可以诱导向成骨、成软骨、成脂、成肌和成神经等分化;具有低免疫

原性和免疫调节功能。

此外,与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相比,脂肪

源干细胞来源更加广泛,获得更加容易,并且给病人带来的创伤和痛苦更小。

这些特征均为脂肪源干细胞的异体移植提供了有利条件。

因此,通过增加机体

未分化的脂肪源干细胞,促进其向成骨分化,增加骨形成可能会对骨质疏松起

到预防和治疗作用。

利用糖皮质激素建立骨质疏松模型已成为比较成熟的模型。

长期给予大剂

量的糖皮质激素可以通过引起体内钙磷代谢的紊乱,甲状旁腺素分泌增加,骨

保护素分泌减少,成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细胞数量和活性增加等

多种途径使骨吸收增加,骨形成减少,最终导致骨质疏松。

为了探讨异体脂肪源干细胞移植对骨质疏松的预防和治疗作用,本实验通

过观察移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠钙磷代谢、骨密度、

骨生物力学及骨组织形态计量学等方面的影响进行综合评价,探索一种新的骨

质疏松治疗方法,为临床骨质疏松的预防和治疗提供新的研究思路。

目的

、分离培养脂肪源干细胞并对其多向分化能力和表面标志进行鉴定,以判

断支持与储备系统中是否含有未分化的脂肪源干细胞;

、通过骨密度检测判断长期给予糖皮质激素建立骨质疏松模型是否成功;

、通过血清钙、磷、碱性磷酸酶检测,观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激

素致骨质疏松大鼠骨钙磷代谢和骨形成的影响;

、通过对骨密度的检测观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大

鼠骨质量的影响;

、通过三点弯曲试验观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠

骨强度和骨刚度的影响;

Ⅱ硕士学位论文

、通过骨组织形态计量学观察观察异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质

疏松大鼠骨组织微环境的影响;

、为“筋膜学假说中“通过动员支持与储备系统中未分化干细胞可以治

疗退行性和衰老性疾病’’提供部分实验依据。

方法

、取成年大鼠腹股沟皮下脂肪垫,胶原酶消化分离培养筋膜结缔组织中脂

肪源干细胞。

传至第代时,分别通过形态学、成脂成骨诱导分化及利用流式

细胞术对表面抗原、、、、和进行鉴定,

判断所培养的细胞是否为具有多向分化潜能的脂肪源干细胞。

、只雌性大鼠随机分成空白对照组组、模型组组、治

疗组和治疗对照组组。

、和组分别给予颈背部皮下注射醋酸泼

尼松龙注射液/,次/周;组分别给予颈背部皮下注射生理盐水.,

次/周。

周后,将组和组处死取材,判断造模是否成功。

、待模型建立成功后,收集传至第代的脂肪源干细胞,经尾静脉向组

大鼠每只注射脂肪源干细胞个,组大鼠每只注射生理盐水,周

后处死取材。

、水合氯醛麻醉大鼠后,心脏取血促凝管接取,室温下放置后/

离心制备血清,.℃分装保存。

用全自动生化分析仪分别利用偶氮砷

法、磷钼酸比色法和速率法测定血清中钙、磷和碱性磷酸酶的含量。

取血完毕

后,心脏放血处死,分别取出大鼠第三至第五腰椎和双侧股骨,去除周围肌肉

组织。

腰椎和右侧股骨利用双能线骨密度仪小动物测量软件测定骨密度值。

左侧股骨利用生物材料动态力学试验机进行三点弯曲实验,股骨背侧向

上,腹侧向下,跨距为,速率为./,股骨压断时记录最大载荷和

刚度值。

、处死后取出右侧胫骨上/部分,手术刀片矢状面剖开,固定后酒精逐

级脱水,分别浸入浸液甲基丙烯酸甲酯邻苯二甲酸二丁酯、浸

摘要

浸液过氧化苯甲酰和浸液浸液过氧化苯甲酰.各,

.

重型切骨机连续切取厚度切片,

新鲜配制的浸液进行包埋。

进行组织学观察染色和类骨质观察染色。

测量区

生长板下至范围内,采用

多功能彩色病理图像分析

进行骨组织形态计量学分析。

具体参数包括骨小梁相对体积厂Ⅳ、骨

厚度.、骨小梁数量.和骨小梁分离度.和单位骨小

梁破骨细胞数.,均采用国际通用的公式进行计算。

结果

、经光学显微镜观察,原代培养的后大部分可贴壁,细胞呈圆

形、多边形或者梭形。

细胞长势良好,后可按:

传代,之后每可传代

一次。

经换液传代至第代,可见细胞形态均一,呈纺锤形或者多角形。

体外

诱导可以向成脂、成骨分化。

流式细胞术检测发现和呈强阳性,

呈弱阳性,、和呈阴性。

、长期大剂量给予糖皮质激素后,与空白对照组比较,模型组大鼠血清钙

和碱性磷酸酶水平、骨密度、骨强度和骨刚度均显著降低,而血清磷水平显著

上升氏.;骨小梁变细、变薄,骨小梁排列紊乱,骨小梁间出现断裂,间

距增大,出现陷窝;骨小梁的数量、相对体积和厚度均显著降低,而骨小梁的

分离度增高,单位骨小梁破骨细胞数增多尸.。

、异体移植脂肪源干细胞后,与模型组比较,治疗组大鼠血清钙和碱性磷

酸酶水平、骨密度、骨强度和骨刚度均显著增加,而血清磷水平显著降低

尸.;骨小梁数目增多,骨小梁变厚变粗,骨小梁间出现连接,陷窝减少;

骨小梁的数量、相当体积和厚度显著增加,而骨小梁分离度显著降低,单位骨

小梁破骨细胞数减少尸..。

结论

、支持与储备系统中含有脂肪源干细胞,并且这种干细胞是一种未分化的

间充质干细胞;

硕士学位论文

、长期给予大剂量的糖皮质激素可以建立骨质疏松模型;

、通过异体脂肪源干细胞移植可以有效改善体内钙磷代谢,增加骨形成,

有效预防和治疗骨质疏松,为临床上骨质疏松的研究和治疗提供了一种新的研

究思路和方法;

、对“筋膜学假说”中“通过动员筋膜结缔组织中储备的未分化干细胞可

以治疗退行性疾病”提供了部分实验依据。

综上所述,移植异体脂肪源干细胞对糖皮质激素致骨质疏松大鼠有一定的

治疗作用,能够促进骨形成,增加骨密度,改善骨生物力学性能,增强骨强度,

降低骨折发生率。

本实验进一步提示在骨质疏松的研究中应该更加关注提高机

体干细胞的数量和促进干细胞向成骨细胞分化及骨组织的形成方面,为临床上

治疗骨质疏松提供了一种新的研究思路。

关键词:

筋膜学脂肪源干细胞骨质疏松糖皮质激素骨密度三点弯嗌试验骨组织

形态计量学

硕士学位论文●●●●

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第一章脂肪源千细胞的分离培养及鉴定材料和方法?

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结果?

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讨论.....................。

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参考文献?

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附图?

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第二章

脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨密度的

影响.:

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材料和方法?

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结果?

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第三章异体脂肪源干细胞移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠骨组

织微结构的影响?

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材料与方法结果?

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参考文献

附图?

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文小结?

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英文对照缩略词表木?

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位论文原创性声明?

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计学合格证明?

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一

刚吾

骨质疏松,是一种以骨组织的微细结构受到破坏,骨强度

包括骨质量和骨密度降低为主要特征,导致骨脆性增加以及易至骨折的全

身代谢性骨疾病【】。

伴随着人类社会的不断进步,人类寿命的不断延长,骨质疏

松症的发病率也越来越高。

目前,已经把骨质疏松症列为中老年三大疾病

之一,在常见病中居第位。

根据我国“九五’’攻关课题对我国五大行政区的

流行病学调查发现:

在岁以上人群中,骨质疏松症及低骨量的患病率女性分

别为.%和.%,男性分别为.%和.%。

岁以上人群的骨质疏松症

及低骨量患病率:

女性分别为.%和.%,男性分别为%和.%。

据

估计,我国目前患者已达到万~万例乜。

由此可见,骨质疏松已经

严重危害人类的健康,寻找行之有效的预防和治疗骨质疏松症的办法已经迫在

眉睫。

目前,骨质疏松的预防和治疗主要以药物为主,如雌激素、选择性雌激素

受体调节剂、降钙素、二磷酸盐、甲状旁腺素、钙剂和中药等∞。

虽然这些方

法对骨质疏松的治疗和预防能够取得一定的疗效,但同时也会给患者带来不同

程度的副作用峨,这也限制了这些药物的使用。

近年来,原林教授【。

通过对人体结缔组织支架进行发育生物学和生物进化

起源的追踪朔源,发现在个体发育的过程中由中胚层间充质分化成多个器官系

统后所遗留的部分形成了遍布全身的结缔组织筋膜支架。

在生物进化的过程中,

该支架与单胚层生物的细胞外基质、二胚层生物的中胶层、三胚层生物的间充

质甚至与人体非特异性结缔组织为同源结构。

生物在进化的过程中通过结缔组

织的不断完善细胞外基质一中胶层一间充质一非特异性结缔组织,形成了一

套完善的生物机体的支持和储备系统。

人体非特异性结缔组织支架为已分化的

组织细胞提供支持和支撑作用,并为这些功能细胞的修复和再生提供细胞储备

和生存的环境。

从动态的角度活的人体是在不断的更新过程中维持平衡?

?

生存,提出了人体新的解剖学分科方法:

人体结构的两系统理论一人体是由前言

全身的非特异性结缔组织筋膜支架构成的支持与储备系统和被该筋膜

支持和包绕的各种功能细胞构成的功能系统共同组成。

其中支持与储备系统是以未分化的干细胞为核心,能够为各种功能细胞的

和代谢提供源源不断的细胞源泉和营养物质,功能细胞只有在支持与储备

的支持下才能维持结构和功能的稳定。

而一旦某种功能细胞在机体代谢过

程中不能及时得到支持与储备系统中未分化干细胞的补充,机体就会出现相应

的病变。

从筋膜学角度看,骨质疏松正是由于骨代谢过程中骨组织吸收后,筋

膜支架中储备的未分化干细胞未能充分向成骨细胞分化,骨形成不足而导致的

一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征的代谢性疾病。

因此,如何有效增加筋

膜支架中尚未分化的干细胞,使成骨细胞得到有效的补充促进骨形成,纠正骨

代谢的负平衡使之转为正平衡是治疗骨质疏松的关键。

.

随着人们对骨髓间充质干细胞干细胞,

的不断研究,发现具有多向分化能力卜例,体内体外均可以向

成骨方向诱导¨嗣,这一特性为利用治疗骨质疏松症提供了可能。

等首次报道通过尾静脉注射通过和基因转染的骨髓间充质干

细胞治疗糖皮质激素致骨质疏松的大鼠,周后发现不仅有部分新骨形成,并且

骨量和骨强度恢复至正常水平。

这一研究为骨质疏松的治疗提供了一种新的途

径。

是支持与储备系统中

脂肪源性干细胞.

未分化干细胞的一种主要细胞储备成分”。

年,等羽首次将利用吸脂术

获得的人脂肪组织分离纯化后获得了一种可以在体外稳定增殖,并具有多向分

化能力的脂肪组织提取细胞。

目前已有研究证实:

是一种能够自我更新,

并具有多种分化潜能的新型干细胞蝴。

在一定的诱导条件下,可以分化

为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和

神经细胞等呦一。

同时它还具有低免疫原性、免疫抑制和免疫调节功能蚴。

这

些特征均为的异体移植提供了有利条件。

此外,与相比,

具有来源更加广泛、取材更加容易、创伤更小及给患者带来的痛苦更小等特点。

硕士学位论文

因此,具有较好的临床应用可行性乜引。

糖皮质激素是临床较为常用的药物,但长期使用会导致骨量的丢失而引起

糖皮质激素性骨质疏松.,阱。

因此,

通过长期给予大剂量糖皮质激素可以建立骨质疏松模型。

现在已经有大量的研

究乜时表明:

长期给予大剂量的糖皮质激素可以引起体内钙磷代谢的紊乱,甲状

旁腺素分泌增加,骨保护素分泌减少,成骨细胞增殖和活性受到抑制而破骨细

胞活性增加等多种途径使骨吸收增加,使大鼠骨密度降低,骨强度改变,最终

导致骨质疏松。

综上所述,本课题就是基于筋膜学理论,通过糖皮质激素的建模方法,利

用取材容易、来源充足、低免疫性和体内外均可以向成骨细胞分化等特

点,研究异体移植对糖皮质激素致骨质疏松大鼠血清钙磷代谢、骨密度、

骨生物力学及骨组织形态学的影响,为骨质疏松的治疗提供一种新的治疗方法,

也为筋膜学理论提供部分实验依据。

参考文献,,

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】薛延.骨质疏松症?

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骨质疏松症的流行病学概况【】.新医学.,:

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原林,王军,王春雷,等.人体内新的功能系统~支持储备及自体监控系统

新学说明.科技导报.,:

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硕士学位论文

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解剖学报.,:

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杂志.,:

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第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定

第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定

是目前研究的热点之一。

它是

间充质干细胞

干细胞的一种,具有自我更新和多向分化的潜能,在再生医学中有重要的

价值【】。

目前研究发现可以从多种组织中分离出间充质干细胞,如骨髓、脐

、外周血及脂肪等。

在众多间充质干细胞当中研究较为深入的是骨髓间

干细胞,在特定的条件下可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪组织及神经细

分化,是目前使用较为广泛的一种种子细胞,并取得了一定效果。

近年来,

的研究不断深入,发

随着对脂肪源干细胞.

现易分离培养【】,可以多向分化甚至跨胚层分化【,低免疫原性、免疫

调节和免疫抑制等特点【引,这些均为的异体移植提供了有利条件。

此外,

与骨髓间充质干细胞相比,来源更加广泛、取材更加容易、给病人带来

的创伤和痛苦更小【,】。

因此,作为种子细胞治疗疾病具有更广阔的前

景【。

原林教授提出的筋膜学理论【,将人体分为两个系统,即由遍布全身的非

特异性结缔组织支架构成的支持与储备系统和被该筋膜支架支持与包绕的各种

功能细胞构成的功能系统共同组成。

间充质干细胞的多组织来源,与筋膜支架

的全身分布是一致的。

其横向和纵向分化的特性亦与筋膜学中筋膜支架能够为

功能系统提供支持与储备作用相符合。

其中是筋膜支架中储备的未分化

干细胞的主要细胞成分【。

本实验,取腹股沟皮下脂肪垫进行分离培养,通过其形态学、成脂

成骨分化能力及细胞表型,从多方面对其进行鉴定。

材料和方法

.实验动物:

周龄大鼠,雌性,,由南方医科大学实验动物中心提供,许可证

号:

粤.。

硕士学位论文

公司,美国

公司,美国

青霉素

公司,美国

链霉素

公司,美国

胎牛血清

公司,美国

型胶原酶

公司,美国

、

公司,美国

胰蛋白酶

公司,美国

粉

公司,美国

公司,美国

’液

威佳公司,中国

’液

威佳公司,中国

地塞米松

公司,美国

异丁基甲基黄嘌呤

公司,美国

吲哚美辛

公司,美国

胰岛素

公司,美国

油红

公司,美国

.甘油磷酸钠

公司,美国

.抗坏血酸维生素

公司,美国

茜素红

威佳公司,中国

小鼠单克隆抗大鼠

公司,美国

小鼠单克隆抗大鼠

公司,美国

小鼠单克隆抗大鼠

公司,美国

小鼠单克隆抗大鼠

公司,美国

第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定

小鼠单克隆抗大鼠

公司,美国

小鼠单克隆抗大鼠

公司,美国

培养瓶

公司,美国

超净工作台

公司,日本

二氧化碳培养箱公司,德国

.低温离心机

公司,美国

电热恒温水浴槽森信,中国

微量移液器

公司,德国

.倒置相差显微镜

公司,日本

流式细胞仪

公司,美国

数码相机

公司,日本

.主要用液的配制

基础培养基的配制

.

.

青霉素万

链霉素万

四蒸水

将配制所需成分加入四蒸水后,磁力棒搅拌充分溶解后,用微孔滤膜正

压抽滤器内置张①.滤膜抽滤后,用无菌盐水瓶分装,每瓶

装,密封冷藏保存。

试纸检测培养基值,调整培养基值在...

之间。

在使用前,每瓶液中加入胎牛血清配制成含有%的

完全培养基。

液的配制

.

.

四蒸水

硕士学位论文

将配制所需成分加入四蒸水充分溶解后,用.%调整值至.

左右,高压蒸汽灭菌,每瓶分装保存。

.%型胶原酶配制

胶原酶.

正压抽滤消毒,每瓶分装℃保存。

.%胰酶消化液的配制

胰蛋白酶

.’液

正压抽滤消毒,。

保存。

成脂培养基的配制

完全培养基

地塞米松.

.

一甲基..异丙基.黄嘌呤

维生素

成骨培养基的配制

完全培养基

地塞米松

.

一甘油磷酸钠

维生素

油红存储液的配制

油红干粉.

异丙醇

充分溶解后,棕色瓶保存。

在使用前稀释油红储存液油红:

去离子水

:

滤纸过滤,室温放置后即可使用,稀释后以内使用。

.%茜素红溶液

第一章脂肪源干细胞的分离培养及鉴定

茜素红

蒸馏水

充分溶解后,用%氢氧化胺调整其值至.,棕色瓶避光保存。

%水合氯醛麻醉剂

水合氯醛

去离子水

.实验方法

..

的分离培养‘】

周龄雌性大鼠,%水合氯醛/体质量腹腔内注射致全身麻

醉后,无菌条件下剪取腹股沟部皮下脂肪垫,去除肉眼可见的小血管。

液

冲洗次以去除红细胞,眼科剪剪碎至衄大小。

加入倍体积的.%型

胶原酶,搅拌混匀,下间断震荡消化。

用等体积的含%胎牛血清的

高糖中和,/离心,去除上清,再用含%胎牛血清的高

/的密度

糖重悬细胞,目筛网过滤,四格计数板计数后以

接种于培养瓶中,。

放置于℃、%培养箱中培养。

后首次换液,

之后每.换液次,待长满融合至瓶底%时用.%胰蛋白酶/.%

消化后以:

进行传代,倒置相差显微镜下观察照相。

..的成脂诱导分化及鉴赳】

/

待第代培养至%以上融合时,常规消化收集细胞,以

的密度接种于孔板中,常规加入完全培养基。

后,待细胞贴壁良好,进行

换液。

其中孔加入成脂诱导液,其余孔加入完全培养基作为对照。

之后每

.换液一次。

周后吸尽培养基,漂洗,次。

然后用%多聚甲醛室温固定

弃固定液,冲洗次,%异丙醇冲洗。

最后将每个孔各加入

稀释的油红工作液,加盖。

室温放置后,弃染液。

%异丙醇分色至

背景无色后,.

充分冲洗,倒置显微镜下观察脂质沉积并拍照。

..

的成骨诱导分化及鉴定‘,羽

硕士学位论文

/

待第代培养至%以上融合时,常规消化收集细胞,以

的密度接种于孔板中,常规加入完全培养基。

后,待细胞贴壁良好,进行

换液。

其中孔加入成骨诱导液,其余孔加入完全培养基作为对照。

之后每

.换液一次。

后用茜素红染色检测矿化结节。

首先,弃培养基,加入液漂洗

次,分钟/次。

然后,用%多聚甲醛室温固定,弃